CN104126505B

CN104126505B - 用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法

Info

Publication number: CN104126505B
Application number: CN201410317450.3A
Authority: CN
Inventors: 孙红梅; 张静
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-07-07
Also published as: CN104126505A

Abstract

本发明提供一种用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生的方法，其工艺步骤包括取细叶百合无菌苗叶片，接种于MS+BA？1.0mg·L^-1+NAA？0.5mg·L^-1中培养35天，获得非胚性愈伤组织。随后将其转于MS+BA？0.5mg·L^-1+NAA？1.0mg·L^-1中培养45天，获得胚性愈伤组织后转入MS+NAA？0.5mg·L^-1中，调整胚性比例，而后依次交替使用这两种培养基，可获得胚性比例高、萌发率低的胚性愈伤组织培养物。最后转于MS中，每1cm³胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。本发明以无菌苗为外植体，降低对百合原种的消耗；胚性愈伤组织诱导率高，保存效果好，肉眼可辨别，是遗传转化的良好受体；较以往方法，本发明建立的体细胞胚再生体系在愈伤组织诱导率和成苗系数方面分别提高了40%和3-4倍。

Description

用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法

技术领域

本发明属于球根花卉离体培养和遗传育种研究领域，尤其涉及用于细叶百合遗传转化和种球繁育的体细胞胚离体再生技术领域。

背景技术

体细胞胚是一种由单细胞发育而成的胚状体，采用这种方式繁殖具有取材少、遗传稳定性高、变异率低和再生率高等优点，可有效减轻转基因植株后期繁重的筛选工作，被认为在基因工程、体细胞融合、细胞突变体诱导、人工种子制备、杂种合子胚挽救、种质保存以及苗木快速繁殖等领域具有广泛应用前景，已成为近年来遗传转化等基因工程方面研究的热点。

细叶百合(LiliumpumilumDC.Fisch.)，别名山丹，是我国原产野生球根花卉，自然分布于东北、青海、陕西、宁夏等高寒地区，是分布最广、分布纬度偏北的百合种之一，自然生长于阴坡疏林下。细叶百合抗性较强，耐盐碱、耐寒、耐旱、耐阴，引种无须驯化，加之花色鲜红、花型优美，可直接应用于家庭盆栽、庭院及城市园林绿化，是促成栽培的优良植物材料。细叶百合鳞茎食用有滋阴、安神、润肺的功效，茎、叶具有消炎止痛的作用。

然而细叶百合从种子繁殖到植株开花需要3年时间，种球生长周期长，近年来由于生态环境恶化和人为乱采滥挖现象严重，其原生种球自然分布量锐减，濒临灭绝。因此，细叶百合作为一种优良的中国原产野生球根花卉，其种质资源保存和种球繁殖迫在眉睫。此外，细叶百合植株茎秆较为细弱，观赏性状有待于进一步改良。体细胞胚再生作为一种现代无性繁殖技术，是最有希望解决百合种球繁殖、优质种球培育、百合胚胎形态建成、组织分化以及植株再生等方面理论和实践问题的重要技术领域。胚性愈伤组织是基因转化的良好受体材料，诱导愈伤组织并长期保持其胚性状态对基于转基因技术的观赏性状改良及种质创新意义深远。这一技术的应用将对百合种质保存、人工种子研制、突变体筛选、多倍体育种及转基因育种等领域产生重要意义。

发明内容

本发明的目的是以细叶百合无菌苗叶片为外植体，诱导外植体脱分化形成胚性愈伤组织，经过胚性比例调整和保存阶段，获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%的胚性愈伤组织，在控制愈伤组织长期保持胚性状态的基础上有效保存胚性愈伤组织并诱导球形胚，获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1cm³愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚。而在体细胞胚萌发阶段，提高萌发率，促进球形胚萌发，后经历类似合子胚的发育过程，最终成功获得成熟萌发的体细胞胚，1cm³胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。从而为细叶百合的种球扩繁和种质保存提供高效稳定的体细胞胚再生体系，并为基于转基因的遗传转化提供胚性愈伤组织这一优良转化受体。

