CN104542285A - 一种大花萱草叶片组织培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大花萱草叶片组织培养的方法，其具体步骤为，以大花萱草露地生长的幼嫩内层叶片为外植体，经过消毒处理，接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织，经愈伤组织分化增殖、芽诱导和生根诱导，形成大花萱草完整小苗，将大花萱草小苗移栽到基质中，长成正常的大花萱草植株。本发明应用萱草叶片进行组织培养，克服了萱草只能在花期采用花部器官进行组织培养扩繁的限制，可实现周年繁殖，有利于进行良种快繁，丰富园林应用中萱草的种类。

Description

一种大花萱草叶片组织培养的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及露地生长的大花萱草幼嫩叶片组织培养扩繁的方法。

背景技术

大花萱草为萱草科萱草属多年生草本，是重要的宿根花卉，中国的萱草种质资源十分丰富，世界上发现该属共有14个种，中国就有11个种大花萱草。在野生萱草种质的基础上,经过人工杂交选育的大花萱草园艺栽培品种群，目前已经登陆的品种有8万多种。大花萱草叶翠绿狭长基生，呈带状排成两列，具纺锤状肉质根及须根。茎短根状，花苔从中部抽出，螺旋状聚伞花序，每个花絮可着花数十朵。花蕾似簪，开如漏斗，裂片翻卷，为百合形花冠，花瓣先端裂开。花被基部合生，呈筒状，雄蕊6枚，3长3短，花药呈丁字形背着在花丝顶端，花径变化大，花形各异，花期主要在夏季。

大花萱草是一种优良的园林作物。但是目前在园林应用中大花萱草的品种较少，主要原因是受繁殖的影响。园林应用中的大花萱草主要是通过组织培养方式来实现繁殖，组织培养常用的外植体有花葶、花瓣，子房、茎尖等，因此繁殖只能在花期，限制了新品种和优良品种的培育。而叶片取材不受花期影响，可以实现组织培养外植体取材时间的周年性，达到组培快繁的目的。因此如果可以用露地栽培的叶片作为外植体进行大花萱草的组织培养，实现萱草组织培养外植体取材时间的周年性，则有利于实现良种快繁，大大丰富园林中大花萱草的种类。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种利用大花萱草叶片进行组织培养快速繁苗的方法，实现萱草组织培养外植体取材时间的周年性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1)外植体的选择和消毒处理；

2)愈伤组织的诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基中，至形成愈伤组织，所述诱导培养基的配方为：MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤；

3)芽诱导：将所述愈伤组织接种到幼芽培养基中，培养至获得大花萱草的再生苗，所述幼芽培养基的配方为：MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤；

4)生根培养：将所述再生苗转入生根培养基中，至再生苗基部出现白色短根并长出完整根系，得到大花萱草小苗，所述生根培养基的配方为：1/2MS培养基中添加0.1mg/L萘乙酸、3％蔗糖、0.6％琼脂，所述1/2MS培养基为将MS培养基中的大量元素浓度减半；

5)植株移栽：将所述大花萱草小苗栽到栽培基质中，温室炼苗，获得大花萱草幼苗。

本发明中，所述外植体的选择具体为，选，择抽出新叶数量较多的大花萱草单株，截取茎尖以上叶龄较一致的幼嫩叶片即为所需的外植体，所述新叶为叶龄小于12天的叶子。

本发明中，所述消毒处理具体为，将外植体用流水冲洗3-5分钟，再用70％酒精表面灭菌20-30s，无菌水冲洗3-4次，然后用2％的NaClO浸泡10-15min，再用无菌水冲洗5-6次。

本发明中，所述愈伤组织的诱导的的步骤为：在超净工作台中将处理后的外植体用镊子撕成小方块，近轴面朝上接种于诱导培养基内；接种后在温度23-27℃，黑暗条件下培养。

本发明中，所述芽诱导的培养条件为：温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d。

本发明中，所述生根培养的条件为：温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养。

本发明中，所述大花萱草小苗是指完成了芽和根的分化，可以独立进行自养生长的幼小植株。

进一步的，提供本发明中萱草组织培养更具体的步骤如下：

1)外植体的选择和消毒处理：选择抽出新叶数量较多的大花萱草单株，截取茎尖以上叶龄较一致的幼嫩叶片，尽量保证外植体的一致性，将外植体以流水冲洗3-5分钟，再用70％酒精表面灭菌20-30s，无菌水冲洗三次，然后用2％的NaClO浸泡10-15min，再用无菌水冲洗5-6次；

