CN105693866A - 融合抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制剂技术领域，尤其涉及一种融合抗菌肽及其应用，其生产步骤包括：步骤1）克隆载体的构建、步骤2）表达载体的构建、步骤3）3Pocec包涵体蛋白的表达、步骤4）3Pocec包涵体蛋白的纯化、步骤5）3Pocec包涵体蛋白的溶解、步骤6)3Pocec包涵体蛋白的切割和步骤7）抗菌肽单体的纯化，本融合抗菌肽经过化学切割后获得两种抗菌肽的单体又分别对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制有很强的抑制作用，这在很大程度上降低了成本，解决现有抗菌肽的大规模应用问题。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，尤其涉及一种融合抗菌肽及其应用。
背景技术
近年来，由于抗生素、化学药物的滥用、残留，饲料中抗菌药物的添加等导致细菌出现耐药性，甚至变异现象。而抗生素治疗对此无效，只能用相应的单克隆抗体进行治疗。因此寻找一些对细菌具有杀灭作用，而又不造成细菌的耐药性，对环境无毒副作用的生物治疗制剂势在必行。
抗菌肽(antibacterialpeptides，ABPs)，是生物体在抵抗病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗微生物活性的小分子多肽。抗菌肽是动物体液免疫***中存在的具有广谱杀菌，对病毒、某些肿瘤、真菌具有一定抑制作用的一类膜活性多肽，是机体天然免疫***的重要组成部分。
当前获得抗菌肽的方法主要为天然抗菌肽的提取和基因工程表达。由于抗菌肽为体内诱导合成，生物体中含量较低，导致从生物体内直接提取的难度大，对技术和成本的要求高，难以规模化生产；同时抗菌肽一般为阳离子多肽，易被蛋白酶降解，因此表达时通常添加一些蛋白标签，以提高表达量并可简化分离纯化过程。然而融合蛋白通常需要蛋白酶或化学裂解将抗菌肽从蛋白标签上切下后才可发挥抗菌作用。这些问题在一定程度上限制了抗菌肽的大规模应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足而发明的一种融合抗菌肽及其应用。
本发明是这样实现的：一种融合抗菌肽,其特征在于：包括天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39。
所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。
所述融合抗菌肽的核苷酸序列如SQEIDNO.2所示。
一种含有融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体。
一种制造上述融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括
步骤1）克隆载体的构建：
1.1根据公布的天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列，以E.coli标准密码子为参考设计抗菌肽的基因序列；并在基因序列两端分别引入BglⅡ、BamHⅠ同尾酶和XholⅠ的酶切位点，化学合成的如SEQIDNO.2所示的基因序列；将用BamHⅠ和XholⅠ双酶切合成的基因序列连接至用BamHⅠ和XholⅠ双酶切的pMD18载体并转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-Pocec克隆载体。
1.2将pMD18-Pocec克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-Pocec克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-2Pocec克隆载体。
1.3将pMD18-2Poce克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-2Poce克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，即得到如SEQIDNO.3所示的基因序列，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-3Pocec克隆载体。
步骤2）表达载体的构建：
将pMD18-3Pocec克隆载体和pET-32a载体均用BglⅡ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-3Pocec克隆载体、pET-32a载体相连接，得到pET-32a-3Pocec表达载体，将pET-32a-3Pocec表达载体转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛选，得到E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec。
步骤3）3Pocec包涵体蛋白的表达：
将E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec按照1：100—1:106的比例接种在含氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜后再次按照1：100比例接种至含氨苄青霉素的LB培养基，在37℃条件下培养至600nm处OD值0.4-0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.2-0.3mmol/L以诱导融合抗菌肽包涵体蛋白的表达。
步骤4）3Pocec包涵体蛋白的纯化：
将步骤3）中加入IPTG诱导的E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec菌体收集后离心，弃上清，菌体洗涤2—3次后重悬，进行超声破碎；所述超声破碎的条件是：功率250W，工作5sec，间隔5sec，共20min；然后将破碎后的菌体于离心机温度4℃、12000rpm条件下离心20min，弃掉上清液，在沉淀中加入含有1%TritonX-100的PBS搅拌洗涤30min，于4℃，12000rpm离心15min，弃去上清液，重复一次；再用PBS搅拌洗涤一次，于4℃，12000rpm离心15min，弃去上清液，得到包涵体蛋白沉淀。