本发明提供的技术方案，包括以下工艺步骤：

1.外植体脱分化阶段（非胚性愈伤组织诱导阶段）

选取小鳞茎直径为1-1.2cm的细叶百合无菌苗，将叶片切为长0.5cm小段，正面向上、平铺接种于脱分化培养基MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1（其中BA/NAA为2）中，光培养。该培养基中含有蔗糖30g·L^-1，琼脂（条）7g·L^-1，pH5.8，121℃高压灭菌20分钟。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1；接种15天时，叶片、叶柄表层皱缩并形成细微的嫩黄色颗粒，后形成愈伤化。接种35天时，形成黄绿色、晶莹度大、湿度高、表面平滑的非胚性愈伤组织。

2.胚性细胞转化阶段（胚性愈伤组织诱导阶段）：在脱分化培养基中培养第45天，将步骤1中外植体脱分化获得的非胚性愈伤组织切为0.5cm³小块，转接于胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1（即BA/NAA为1/2）中，使非胚性愈伤组织***培养基内2-3mm，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。接种30天，在黄绿色非胚性愈伤组织表面形成亮黄色、颗粒性明显的胚性愈伤组织。

3.胚性比例和颗粒性调整阶段：经步骤2培养45天，去除黄绿色非胚性愈伤组织部分，将亮黄色的胚性愈伤组织切为1cm³小块，转接于胚性愈伤组织调整培养基MS+NAA0.5mg·L^-1中，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。相同培养基继代培养1次后可获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%、颗粒性良好的胚性愈伤组织。

4.球形胚诱导阶段：选择步骤3中获得的胚性愈伤组织，去除绿色非胚性愈伤组织和萌发的芽，依次交替使用胚性愈伤组织诱导培养基（MS+BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1）和胚性比例调整培养基（MS+NAA0.5mg·L^-1），培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。每45天更换一次培养基，交替使用2次。可获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1cm³愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚。

5.体细胞胚萌发和成苗阶段：将步骤4中含有球形胚的胚性愈伤组织培养物转于MS基本培养基中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。15-20天后，球形胚萌发，依次经历心形胚、盾形胚及子叶胚阶段萌发形成成熟体细胞胚，1cm³胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。

本发明的优点和积极效果是：

1.以无菌苗叶片为外植体，降低百合原种的消耗，可有效保护野生种质资源，而且对试管鳞茎无损耗，不影响炼苗移栽，为科学繁殖野生百合提供了新思路；

2.胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织可凭颜色肉眼辨别。本发明中，表面平滑、黄绿色的为非胚性愈伤组织，而亮黄色、呈明显颗粒性状的为胚性愈伤组织；

3.胚性愈伤组织诱导率高，保存效果好，为遗传转化提供良好受体。在胚性愈伤组织诱导阶段，以脱分化的非胚性愈伤组织诱导胚性细胞转化，诱导率高；在胚性愈伤组织保存阶段，改良培养基配方，在控制愈伤组织长期保持胚性状态的基础上有效保存胚性愈伤组织，获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%的胚性愈伤组织，并在有效保存胚性愈伤组织的基础上诱导球形胚，获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1cm³愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚，为显著提高再生效率奠定基础；此外，该胚性愈伤组织对常用抗生素敏感性强，为细叶百合基于转基因的遗传转化提供胚性愈伤组织这一优良转化受体；

4.再生效率高。本发明在体细胞胚萌发阶段，提高萌发率，促进球形胚萌发，后经历类似合子胚的发育过程，最终成功获得成熟萌发的体细胞胚，1cm³胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚，与前人关于其他种类百合体细胞胚离体再生的研究结果相比，胚性愈伤组织诱导率和分化成苗系数均提高20%，分化系数提高5倍，实现了高效再生的目的，从而为细叶百合的种球扩繁和种质保存提供高效稳定的体细胞胚再生体系；而相比细叶百合的现有研究，本发明首次建立了体细胞胚再生体系，与前人采用的离体再生途径相比，愈伤组织诱导率提高了40%，分化系数提高3-4倍，可作为细叶百合种球快繁高效稳定的再生体系；

