CN104531712A

CN104531712A - 具有杀菌活性的烟粉虱肽聚糖识别蛋白的制备及应用

Info

Publication number: CN104531712A
Application number: CN201410736760.9A
Authority: CN
Inventors: 陈学新; 王知知; 时敏; 赵伟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-12-07
Filing date: 2014-12-07
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-07
Also published as: CN104531712B

Abstract

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，旨在提供一种具有杀菌活性的烟粉虱肽聚糖识别蛋白的制备及应用。该烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因及其编码的核苷酸序列，使其能够应用在大肠杆菌中表达新的蛋白、编码序列。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑菌实验的结果表明：重组的烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因BtPGRP原核表达的重组蛋白具有结合革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的能力，同时能够杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产，在开发广谱抗菌类药物和新型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。

Description

具有杀菌活性的烟粉虱肽聚糖识别蛋白的制备及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域。本发明涉及一种烟粉虱肽聚糖识别蛋白(BtPGRP)基因及其所编码蛋白的应用，尤其涉及一种烟粉虱肽聚糖识别蛋白(BtPGRP)的体外重组表达技术、活性重组蛋白的分离纯化以及对微生物的识别和杀菌抑菌作用研究。

背景技术

天然免疫反应是机体防御感染性疾病的一道重要防线，这一防御***对于所有多细胞生物生存和物种延续都是非常重要的。不同于哺乳动物，昆虫无免疫球蛋白，缺乏获得性免疫，因此昆虫生存一大挑战就是识别外来病原物。在长期进化过程中发展出了一套独特的病原物识别模式，可以识别病原物外壁脂多糖(LPS)、脂磷壁酸质类、脂蛋白、肽聚糖(PGN)、β-1,3-葡聚糖并对其作出防御反应。这种病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构称为病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)。免疫识别在进化过程中发展出多种能够识别一种或多种PAMP分子的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRP)，如清道夫受体(SCRs)、C-型凝集素(CTLs)、革兰氏阴性菌结合蛋白GNBPs(Gram-negative binding proteins)和肽聚糖识别蛋白PGRPs(peptidoglycan recognition proteins)等。肽聚糖识别蛋白PGRPs是一类重要的模式识别受体(PRR)，在识别病原体入侵和激活免疫调控途径中发挥着重要作用。肽聚糖识别蛋白PGRP是在家蚕Bombyx mori中首次发现的，该蛋白能够结合肽聚糖，激活多酚氧化酶级联反应。PGRP存在1个与T7溶菌酶同源的结构域，并具有Zn依赖的N-乙酰胞壁-L-丙氨酸酰胺酶活性。目前在黑腹果蝇Drosophila melanogaster基因组中共发现了13个PGRP基因编码17个PGRP蛋白、冈比亚按蚊Anopheles gambiae基因组中发现7个PGRP基因，同源比对发现这些基因与哺乳动物PGRPs基因高度保守。目前研究发现PGRP在昆虫先天免疫中可分为以下几类：a)识别病原体后诱发酚氧化酶原级联反应，产生黑色素来包裹微生物；b)识别革兰氏阳性菌，激活Toll信号通路(PGRP-SA)；c)识别革兰氏阴性菌，激活Imd信号通路，诱导自我吞噬；d)酰胺酶活性，使PGN失活。此外，哺乳动物(人和大鼠)中PGRP还具有抗细菌活性。最近研究发现昆虫中果蝇的PGRP-SB1、熊PGRP-S对芽孢杆菌有抗菌作用。PGRP蛋白的杀菌机制有两种：一种是出于PGRP与肽聚糖不可逆的结合，从而干扰细菌细胞壁的合成；另一种是一些PGRP具有酰胺酶活性。可以降解肽聚糖，从而破坏细胞壁使菌体破裂，这种杀菌作用类似于青霉素。

肽聚糖识别蛋白的结构和功能在昆虫和哺乳动物中已得到一定程度的研究，但是，目前国内外尚没有烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP的研究报道。烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在世界各地暴发成灾，造成惨重的损失。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传播多种植物病毒，是重要的病毒传播媒介，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝收。PGRP在传毒媒介昆虫烟粉虱中的研究，有利于更好的揭示其在免疫反应以及传播植物病毒中的作用及其工作机制，同时也为开发广谱抗菌药物和筛选免疫增强剂提供依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对目前烟粉虱免疫反应研究状况及其不足，提供一种具有杀菌活性的烟粉虱肽聚糖识别蛋白(BtPGRP)蛋白的制备及应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