2)愈伤组织的诱导：在超净工作台中将步骤1)中处理后的叶片用镊子撕成1cm×1cm大小的长方块，近轴面朝上接种于诱导培养基上，诱导培养基的配方为MS培养基中添加MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，接种后在温度25℃，黑暗条件下至叶片边缘出现愈伤组织；

3)芽诱导：将步骤2)中得到的愈伤组织接种到幼芽培养基中，幼芽培养基的配方为MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，接种后在温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养，至愈伤组织发芽，获得大花萱草的再生苗；

4)生根培养：将步骤3)中得到的萱草小苗转入生根培养基中，生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加0.1mg/L萘乙酸、3％蔗糖、0.6％琼脂，在温度25℃,光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养，培养至小苗基部出现白色短根并长出完整根系；

5)植株移栽：将步骤4)中得到的生根完整大花萱草小苗栽到珍珠岩与草炭1:1的基质中，温室炼苗，获得正常的大花萱草幼苗。

本发明利用萱草叶片进行组织培养实现快速繁殖，具有以下两个方面的意义：(1)萱草属植物主要以分生繁殖为主，繁殖系数低，繁殖所需时间长，不利于大花萱草的繁和良种的培养。组织培养时间短，增值频率高，可提高大花萱草的繁殖效率。(2)以露地生长的大花萱草幼嫩叶片作为外植体取材，不受花期取材时间的限制，延长了外植体取材时间，有利于大花萱草的应用和推广。

附图说明

图1：萱草新品种“红三角”愈伤组织培养图片；

图2：萱草新品种“红三角”芽诱导图片；

图3：萱草新品种“红三角”生根图片；

图4：野生萱草(Hemerocallis fulva)愈伤组织培养图片；

图5：野生萱草(Hemerocallis fulva)芽诱导图片；

图6：野生萱草(Hemerocallis fulva)生根图片；

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1大花萱草叶片组织培养

本实施例选择萱草新品种“红三角”进行叶片组织培养。

1)外植体的选择和消毒处理：选择抽出新叶数量较多的大花萱草单株，从中选出叶龄9-10天的新叶，截取茎尖以上部位的幼嫩叶片，尽量保证外植体的一致性。将外植体以流水冲洗3-5分钟，再用70％酒精表面灭菌30s，无菌水冲洗三次，然后用2％的NaClO浸泡10-15min，再用无菌水冲洗5-6次。

2)愈伤组织的诱导：在超净工作台中将步骤1)中处理后的叶片用镊子撕成1cm×1cm大小的长方块，近轴面朝上平铺于诱导培养基上，诱导培养基的配方为MS培养基中添加0.1mg/L NAA、1.0mg/L6-苄氨基嘌呤。接种后在温度25℃，黑暗条件下培养18天后叶片边缘出现愈伤组织(如图1)。

3)芽诱导：将步骤2)中得到的愈伤组织接种到幼芽培养基中，幼芽培养基的配方为MS培养基中添加0.1mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，在温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养，培养40-50天，至大花萱草长出芽(如图2)，得到萱草再生苗。

4)生根培养：将步骤3)中得到的萱草再生苗转入生根培养基中，生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加0.1mg/L萘乙酸、3％蔗糖、0.6％琼脂。在温度25℃,光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养。培养15天至小苗基部出现白色短根并长出完整根系，得到萱草小苗(如图3)。

5)植株移栽：将步骤4)中得到的大花萱草小苗栽到珍珠岩与草炭1:1的基质中，温室炼苗，获得正常的大花萱草幼苗。

本发明得到的大花萱草再生苗的成活率为98％。

实施例2大花萱草叶片组织培养

本实施例选择一种野生的大花萱草Hemerocallis fulva的叶片进行组织培养。

1)外植体的选择和消毒处理：选择抽出新叶数量较多的大花萱草单株，从中选出叶龄9-10天的新叶，截取茎尖以上部位的幼嫩叶片，尽量保证外植体的一致性。将外植体以流水冲洗3-5分钟，再用70％酒精表面灭菌30s，无菌水冲洗三次，然后用2％的NaClO浸泡10-15min，再用无菌水冲洗5-6次。

2)愈伤组织的诱导：在超净工作台中将步骤1)中处理后的叶片用镊子撕成1cm×1cm大小的长方块，近轴面朝上平铺于诱导培养基上，诱导培养基的配方为MS培养基中添加0.2mg/L NAA、1.0mg/L6-苄氨基嘌呤。接种后在温度25℃，黑暗条件下培养3周，叶片边缘出现愈伤组织(如图4)。