5.降低生产成本。目前TDZ、PIC、DIC、KT等新型激素被广泛用于其他种类百合愈伤组织或体细胞胚的诱导（TangYP,2010;TribulatoA,2006;KhosraviS,2007），但此类激素价格普遍偏高。而本发明中建立的细叶百合体细胞胚发生体系，仅使用BA和NAA两种常见植物激素，市售价格仅为新型激素的1/10-1/5，在保证再生效率的基础上有效降低了生产成本；此外，在体细胞胚萌发阶段，前人研究中需额外添加NAA、IBA或BA，以促进体细胞胚萌发和生根（翟彦等，2011；袁雪等，2012），而本发明采用不添加任何激素的MS基本培养基，保证体细胞胚高分化系数和正常生根的同时，可有效降低生产成本，提高生产效率。

附图说明

图1为外植体脱分化（Bar:5mm）；

图2为胚性愈伤组织诱导（Bar:5mm）；

图3为非胚性愈伤组织（Bar:1mm）；

图4为调整后的胚性愈伤组织（Bar:5mm）；

图5为球形胚诱导（Bar:2mm）；

图6为体细胞胚萌发（Bar:5mm）；

图7为不定芽成苗（Bar:5mm）；

图8为体细胞胚成苗（Bar:5mm）；

图9为球形胚（Bar:2mm）；

图10为心形胚（Bar:2mm）；

图11为盾形胚（Bar:2mm）；

图12为子叶形胚后期（Bar:5mm）；

图13为非胚性愈伤组织切片观察（Bar:200μm）；

图14为胚性愈伤组织切片观察（Bar:200μm）；

图15为不定芽再生；

图16为体细胞胚再生。

具体实施方式

为了更详细叙述本发明的工艺步骤，下面举实例说明。

实例一、细叶百合体细胞胚离体再生技术

1.非胚性愈伤组织诱导阶段（外植体脱分化阶段）

选取小鳞茎直径为1-1.2cm的细叶百合无菌苗，将叶片切为长0.5cm小段，正面向上、平铺接种于脱分化培养基MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1（即BA/NAA为2）中，光培养。其中含有蔗糖30g·L^-1，琼脂条7g·L^-1，pH5.8，121℃高压灭菌20分钟。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。

试验环节发现，若以鳞片为外植体，均以不定芽直接再生途径发生。而以叶片和叶柄为外植体时未形成不定芽，而是在接种15天时，叶片、叶柄表层出现皱缩并形成细微的嫩黄色颗粒，后形成愈伤化。接种35天，形成黄绿色、晶莹度大、湿度高、表面平滑的非胚性愈伤组织，经愈伤组织间接再生途径发生。

愈伤状况及愈伤化程度因激素浓度不同而不同。BA浓度较低为1.0mg·L^-1，NAA浓度较高为0.5mg·L^-1时，叶片和叶柄的愈伤化程度最高。即培养基MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1（BA/NAA为2时）为细叶百合无菌苗叶片和叶柄诱导愈伤组织的最适培养基，愈伤组织诱导率达30%，诱导形成的非胚性愈伤组织呈黄绿色、晶莹度大、湿度高且表面平滑（见附图1、图3）。

2.胚性愈伤组织诱导（胚性细胞转化阶段）

在脱分化培养基中培养第45天，即非胚性愈伤组织诱导培养第45天，将步骤1中外植体脱分化获得的非胚性愈伤组织切为0.5cm³小块，转接于胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1（即BA/NAA为1/2）中，使非胚性愈伤组织***培养基内2-3mm，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。接种30天，在黄绿色非胚性愈伤组织表面形成亮黄色、颗粒性明显的胚性愈伤组织（见附图2）。

试验环节发现，若将外植体脱分化产生的的非胚性愈伤组织接于不含BA、NAA的MS培养基中，黄绿色非胚性愈伤组织逐渐褐化，未诱导出现胚性愈伤组织；若MS培养基中添加BA的浓度较高为1.5或2.0mg·L^-1、NAA浓度较低为0.1或0.5mg·L^-1，即传统添加方式—BA浓度高于NAA浓度时，非胚性愈伤组织分化产生不定芽，并未诱导产生胚性愈伤组织。