本发明提供了一种烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明进一步提供了由烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供了前述烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的方法，是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。

本发明进一步提供了前述蛋白在制备抗菌类药物、食品保鲜剂或饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明所提供的烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因及其编码的核苷酸序列，使其能够应用在大肠杆菌中表达新的蛋白、编码序列。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑菌实验的结果表明：重组的烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因BtPGRP原核表达的重组蛋白具有结合革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的能力，同时能够杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产，在开发广谱抗菌类药物和新型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为IPTG诱导的pET28a-BtPGRP-BL21和纯化的重组烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。1：未诱导pET28a-BtPGRP-BL21菌株；Lane 2：1mM IPTG诱导的pET28a-BtPGRP-BL21菌株；3：纯化重组蛋白；M：蛋白Marker。

图2为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对大肠杆菌的识别作用图。

图3为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对金黄色葡萄球菌的识别作用图。

图4为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对大肠杆菌E.coli的生长抑制作用图。

图5为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因重组蛋白对金黄色葡萄球菌S.aureus的生长抑制作用图。

具体实施方案

本发明中，所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因cDNA的克隆方法是以烟粉虱总RNA反转录得到cDNA为模板，构建cDNA文库，根据烟粉虱转录组筛选得到BtPGRP部分cDNA序列，然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因cDNA全长序列。

本发明用于表达烟粉虱肽聚糖识别蛋白重组蛋白的成熟肽基因序列是以烟粉虱肽聚糖识别蛋白全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到，它来源于烟粉虱肽聚糖识别蛋白全长基因区域所对应的基因片段。

本发明上述含有烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因的大肠杆菌基因表达载体优先由本发明合成的烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因与大肠杆菌表达载体pET-28a构建的重组表达载体，命名为pET28a-BtPGRP。

本发明能表达烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因的大肠杆菌重组菌株优先由含有烟粉虱肽聚糖识别蛋白的表达载体pET28a-BtPGRP转化大肠杆菌BL21(DE3)而得到的菌株，命名为pET28a-BtPGRP-BL21。

上述烟粉虱肽聚糖识别蛋白的重组蛋白具体制备方法是通过如下技术方案来实现：选取大肠杆菌重组菌株pET28a-BtPGRP-BL21接种在10ml含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，取50μl菌液加入到装有50ml Kana⁺LB液体培养基的150ml无菌三角瓶中，37℃，150rpm的摇箱中培养6～8h至对数期，加入100mM IPTG至终浓度为1mM，27℃，250rpm振荡培养。当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组烟粉虱肽聚糖识别蛋白。

本发明所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP在制备具有活性的重组蛋白中应用。其中，所述应用的方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。例如：将获得的烟粉虱肽聚糖识别蛋白基因克隆到pET-28a(Novagen公司)表达载体，转化到大肠杆菌BL21细胞。进行诱导表达，获得具有活性的重组蛋白(即烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因编码的活性蛋白)。

烟粉虱肽聚糖识别蛋白的重组蛋白的应用，所述序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列的重组蛋白BtPGRP用于制备广谱抗菌类制剂。

所述序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列的重组蛋白BtPGRP用于制备免疫增强剂或饲料添加剂。

本发明所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列特征：长度：1027碱基对；类型：核酸；链型：双链；拓扑结构：线性；分子类型：cDNA。

本发明所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因基因编码的蛋白，其氨基酸如SEQID NO.2所示。该序列特征：长度：235氨基酸；类型：氨基酸；链型：单链；拓扑结构：线性；分子类型：蛋白质。特性：该蛋白分子量为25.86kDa，理论等电点为6.21。其中编码序列的1-29位为信号肽序列，成熟肽分子量为22.67kDa，等电点为5.81，具有一个保守的PGRP结构域。

本发明提供的重组蛋白序列为烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP成熟肽区域。本序列来源为SEQ ID NO.2去除信号肽前体。

利用免疫荧光检测的烟粉虱肽聚糖识别蛋白功能及平板计数检测肽聚糖识别蛋白抗菌活性。结果表明本发明制备肽聚糖识别蛋白具有杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性。因此本发明提供了所述肽聚糖识别蛋白在制备用于治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的食品添加剂或药物中的应用。

下面结合实验室具体的实验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHaebor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。

实施案例1：烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因全长cDNA克隆

1.1、TRIzol法提取总RNA

(1)将一定量(约200只烟粉虱)冰冻1min，放入1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol试剂，充分研磨匀浆，室温静置5min。

