CN104535667A - 一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法 - Google Patents

一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用高效液相色谱法分离检测松柏醇和芥子醇含量的方法。打破了常规用高相气相色谱测定松柏醇的方法，并且此方法可以同时检测松柏醇和芥子醇。另外可以实现和酸类物质在同一种条件下测定的方法，使实验数据更能说明问题。该方法采用C18柱，流动相为水和甲醇，体积流量为0.4-0.7mL/min，柱温为25-30℃，分析时间为70min，检测波长为275nm，进样量为20uL，能够有效的检测分离松柏醇和芥子醇，并且峰形较好，能够用来分离测定样品中松柏醇和芥子醇。

Description

一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法
技术领域
本发明属物质分离测定领域，尤其涉及一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法。
背景技术
松柏醇和芥子醇都是研究较少的化学物质，松柏醇的结构式见图1，芥子醇的结构式见图2，对它们的许多理化性质都是未知的，对于松柏醇和芥子醇还需要更深入的研究，并且它们是梨次生代谢形成木质素的途径中的关键中间代谢产物，松柏醇和芥子醇分别为G-木质素和S-木质素的前体物质。研究松柏醇和芥子醇有利于更好的研究梨的代谢途径。梨的口感好坏与石细胞有关，而石细胞又是由木质素聚合而 成，故研究松柏醇和芥子醇，在实际生产生活中有利于控制石细胞的含量，能改善梨的口感，提高梨的品质。
松柏醇和芥子醇属于酚醇类化合物，松柏醇沸点为163-165℃，芥子醇沸点为384.7℃，其在常压下沸点较低，根据其理化性质来判断，检测松柏醇和芥子醇应用气相色谱更适合，但是已有人应用液相色谱测定梨代谢过程中主要酚酸类如芥子酸、肉桂酸、柠檬酸、苹果酸等的含量，所以应用高效液相色谱法来测定其含量更合适，使得我们能在同一个水平上对不同的物质进行分析，可以减少不同检测方法对实验数据造成的影响。
另外，松柏醇和芥子醇的结构相似，芥子醇与松柏醇相比，只多了一个甲氧基，通过紫外分光光度计的波长扫描，我们可以看出二者的峰型一致，在同一检测波长下，二者的吸光度是相同的，而HPLC检测光为紫外光，故想要用HPLC分离检测松柏醇和芥子醇还是有一定的难度，前人都没有做过。
发明内容
本发明的目的是提出一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
    一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、标准曲线的测定
（a）应用分析天平分别准确称取1mg的松柏醇和芥子醇的标准品；
（b）分别溶于10mL60%的色谱级甲醇溶液中；
（c）分别在松柏醇和芥子醇标准品溶液中取2.5mL，然后混到一起，制成松柏醇和芥子醇总浓度为50ug/mL的混标溶液；
（d）按色谱条件进行分离检测；
色谱条件为：色谱柱参数为 C18 Column 250x4.6mm 5um（(长度为250mm的C18填料的色谱柱，该色谱柱的内径为4.6mm，色谱柱填料颗粒的大小 为5um).流动相为甲醇和纯水，梯度洗脱，体积流量为0.4-0.7mL/min，柱温为25-30℃，分析时间为70min，检测波长为275nm，进样量为20uL；
（2）、供试品溶液的制备
选取待测物，称取4-5g待测样品，加入70mL水，在85-90℃水浴锅中水浴3-5min，去掉水，再加70-80mL水，在85-90℃水浴锅中水浴3-5min，去掉水，用研钵进行研磨，加15mL75%-80%的乙醇溶液，水浴75-80℃回流2-3h，取上清，再加15mL75%-80%的乙醇溶液，水浴75-80℃回流2-3h，，取上清，合并两次所得上清液，旋转蒸发至干，加5-10mL55%-70%的色谱级甲醇溶液中复溶，用0.22μm 微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；
（2）、供试品测定
按照步骤（1）所述的色谱条件，测定供试品HPLC色谱图，并对谱图数据进行分析，得到待测物中松柏醇和芥子醇高效液相色谱图。
     所述的一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法，其特征在于：液相色谱仪的检测器为紫外检测器。
    所述的一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法，其特征在于：色谱柱为AlltimaTM HP C18 Column 250x4.6mm 5um。
所述的用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法的制备方法，其特征在于：梯度洗脱的具体液相条件见表1：
                  表1 梯度洗脱程序
时间(min) 甲醇(%) 水(%) 流速（mL/min）
0 15 85 0.5
70 30 70 0.5
本发明的有益效果：
本发明公开了一种利用高效液相色谱法分离检测松柏醇和芥子醇含量的方法。打破了常规用高相气相色谱测定松柏醇的方法，并且此方法可以同时检测松柏醇和芥子醇。另外可以实现和酸类物质在同一种条件下测定的方法，使实验数据更能说明问题。该方法采用C18柱，流动相为水和甲醇，体积流量为0.4-0.7mL/min，柱温为25-30℃，分析时间为70min，进样量为20uL。紫外检测波长为275nm，能够有效的检测分离松柏醇和芥子醇，并且峰形较好，能够用来分离测定样品中松柏醇和芥子醇。
本发明解决了松柏醇、芥子醇和阿魏酸等在不同测量方法下产生的误差，可以使实验数据更有说服力。此方法的创新之处就在于应用HPLC分离检测出了松柏醇和芥子醇。
附图说明
 图1 为松柏醇结构式；
 图2 为芥子醇结构式；
 图3 为松柏醇标准品高效液相色谱图；
 图4 为芥子醇标准品高效液相色谱图；
 图5为松柏醇芥子醇混标高效液相色谱图；
 图6为鸭梨对砀山酥梨授粉47天梨果实高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述
鸭梨对砀山酥梨授粉47天梨果实中松柏醇和芥子醇的分离检测：
（1）    材料收集
鸭梨对砀山酥梨授粉47天梨果实
（2）    标准曲线的测定
a)    应用分析天平分别准确称取1mg的松柏醇和芥子醇的标准品。分别溶于10mL60%的色谱级甲醇溶液中。然后分别稀释成10ug/mL、30ug/mL、50ug/mL、70ug/mL、90ug/mL的标准溶液。
b)    色谱条件为：色谱柱为AlltimaTM HP C18 Column 250x4.6mm 5um，流动相为甲醇和纯水梯度洗脱，体积流量为0.5mL/min，柱温为25℃，分析时间为70min，检测波长为275nm，进样量为20uL。具体洗脱程序见表1：
表1 梯度洗脱程序
时间(min) 甲醇(%) 水(%) 流速（mL/min）
0 15 85 0.5
70 30 70 0.5
（3）供试品溶液的制备：选取鸭梨对砀山酥梨授粉47天梨果实，去皮去核，采用四分法切割 ，称取5g样品，加入70mL水，在90℃水浴锅中水浴5min，去掉水，再加70mL水，在90℃水浴锅中水浴5min，去掉水。研磨成浆状，加15mL80%的乙醇溶液，水浴80℃回流3h，取上清，再加15mL80%乙醇溶液，水浴80℃回流3h，取上清，合并两次所得上清液，旋转蒸发至干，加5mL60%甲醇溶液复溶。用0.22μm 微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。
（4）供试品测定：按照色谱条件，测定供试品HPLC色谱图，并对谱图数据进行分析，得到鸭梨对砀山酥梨授粉47天梨果实中松柏醇和芥子醇高效液相色谱图,见图6，通过标准曲线计算得47天鸭梨对砀山酥梨授粉的梨果实中，含有松柏醇和芥子醇的含量分别为20.74026949ug/g和75.2978196ug/g。