步骤5）3Pocec包涵体蛋白的溶解：
将步骤4）中得到的包涵体蛋白沉淀用8M尿素溶解液溶解，并于室温放置30min，然后4℃，1500rpm离心30min，留取上清液。
步骤6)3Pocec包涵体蛋白的切割:
将步骤5)得到的上清液中直接加入羟胺切割液，使终浓度为：盐酸羟胺-1.0mol/L，Ches-0.1mol/L，pH9.3（35℃），将混合后的溶液置于35℃水中，水浴中8—9h，得到融合抗菌肽单体溶液，所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。
步骤7）抗菌肽单体的纯化：
将步骤6）中切割完成的融合抗菌肽单体溶液用截留量为1kd的滤膜，pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl进行超滤，除去羟胺切割液与尿素，得到抗菌肽单体。
所述的融合抗菌肽的应用，添加在成品或半成品饲料中作为抑菌剂和除霉剂。
进一步，所述的融合抗菌肽的应用，所述的融合抗菌肽的核苷酸序列运用转基因技术及真核表达技术导入到饲料作物本身的核苷酸序列中，使饲料作物本身大量表达出融合抗菌肽。
本发明具有以下优点：
首先，通过将对革兰氏阳性菌有较强抑制作用的天蚕素cm4和对革兰氏阴性菌有较强抑制作用的猪源抗菌肽PR-39的核苷酸序列进行优化组合，优化去除稀有密码子以便于表达，并在两端加入保护性碱基，同时添加同尾酶（BglⅡ，BamHⅠ）和XholⅠ的酶切位点及Asn-Gly羟胺化学切割位点，得到所设计的基因序列。
然后，通过化学合成方法得到所设计融合抗菌肽的核苷酸序列。将所述的融合抗菌肽的核苷酸序列连接到克隆载体上，通过同尾酶的作用，重复连接2次融合抗菌肽的核苷酸序列从而得到含有3段融合抗菌肽核苷酸序列的重组核苷酸序列。
其次，将重组的核苷酸序列连接到表达载体上。
最后，将含有融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体转化宿主细胞，培养转化子，从转化子培养物中获得含有融合抗菌肽的包涵体蛋白。将得到的包涵体蛋白进行纯化、化学切割和复性后即得到两种抗菌肽单体。
经过大量的实验研究优化，将所设计的基因序列进行3次重复串联，增大所表达的融合蛋白的分子量，一方面可以以包涵体蛋白的形式表达，从而避免有活性的抗菌肽单体在表达后对表达菌种生产的抑制而限制了表达量的提高；另一方面将融合蛋白进行化学切割后，可获得的重复倍数的融合抗菌肽单体，使得终产物的得率进一步提高。同时经过化学切割后获得两种抗菌肽的单体又分别对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制有很强的抑制作用，这在很大程度上降低了成本，解决现有抗菌肽的大规模应用问题。
附图说明
图1为合成抗菌肽的PCR产物电泳图。
图2为重组表达载体构建过程示意图。
图3为表达载体的双酶切鉴定的电泳图。
图4为3Pocec包涵体蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌试验结果。
具体事实方式
实施例1：
所述的融合抗菌肽的制备方法，包括
步骤1）克隆载体的构建：
如图1、图2所示，
1.1根据公布的天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列，将两者串联，以E.coli标准密码子为参考设计抗菌肽的基因序列；并在基因序列两端分别引入BglⅡ、BamHⅠ同尾酶和XholⅠ的酶切位点，化学合成的如SEQIDNO.2所示的基因序列；将用BamHⅠ和XholⅠ双酶切合成的基因序列连接至用BamHⅠ和XholⅠ双酶切的pMD18载体并转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-Pocec克隆载体。
1.2将pMD18-Pocec克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-Pocec克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-2Pocec克隆载体。
1.3将pMD18-2Poce克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-2Poce克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，即得到如SEQIDNO.3所示的基因序列，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-3Pocec克隆载体。
步骤2）表达载体的构建：
将pMD18-3Pocec克隆载体和pET-32a载体均用BglⅡ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-3Pocec克隆载体、pET-32a载体相连接，得到pET-32a-3Pocec表达载体，将pET-32a-3Pocec表达载体转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛选，得到E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec。
步骤3）3Pocec包涵体蛋白的表达：
将E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec按照1：100的比例接种在含氨苄青霉素的LB培养基上，培养过夜后按照1：100比例接种至含氨苄青霉素的LB培养基，培养至600nm处OD值为0.6，加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）使其终浓度为0.2mmol/L以诱导融合抗菌肽包涵体蛋白的表达；不同条件下诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图3所述。