(2)向离心管中加入0.2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置2min。

(3)4℃，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新1.5ml的离心管中。

(4)向离心管中加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

(5)4℃，12000g离心10min，弃掉上清液。

(6)向离心管中加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于-80℃超低温冰箱中长期保存)

(7)晾干离心管，加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶)，分光光度计测量OD260/OD280的值，比值在1.8～2.0之间时，进行下一步实验。

1.2、cDNA第一链合成

(1)往0.5ml无菌的离心管中分别加入1μl提取的RNA，1μl SMARTⅣ/5’PCR正向引物，1μl CDSⅢ/3’PCR反向引物，加2μl DEPC H₂O使总体积达到5μl。

(2)混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃孵育2min。

(3)迅速将离心管冰浴2min，短暂离心。

(4)往离心管中分别加入2μl 5×Frist-strand Buffer，1μl 20mM二硫苏糖醇(DTT)，1μl 10mM dNTP，1μl Reverse Transcriptase反转录酶，反复吹打混匀，短暂离心。

(5)42℃孵育1h。

(6)将离心管置于冰上2～3min，终止反应。取一部分用于进一步实验，其余于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

1.3、dsDNA合成

(1)往0.5离心管中分别加入1μl第一链合成反应产物，5μl 10×LA Buffer(Mg²⁺free)，5μl Mg²⁺，8μl dNTP，1μl SMARTⅣ/5’PCR正向引物，1μlCDSⅢ/3’PCR反向引物，0.5μl LA Tag DNA聚合酶，29.5μl ddH₂O，充分混匀，短暂离心。

(2)PCR仪中按以下扩增程序(95℃，20s；25～28×(95℃，5s；68℃，6min))扩增。

(3)取5μl PCR产物用于凝胶检测(检测条带所含分子量范围及条带亮暗)，取检测结果良好的1μl产物稀释100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80℃超低温冰箱冷冻保存。

1.4、PCR扩增烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因cDNA 5’和3’末端

操作按Clontech公司试剂盒SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。根据试剂盒的要求，依据已知的肽聚糖识别蛋白BtPGRP基因EST序列分别设计两条上、下游引物，以进行巢式PCR。所用引物分别为：

引物名称

引物序列(5’-3’)

用途

PGRP-F 1	CACCACTCCCGACTTCCACCTTGC	3’RACE
			PGRP-F 2	CTCGTGGGCTACTCGGAGCAGGAC	3’RACE
PGRP-R 1	AAGGTGGAAGTCGGGAGTGGTGGAT	5’RACE
			PGRP-R 2	CGCCGAGAAATGCTATGTTGATGC	5’RACE

第一次PCR反应条件为：98℃，3min；30×(98℃，10s；60℃，20s；68℃，1min)；68℃，6min。第二次PCR以第一次PCR产物为模板进行扩增，反应条件为：95℃，3min；35×(95℃，25s；63℃，20s；72℃，1min)；72℃，6min。将扩增产物连接到pMD-19载体上得到重组质粒，并用pMD-19的通用引物M13±进行序列测定，测定结果与已知序列片段进行比较和序列拼接。序列拼接结果在NCBI上进行BlastX，结果表明得到序列与已知PGRP序列有一定的相似性，相似度约40％。

实施例2：烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP表达载体构建、表达与功能活性测定

2.1、表达载体构建

(1)根据烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP的序列和表达载体pET-28a(Novagen公司)的克隆位点，设计引物，：PGRP-BamH：CGGGATCCATTGAGGGTCGCCGAGATTCGTGGTACG(下划线为BamH I位点)；PGRP-Hind III：CCCAAGCTTCTATTCGACGAGGAGGGCGAG(下划线为Hind III位点)。

(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选

以烟粉虱dsDNA为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为：94℃，2min预变性；94℃，15s，63℃,30s,72℃，45s，35个循环；72℃延伸6min。

取2μlPCR产物，1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，Clean UP试剂盒清洁回收PCR产物。分别以PET-28a质粒载体和上述回收的DNA作为DNA模板，配制以下反应体系：Hind III限制性内切酶1μl，BamHⅠ限制性内切酶，DNA模板10μl，ddH₂O 6μl，Buffer 2μl。轻轻混匀，短暂离心，37℃孵育1h。

