CN104513300A

CN104513300A - 一株生防枯草芽胞杆菌表面活性素的分离纯化方法

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Publication number: CN104513300A
Application number: CN201310444932.0A
Authority: CN
Inventors: 罗楚平; 周华飞; 陈志谊; 王晓宇; 刘永锋; 刘邮洲; 张荣胜
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2015-04-15

Abstract

本发明涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bs916胞外抗菌脂肽表面活性素及其分离纯化方法。表面活性素的分子量为1007.6、1021.7和1035.7，属于相差一个亚甲基的同系物。其分离纯化的方法是：首先通过基因敲除构建Bs916合成其它脂肽抗生素能力丧失的突变株BBFM；其次从BBFM的发酵液中采用酸沉淀和甲醇抽提制备表面活性素的粗提物，再次经过NH₂和C18层析柱分离纯化表面活性素。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析表明制备的表面活性素达到电泳纯和色谱纯。纯化的表面活性素对开发为抗真菌、抗细菌药物具有较高的研究和应用价值，也可用作为生物化学上的标准品使用。

Description

一株生防枯草芽胞杆菌表面活性素的分离纯化方法

技术领域：

本发明涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916的胞外脂肽抗生素表面活性素的分离纯化方法。

背景技术

枯草芽胞杆菌是植物和土壤生态中的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。由于枯草芽胞杆菌胞外能产生丰富的抗菌代谢产物，同时由于其具有生长速度快，存活时间长，对酸、碱、高温、紫外线以及电磁辐射等不良环境的耐受能力强，营养要求简单，安全无毒等优点，因此被广泛的应用于植物真菌病害和细菌病害的防治。

枯草芽胞杆菌分泌的抗菌代谢产物主要有三大类，其一是通过核糖体合成途径合成的多肽类小分子化合物；其二是通过非核糖体合成途径的合成的脂肽类抗生素；其三是合成的一些非蛋白质性质的杂合抗生素。

脂肽类抗生素是一类由亲水性环状短肽头部和长链疏水性脂肪酸尾部组成的双亲性次生代谢产物，具有抗菌活性和溶血性能，在医药、农药和工业上具有广泛的应用价值。脂肽类抗生素根据其化学结构的差异可分为表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。

表面活性素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有13～15个碳原子β-羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。表面活性素表现出较强溶血活性、抑制细菌和病毒的活性。伊枯草素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链与含有14～17β-氨基脂肪酸链相连形成的化合物。伊枯草素也具有较强的溶血活性和强的抗真菌活性。泛革素家簇结构的特点是由10个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有14～18个β-羟基饱和或非饱和的脂肪酸交联形成内酯环。泛革素的溶血作用没有表面活性素和伊枯草素强烈，但表现出强烈的抗真菌活性和弱的抗细菌和病毒活性。

脂肽抗生素的理化性质稳定，如：热稳定好，在121℃高压灭菌30min，活性还能保持在95％；对胰蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶不敏感；对氯仿等有机溶剂具有耐受性；抗紫外照射。脂肽抗生素具有如此高的稳定性，与其分子量小和特殊的环状结构有关。

目前通过构建产脂肽抗生素缺失突变株及突变株抗菌性能的研究表明脂肽抗生素是枯草芽胞杆菌拮抗病原真菌的主要因子。一株具有优良拮抗性能的枯草芽胞杆菌菌株通常能同时合成分泌表面活性素、伊枯草素和泛革素；其中任一一种脂肽类抗生素合成能力的缺失都会导致突变株抗真菌活性不同程度的下降；当其中两种或者三种脂肽类抗生素合成能力的全部缺失，会极大的降低或者导致突变株完全丧失抗真菌活性。表面活性素、伊枯草素和泛革素对植物病原真菌具有协同增效作用。

通过构建表面活性素合成能力丧失突变株，及对表面活性素的生物学功能研究表明表面活性素不仅是生防枯草芽胞杆菌抗菌的关键因子之一，而且表面活性素还具有极强的溶血活性和抗病毒的活性；表面活性素基因簇的突变还能影响枯草芽胞杆菌生物膜的形成，感受态的形成及定殖能力等生命现象。最近研究表明表面活性素还具有抗肿瘤的活性，因此表面活性素在医药、工业和农业上具有极其重要的应用前景。建立一种高效的分离方法纯化表面活性素的方法具有重要的应用价值。

通常筛选到的一株高产表面活性素的枯草芽胞杆菌菌株，其还能分泌伊枯草素和泛革素，由于这三类脂肽类化合物的理化性质相近，因此不容易通过简单的纯化方法将表面活性素和伊枯草素、泛革素进行高效分离。

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916是江苏省农业科学院20世纪90年代分离的生防菌，对水稻纹枯病具有很好的防治效果，已经成功进入商业化生产10多年，产生了巨大的经济效益。该菌株于2002年09月30日在中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0808。经过前期研究表明Bs916能分泌产生表面活性素、伊枯草素家簇的杆菌霉素L和泛革素三类脂肽抗生素，是Bs916具有抗真菌活性的关键因素。本发明通过构建基因突变株和色谱分离技术相结合建立一种从Bs916中分离纯化表面活性素的新方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供枯草芽胞杆菌抗菌脂肽表面活性素，以及一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽表面活性素的分离纯化方法。