3)芽诱导：将步骤2)中得到的愈伤组织接种到幼芽培养基中，幼芽培养基的配方为MS培养基中添加0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤在温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养，培养40-60天，至大花萱草长出芽(如图5)，得到萱草再生苗。

4)生根培养：将步骤3)中得到的萱草再生苗转入生根培养基中，生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加0.1mg/L萘乙酸、3％蔗糖、0.6％琼脂。在温度25℃,光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养。培养15-30天至小苗基部出现白色短根并长出完整根系(如图6)。

5)植株移栽：将步骤4)中得到的生根完整大花萱草小苗栽到珍珠岩与草炭1:1的基质中，温室炼苗，获得正常的大花萱草幼苗。

本发明得到的大花萱草再生苗的成活率为96％。

对比例1：不同激素及浓度对叶片愈伤诱导的影响

以叶片为外植体的愈伤诱导过程中，根据培养基类型生长情况不同，大概分为以下四种情况：①植物组织退绿，呈现白色近死亡状态(接种叶片选取植株内层娇嫩叶片，接种时为黄色)；②植物组织伤口处产生褐色物质；③植物组织伤口处长出白色小颗粒状愈伤组织且组织膨大；④植物组织膨大或未发生任何变化。实验数据如下

由上表可以看出，选择本发明的提供的愈伤组织培养基的激素浓度，更有利于大花萱草愈伤组织的形成。

对比例2外植体的选择对叶片愈伤诱导的影响

同实施例1相比，其区别仅在于，外植体选择叶龄为15-16天的叶片，实验中发现采用这种外植体无法诱导形成愈伤组织。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种大花萱草叶片组织培养的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)外植体的选择和消毒处理；

2)愈伤组织的诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基中，至形成愈伤组织，所述诱导培养基的配方为：MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤；

3)芽诱导：将所述愈伤组织接种到幼芽培养基中，培养至愈伤组织出芽，形成再生苗；所述幼芽培养基的配方为：MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤；

4)生根培养：将所述再生苗转入生根培养基中，至再生苗基部出现白色短根并长出完整根系，得到大花萱草小苗，所述生根培养基的配方为：1/2MS培养基中添加0.1mg/L萘乙酸、3％蔗糖、0.6％琼脂，所述1/2MS培养基为将MS培养基中的大量元素浓度减半；

5)植株移栽：将所述大花萱草小苗栽到栽培基质中，温室炼苗，获得大花萱草幼苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外植体的选择具体为，选择抽出新叶数量较多的大花萱草单株，截取茎尖以上叶龄较一致的幼嫩新叶，即为所需的外植体，所述新叶为叶龄小于12天的叶子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理具体为，将外植体用流水冲洗3-5分钟，再用70％酒精表面灭菌20-30s，无菌水冲洗3-4次，然后用2％的NaClO浸泡10-15min，再用无菌水冲洗5-6次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织的诱导的的步骤为：在超净工作台中将处理后的外植体用镊子撕成小方块，近轴面朝上接种于诱导培养基内；接种后在温度23-27℃，黑暗条件下培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽诱导的培养条件为：温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养的条件为：温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大花萱草小苗是指完成了芽和根的分化，可以独立进行自养生长的幼小植株。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)外植体的选择和消毒处理：选择抽出新叶数量较多的大花萱草单株，截取茎尖以上叶龄较一致的幼嫩叶片，尽量保证外植体的一致性，将外植体以流水冲洗3-5分钟，再用70％酒精表面灭菌20-30s，无菌水冲洗三次，然后用2％的NaClO浸泡10-15min，再用无菌水冲洗5-6次；

2)愈伤组织的诱导：在超净工作台中将步骤1)中处理后的叶片用镊子撕成1cm×1cm大小的长方块，近轴面朝上接种于诱导培养基上，诱导培养基的配方为MS培养基中添加MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，接种后在温度25℃，黑暗条件下至叶片边缘出现愈伤组织；

3)芽诱导：将步骤2)中得到的愈伤组织接种到幼芽培养基中，幼芽培养基的配方为MS培养基中添加0.1-0.2mg/L NAA、1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤，接种后在温度25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养，获得大花萱草的再生苗；

4)生根培养：将步骤3)中得到的萱草小苗转入生根培养基中，生根培养基的配方为1/2MS培养基中添加0.1mg/L萘乙酸、3％蔗糖、0.6％琼脂，在温度25℃,光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d下培养，培养至小苗基部出现白色短根并长出完整根系；

5)植株移栽：将步骤4)中得到的生根完整大花萱草小苗栽到珍珠岩与草炭1:1的基质中，温室炼苗，获得正常的大花萱草幼苗。