Claims (4)

1.一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、标准曲线的测定
（a）应用分析天平分别准确称取1mg的松柏醇和芥子醇的标准品；
（b）分别溶于10mL55%-65%的色谱级甲醇溶液中；
（c）分别在松柏醇和芥子醇标准品溶液中取2.5mL，然后混到一起，制成松柏醇和芥子醇总浓度为50ug/mL的混标溶液；
（d）按色谱条件进行分离检测；
色谱条件为：色谱柱参数为 C18 Column 250x4.6mm 5um，(长度为250mm的C18填料的色谱柱，该色谱柱的内径为4.6mm，色谱柱填料颗粒的大小 为5um)；流动相为甲醇和纯水，梯度洗脱，体积流量为0.4-0.7mL/min，柱温为25-30℃，分析时间为70min，检测波长为275nm，进样量为20uL；
（2）、供试品溶液的制备
选取待测物，称取4-5g待测样品，加入70mL水，在85-90℃水浴锅中水浴3-5min，去掉水，再加70-80mL水，在85-90℃水浴锅中水浴3-5min，去掉水，用研钵进行研磨，加15mL75%-80%的乙醇溶液，水浴75-80℃回流2-3h，取上清，再加15mL75%-80%的乙醇溶液，水浴75-80℃回流2-3h，，取上清，合并两次所得上清液，旋转蒸发至干，加5-10mL55%-70%的色谱级甲醇溶液中复溶，用0.22μm 微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；
（3）、供试品测定
按照步骤（1）所述的色谱条件，测定供试品HPLC色谱图，并对谱图数据进行分析，得到待测物中松柏醇和芥子醇高效液相色谱图。
2.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法，其特征在于：液相色谱仪的检测器为紫外检测器。
3.根据权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法，其特征在于：色谱柱为AlltimaTMHP C18 Column 250x4.6mm 5um。
4.根据权利要求1所述的用高效液相色谱法分离测定松柏醇和芥子醇含量的方法的制备方法，其特征在于：梯度洗脱的具体液相条件见表1：
                  表1 梯度洗脱程序
时间(min) 甲醇(%) 水(%) 流速（mL/min） 0 15 85 0.5 70 30 70 0.5
。
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