步骤4）3Pocec包涵体蛋白的纯化：
将步骤3）中加入IPTG诱导的E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec菌体收集后离心，弃上清，菌体洗涤3次后重悬，进行超声破碎；所述超声破碎的条件是：功率250W，工作5sec，间隔5sec，共20min；然后将破碎后的菌体于离心机4℃工作环境，12000rpm，离心20min，弃上清液，在沉淀中加入含有1%TritonX-100的PBS搅拌洗涤30min，于4℃，12000rpm离心15min，弃去上清液，重复一次；再用PBS搅拌洗涤一次，于4℃，12000rpm离心15min，弃去上清液，得到包涵体蛋白沉淀。
步骤5）3Pocec包涵体蛋白的溶解：
将步骤4）中得到的包涵体蛋白沉淀用8M尿素溶解液溶解，并于室温放置30min，然后4℃，1500rpm离心30min，留取上清液。
步骤6)3Pocec包涵体蛋白的切割:
将步骤5)得到的上清液中直接加入羟胺切割液，使终浓度为：盐酸羟胺-1.0mol/L，Ches-0.1mol/L，pH9.3，35℃，将混合后的溶液置于35℃水中，水浴中9h，得到融合抗菌肽单体溶液，所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。
将步骤6）中切割完成的融合抗菌肽单体溶液用截留量为1kd的滤膜，pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl进行超滤，除去羟胺切割液与尿素，得到抗菌肽单体。
实施例2：抑菌活性检测与应用
1.1抑菌活性的检测
采用琼脂糖平板扩散法检测抗菌活性。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别在试管中扩增培养，将菌液适当稀释后分别涂布在MHA平板上，晾干后在平板上放入不锈钢牛津杯，杯中分别加入所获得的抗菌肽20μL，28℃过夜培养并观察抑菌圈大小，如图4所示，结果表明本设计的抗菌肽融合蛋白经切割纯化后对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌具有体外抑菌活性。
1.2融合蛋白3Pocec的应用前景
鉴于本设计的融合抗菌肽融合蛋白表达量大，且经化学切割后对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑制作用，我们考虑将其作为一种优质的饲料添加剂来使用。除了可添加在成品或半成品饲料中作为抑菌剂和除霉剂外，远期可运用转基因及真核表达技术通过将优选的抗菌肽基因序列导入到饲料作物中，使饲料作物本身即可大量表达，从而减少操作步骤以获得更为高效的生产效率。
序列表
<110>河南欧普生物科技有限公司
<120>融合抗菌肽及其应用
<160>3
<170>PatentInVersion3.3
<210>1
<211>89
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
GluAspIleThrValValGlyLysGerGerLysLysGerLysLys
151015
IleValArgThrGerValThrGerValIleLysIleValArgIle
202530
IleIleIleIleValArgIleIleProGerThrValValValVal
354045
ArgValArgArgThrCysArgValIleValIleIleArgGerGer
505560
ArgArgValCysArgArgValTyrHisGlnGlaPheHisGlnGly
657075
GerGlaGlaAspGerArgThrGlaAspProAsnGerGerGer
808589
<210>2
<211>269
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GAAGATCTAACGGTCGTTGGAAAATCTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGAACATCC60
GTGACGGTATCGTTAAAGCTGGTCCGGCTGTTGCTGTTGTTGGTCAGGCTGCTACCATCA120
ACGGTCGTCGTCGTCCGCGTCCGCCGTACCTGCCGCGTCCTCGTCCTCCTCCGTTCTTCC180
CGCCGCGTCTGCCGCCGCGTGCTTTCCACCAAGGTTCCCAAAGGTTCCCAAAGGTTCCCA240
CGAACGGCGGATCCTAATAGCTCGAGCGG269
<210>3
<211>761
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GAAGATCTAACGGTCGTTGGAAAATCTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGAACATCC60
GTGACGGTATCGTTAAAGCTGGTCCGGCTGTTGCTGTTGTTGGTCAGGCTGCTACCATCA120
ACGGTCGTCGTCGTCCGCGTCCGCCGTACCTGCCGCGTCCTCGTCCTCCTCCGTTCTTCC180
CGCCGCGTCTGCCGCCGCGTGCTTTCCACCAAGGTTCCCAAAGGTTCCCAAAGGTTCCCA240
CGAACGGCGGATCTAACGGTCGTTGGAAAATCTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGA300
ACATCCGTGACGGTATCGTTAAAGCTGGTCCGGCTGTTGCTGTTGTTGGTCAGGCTGCTA360
CCATCAACGGTCGTCGTCGTCCGCGTCCGCCGTACCTGCCGCGTCCTCGTCCTCCTCCGT420
TCTTCCCGCCGCGTCTGCCGCCGCGTATACCACCAGGCTTTCCACCAAGGTTCCCACCAC480