(3)用第二步的双酶切反应产物做琼脂糖凝胶电泳，切下大小合适的DNA条带做DNA凝胶回收。

(4)向PCR管中分别加入2.5μl双酶切后的PCR产物，0.5μl双酶切后的pET-32a质粒载体，0.5μl的T4Ligase DNA，1μl的T4Ligase DNA Buffer，5μl的ddH₂O，16℃条件下孵育，连接1h以上。

(5)将连接产物转化到感受态中，涂布于卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。挑斑培养菌液，以T7和T7ter通用引物进行r-Taq反应体系PCR检测，对于阳性样品每份取100μl留种并送测。

(6)比对测序结果，选取结果正确的留种菌液做下一步实验。

2.2、重组烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP的表达

选取测序阳性菌液在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，以1％的接种量连接到含150μg/mL卡那霉素的液体培养基中，待菌体生长至对数期，OD600约1.0时，加入100mM IPTG使其终浓度约为1mM,27℃/250rpm诱导5h后，测OD600取样，5000rpm离心5min，PBS缓冲液(pH7.0)重悬浮菌体并加入适量上样缓冲液，并用于12％SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，

2.3、重组烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP的纯化与复性

重组蛋白以可溶性的形式成功表达，利用Clontech His-TALON重力纯化试剂盒纯化得到烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP重组蛋白。纯化的烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP重组蛋白经15％的SDS-PAGE凝胶电泳分析，显示约25kDa大小，与预期大小一致。具体步骤参照试剂盒说明书。纯化蛋白用12％SDS-PAGE进行检测。

采用梯度透析的方法，使纯化的蛋白进行透析折叠，分别用：

1)含6M尿素，1％精氨酸，2％甘氨酸，1mM EDTA的TBS缓冲液(pH8.0)；

2)含4M尿素，1％精氨酸，2％甘氨酸，1mM EDTA，0.2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM还原型谷胱甘肽(GSSH)的TBS缓冲液(pH8.0)；

3)含2M尿素，1％精氨酸，2％甘氨酸，1mM EDTA，0.2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM还原型谷胱甘肽(GSSH)的TBS缓冲液(pH8.0)；

4)含1M尿素，1％精氨酸，2％甘氨酸，1mM EDTA，0.2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM还原型谷胱甘肽(GSSH)的TBS缓冲液(pH7.4)；

5)含0.5M尿素，1％精氨酸，2％甘氨酸，1mM EDTA，0.2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM还原型谷胱甘肽(GSSH)的TBS缓冲液(pH7.4)；

6)含5％甘油的TBS缓冲液(pH7.0)透析过夜。

每个缓冲液在4度缓慢透析2-3个小时。

实施例3：烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP原核重组蛋白对细菌识别活性分析

1)取生长对数期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念球菌，3500rpm离心去上清，PBS洗三次，每次5分钟。

2)用40μl纯化的目的蛋白悬浮菌液，室温静置10min，离心去上期。

3)固定液冷丙酮固定菌液，2min。

4)PBS洗三次，每次5分钟。5％BSA封闭1h。

5)PBS洗一次，BtPGRP抗体以1:500(V/V)比例0.5％BSA的缓冲液中PBS孵育1h。

6)PBS洗三次，每次5分钟，荧光免疫抗体1:400PBS缓冲液孵育1h。

PBS洗五次，每次5分钟，荧光显微镜下检测。空白对照组为未用重组蛋白处理的菌液(参见图2和图3)

实施例4：烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP原核重组蛋白抗菌活性检测

对大肠杆菌E.coli、金黄色葡萄球菌S.aureus的生长抑制实验

取生长对数期的大肠杆菌E.coli、金黄色葡萄球菌S.aureus，3500rpm离心去上清，PBS洗三次，每次5分钟。PBS稀释10⁴倍后，与纯化的BtPGRP(20μg/ml)孵育1h或2h。然后将孵育后的涂至LB培养基平板。37℃过夜培养后，观察菌落数，并计数。每个处理重复三次(参见图4)。如图所示，与对照相比，BtPGRP与大肠杆菌E.coli孵育1h后，50.4％细菌被杀死，2h后，72.7％细菌被杀死。BtPGRP与金黄色葡萄球菌S.aureus孵育1h后，32.6％细菌被杀死，2h后，59.8％细菌被杀死。以上结果表明，实验表明，重组烟粉虱肽聚糖识别蛋白BtPGRP能够杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

Claims

1.烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.由烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述烟粉虱肽聚糖识别蛋白编码基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的方法，其特征在于，是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。

4.权利要求2所述蛋白在制备抗菌类药物、食品保鲜剂或饲料添加剂中的应用。