与以往研究不同的是，本发明将MS培养基中添加的BA和NAA浓度均调整为0.5或1.0mg·L^-1，并且使得NAA浓度高于BA，均可获得胚性愈伤组织。尤其是当NAA添加浓度为BA浓度的2倍，即BA/NAA为1/2时，获得的胚性愈伤组织诱导率最高，可达88%。

3.胚性比例和颗粒性调整阶段

经步骤2培养45天，去除黄绿色非胚性愈伤组织部分，将亮黄色的胚性愈伤组织切为1cm³小块，转接于胚性愈伤组织调整培养基MS+NAA0.5mg·L^-1中，光培养。培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。经过胚性比例调整和保存阶段，在相同培养基中继代培养1次后，在控制愈伤组织长期保持胚性状态的基础上有效保存胚性愈伤组织，可获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%、颗粒性良好的胚性愈伤组织（见附图4）。

胚性愈伤组织颗粒性易消失，若培养基不适，亮黄色、颗粒性明显的胚性愈伤组织会转化为绿色非胚性愈伤组织。因此如何在胚性愈伤组织保存过程中，既保证胚性愈伤组织长期保持其胚性状态，又能抑制胚性愈伤组织萌发成为试验过程中的关键环节。试验发现，当BA和NAA浓度均较高，分别为1.0和0.5mg·L^-1时，胚性愈伤组织比例最高为65.67%，但此时超过50%的胚性愈伤组织由黄色转化为绿色，即胚性丧失严重，而且此培养基中胚性愈伤组织萌发率也很高，达30%以上。

而本发明中，将非胚性愈伤组织转接于MS+NAA0.5mg·L^-1中培养45天，胚性愈伤组织比例为55.81%，且转绿率低于30%，萌发率控制在20%以下。

4.球形胚诱导阶段

选择步骤3中获得的胚性愈伤组织，去除绿色非胚性愈伤组织和萌发的芽，依次交替使用胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1和胚性比例调整培养基MS+NAA0.5mg·L^-1，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。每45天更换一次培养基，交替使用2次。可获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1cm³愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚（见附图5）。

5.体细胞胚萌发和成苗阶段

现有关于百合体细胞胚发生的研究中，在体细胞胚萌发成苗阶段需额外添加NAA、IBA或BA，以促进体细胞胚萌发和生根（翟彦等，2011；袁雪等，2012），而本发明在体细胞胚萌发阶段，采用不添加任何激素的MS基本培养基，保证体细胞胚高分化系数和正常生根的同时，可有效降低生产成本。

具体实施步骤为：将步骤4中含有球形胚的胚性愈伤组织培养物转于MS基本培养基中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1。15-20天后，球形胚萌发（见附图6），由球形胚（见附图9）依次经历心形胚（见附图10）、盾形胚（见附图11）及子叶胚（见附图12）阶段萌发形成成熟体细胞胚，1cm³胚性愈伤组织培养物可形成超过21个体细胞胚。

6.抗生素敏感性筛选

以含球形胚的胚性愈伤组织培养物为外植体，在本发明中筛选获得的体细胞胚萌发的最适培养基MS中，添加不同浓度Kan、Hyg抗生素进行敏感浓度筛选。试验环节发现，本发明提供的胚性愈伤组织对常用抗生素Kan和Hyg敏感，筛选获得的亚致死浓度分别为150mg·L^-1和30mg·L^-1。

实例二、非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织的鉴定

经体视显微镜观察可见，非胚性愈伤组织则表面光滑，而胚性愈伤组织有显瘤状结构。观察石蜡切片发现，两种类型愈伤组织具有明显差异，其中非胚性愈伤组织内部无明显细胞结构（见附图13），而胚性愈伤组织多为外起源，内部细胞结构明显，多成圆球形，由内层向外，细胞逐渐变小，排列也更为紧密（见附图14）。