GATTCCCGAACGGCGGATCTAACGGTCGTTGGAAAATCTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTG540
GTCAGAACATCCGTGACGGTATCGTTAAAGCTGGTCCGGCTGTTGCTGTTGTTGGTCAGG600
CTGCTACCATCAACGGTCGTCGTCGTCCGCGTCCGCCGTACCTGCCGCGTCCTCGTCCTC660
CTCCGTTCTTCCCGCCGCGTCTGCCGCCGCGTATACCACCAGGCTTTCCACCAAGGTTCC720
CACCACGATTCCCGAACGGCGGATCCTAATAGCTCGAGCGG761
Claims (8)
1.一种融合抗菌肽,其特征在于：包括天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39。
2.根据权利要求1所述的融合抗菌肽：其特征在于：所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的融合抗菌肽，其特征在于：所述融合抗菌肽的核苷酸序列如SQEIDNO.2所示。
4.一种含有根据权利要求3所述的融合抗菌肽的核苷酸序列的表达载体。
5.一种根据权利要求1所述的融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括
步骤1）克隆载体的构建：
1.1根据公布的天蚕素cm4和猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列，以E.coli标准密码子为参考设计抗菌肽的基因序列；并在基因序列两端分别引入BglⅡ、BamHⅠ同尾酶和XholⅠ的酶切位点，化学合成的如SEQIDNO.2所示的基因序列；将用BamHⅠ和XholⅠ双酶切合成的基因序列连接至用BamHⅠ和XholⅠ双酶切的pMD18载体并转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-Pocec克隆载体；
1.2将pMD18-Pocec克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-Pocec克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-2Pocec克隆载体；
1.3将pMD18-2Poce克隆载体用BamHⅠ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-2Poce克隆载体与用BglⅡ和XholⅠ双酶切的合成基因序列进行连接，即得到如SEQIDNO.3所示的基因序列，将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，得到pMD18-3Pocec克隆载体；
步骤2）表达载体的构建：
将pMD18-3Pocec克隆载体和pET-32a载体均用BglⅡ和XholⅠ双酶切，然后将双酶切后的pMD18-3Pocec克隆载体、pET-32a载体相连接，得到pET-32a-3Pocec表达载体，将pET-32a-3Pocec表达载体转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板筛选，得到E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec；
步骤3）3Pocec包涵体蛋白的表达：
将E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec按照1：100—1:106的比例接种在含氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜后再次按照1：100比例接种至含氨苄青霉素的LB培养基，在37℃条件下培养至600nm处OD值0.4-0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.2-0.3mmol/L以诱导融合抗菌肽包涵体蛋白的表达；
步骤4）3Pocec包涵体蛋白的纯化：
将步骤3）中加入IPTG诱导的E.coliBL21（DE3）/pET-32a-3Pocec菌体收集后离心，弃上清，菌体洗涤2—3次后重悬，进行超声破碎；所述超声破碎的条件是：功率250W，工作5sec，间隔5sec，共20min；然后将破碎后的菌体于离心机温度4℃、12000rpm条件下离心20min，弃掉上清液，在沉淀中加入含有1%TritonX-100的PBS搅拌洗涤30min，于4℃，12000rpm离心15min，弃去上清液，重复一次；再用PBS搅拌洗涤一次，于4℃，12000rpm离心15min，弃去上清液，得到包涵体蛋白沉淀；
步骤5）3Pocec包涵体蛋白的溶解：
将步骤4）中得到的包涵体蛋白沉淀用8M尿素溶解液溶解，并于室温放置30min，然后4℃，1500rpm离心30min，留取上清液；
步骤6)3Pocec包涵体蛋白的切割:
将步骤5)得到的上清液中直接加入羟胺切割液，使终浓度为：盐酸羟胺-1.0mol/L，Ches-0.1mol/L，pH9.3（35℃），将混合后的溶液置于35℃水中，水浴中培养8—9h，得到融合抗菌肽单体溶液，所述的融合抗菌肽的氨基酸序列如SQEIDNO.1所示。
6.根据权利要求5所述的融合抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括抗菌肽单体的纯化：
将步骤6）中切割完成的融合抗菌肽单体溶液用截留量为1kd的滤膜，pH8.0的20mmol/L的Tris-HCl进行超滤，除去羟胺切割液与尿素，得到抗菌肽单体。
7.根据权利要求1、2中任意一项所述的融合抗菌肽的应用，其特征在于：添加在成品或半成品饲料中作为抑菌剂和除霉剂。
8.根据权利要求3所述的融合抗菌肽的应用，其特征在于：所述的融合抗菌肽的核苷酸序列运用转基因技术及真核表达技术导入到饲料作物本身的核苷酸序列中，使饲料作物本身大量表达出融合抗菌肽。
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