实例三、验证体细胞胚发生途径的高效性

虽然体细胞胚再生体系具有单细胞起源、繁殖系数高等优点，但由于诱导相对困难，目前国内外仅有少数几种百合获得体细胞胚，且多为切花品种，然而包括细叶百合在内的众多野生百合均鲜有报道。目前有关细叶百合离体再生的研究主要集中于器官发生途径，以取自成株的鳞茎，非无菌苗的细叶百合鳞片为外植体进行不定芽诱导时，诱导系数为3-4.8；以细叶百合花丝为外植体，愈伤组织诱导率为40%，愈伤组织进行不定芽分化时，分化系数为10.8（金淑梅等，2006；葛蓓孛等，2010）；在其他百合有关体细胞胚发生的研究方面，东方百合切花品种胚性愈伤组织诱导率在70%左右，分化成苗率低于70%（张艺萍等，2008）；OT系列切花‘Manissa’胚性愈伤组织的诱导率79%，成苗数为5.6（翟彦等，2011）；麝香百合胚性愈伤组织诱导率为65.74%，分化成苗率达81.48%，成苗数为2.04（袁雪，2012）。

而本发明提供的细叶百合胚性愈伤组织诱导率达88%以上，分化成苗率达95%以上，并且分化系数超过20，与前人有关细叶百合离体再生的研究结果相比，愈伤组织诱导率提高了40%，分化系数提高3-4倍（见附图7-8、15-16），而与前人关于体细胞胚离体再生的研究结果相比，胚性愈伤组织诱导率提高20%，分化成苗率提高20%，分化系数提高5倍，可作为细叶百合种球快繁高效稳定的再生体系。

Claims

1.一种用于细叶百合遗传转化和种球快繁的体细胞胚离体再生方法，其特征是步骤为：

⑴外植体脱分化阶段

将叶片切为长0.5cm小段，正面向上、平铺接种于脱分化培养基MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1中，光培养，该培养基中含有蔗糖30g·L^-1，琼脂条7g·L^-1，pH5.8，121℃高压灭菌20分钟，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1；接种15天时，叶片、叶柄表层皱缩并形成细微的嫩黄色颗粒，后形成愈伤化，接种35天时，形成黄绿色、晶莹度大、湿度高、表面平滑的非胚性愈伤组织；

⑵胚性细胞转化阶段

在脱分化培养基中培养第45天，将步骤1中外植体脱分化获得的非胚性愈伤组织切为0.5cm³小块，转接于胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1中，此时BA/NAA为1/2，使非胚性愈伤组织***培养基内2-3mm，光培养，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1，接种30天，在黄绿色非胚性愈伤组织表面形成亮黄色、颗粒性明显的胚性愈伤组织；

⑶胚性比例和颗粒性调整阶段

经步骤2培养45天，去除黄绿色非胚性愈伤组织部分，将亮黄色的胚性愈伤组织切为1cm³小块，转接于胚性愈伤组织调整培养基MS+NAA0.5mg·L^-1中，光培养，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1；相同培养基继代培养1次后，获得胚性比例高于90%、萌发率低于5%、颗粒性良好的胚性愈伤组织；

⑷球形胚诱导阶段

选择步骤3中获得的胚性愈伤组织，去除绿色非胚性愈伤组织和萌发的芽，依次交替使用胚性愈伤组织诱导培养基MS+BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1和胚性比例调整培养基MS+NAA0.5mg·L^-1，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每45天更换一次培养基，交替使用2次，获得胚性比例高达100%、萌发率为0的良好胚性愈伤组织培养物，其中1cm³愈伤组织培养物含有20个以上的球形胚；

⑸体细胞胚萌发和成苗阶段

将步骤4中含有球形胚的胚性愈伤组织培养物转于MS基本培养基中，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80-90%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m^-2·s^-1，15-20天后，球形胚萌发，依次经历心形胚、盾形胚及子叶胚阶段萌发形成成熟体细胞胚，1cm³胚性愈伤组织培养物形成超过21个体细胞胚。