本发明的目的是这样实现的：枯草芽胞杆菌抗菌脂肽表面活性素，其特征在于：从枯草芽胞杆菌Bs916的杆菌霉素L和泛革素基因的双突变株BBFM的胞外产物中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定包含有分子量为1007.6、1021.7和1035.7等相差一个亚甲基(-CH₂)的表面活性素同系物。

一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽的分离纯化方法，其特征在于：

a、以新霉素抗性基因和氯霉素抗性基因作为筛选标记基因，以杆菌霉素L和泛革素合成基因部分核酸序列作为单交换同源片段，构建敲除载体pUC19-neo-bac和pSG1164-Fen；将构建的单交换载体依次转化至枯草芽胞杆菌Bs916，构建杆菌霉素L和泛革素基因簇双突变株BBFM。突变株BBFM合成杆菌霉素L和泛革素的能力丧失，只能分泌产生表面活性素。

b、将双突变株BBFM转接到LB培养液中，在28℃、180r/min条件下振荡培养72h，发酵液离心除去菌体，用浓盐酸调至pH2.0沉淀过夜。8000g离心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物经0.22μmol·L^-1微孔滤膜后，即为粗制备的表面活性素样品。

c、将粗提物采用去离子水稀释为含30％甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH₂固相萃取柱，分别用含50％甲醇水溶液，100％甲醇，含0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脱。在紫外波长210nm处检测，其中在含1％甲酸甲醇洗脱溶液中检测到表面活性素。

d、将含1％甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩、再用去离子水稀释为30％甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用梯度洗脱30％，50％，70％，90％甲醇水溶液洗脱。在紫外光OD210nm处检测，其中在含90％甲醇水洗脱溶液中检测到表面活性素。

e、将90％甲醇水洗脱溶液氮气吹干后再用去离子水稀释为40％甲醇水溶液，再上样于C18固相萃取柱；采用10倍柱体积的75％，80％，85％，90％，95％，100％甲醇水溶液梯度洗脱，其中在80％、85％洗脱液得到目标化合物表面活性素。合并80％、85％洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，得到表面活性素的纯品。

f、提取的表面活性素采用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有一条带。提取的表面活性素高效液相色谱的检测条件为：采用C18(5μm；250by4.6mm；VYDAC218TP；VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸(80：20：0.5vol/vol)；流速为1mL·min-1；紫外检测波长为210nm；已经达到色谱纯。

本发明的优点在于：本发明建立了一种从生防枯草芽胞杆菌Bs916中分离纯化获得胞外抗菌脂肽表面活性素的方法。该方法通过基因敲除和色谱分离建立了高效快速制备高纯度的表面活性素样品的技术体系。表面活性素纯品具有抑菌谱广、热稳定性好、对蛋白酶不敏感、对高压和有机溶剂都具有一定耐受性的特点，对于开发广谱抗真菌、细菌药物具有极高的研究和应用价值。

附图说明

图1表面活性素化学结构示意图

图2杆菌霉素L合成操纵子单交换突变示意图

图3泛革素合成操纵子单交换突变示意图

图4抗菌脂肽表面活性素的Tricine-SDS-PAGE电泳图

图5抗菌脂肽表面活性素的高效液相色谱分析

图6电喷雾四级杆飞行时间串联质谱对表面活性素同系物的解析图

图7表面活性素的溶血活性

图8表面活性素抗菌活性

具体实施方式：

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1杆菌霉素L和泛革素合成基因突变株的构建

采用酶切方法从质粒载体pBEST501切下新霉素抗性基因片段，克隆至pUC19质粒载体构建重组质粒载体pUC19-neo；采用多聚酶链式反应(PCR)方法从枯草芽胞杆菌Bs916基因组DNA中扩增杆菌霉素L合成基因部分片段IBacD，扩增片段经过酶切和酶连接克隆至pUC19-neo质粒载体，构建单交换敲除质粒载体pUC19-neo-bac；采用多聚酶链式反应(PCR)方法从枯草芽胞杆菌Bs916基因组DNA中扩增泛革素合成基因部分片段IFenA，扩增片段经过酶切和酶连接克隆至pSG1164质粒载体，构建单交换敲除质粒载体pSG1164-Fen；构建的单交换敲除质粒载体pUC19-neo-bac、pSG1164-Fen通过化学转化的方法依次转化至野生型枯草芽胞杆菌Bs916，筛选正确的转化子，获得杆菌霉素L和泛革素合成基因的双突变株BBFM。

实施例2表面活性素粗提物的制备

将生防枯草芽胞杆菌Bs-916的双突变株BBFM转接到LB培养液中(所述的LB培养液，为胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，在28℃、180r/min条件下振荡培养72h。发酵液在4℃，5000r/min，离心30min除去菌体，对上清夜用浓盐酸调至pH2.0沉淀过夜。8000r/min离心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物经0.22μmol·L^-1微孔滤膜后，即为粗制备的表面活性素样品。

实施例3表面活性素的纯化

将粗提物采用去离子水稀释为含30％甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH₂固相萃取柱，分别用含50％甲醇水溶液，100％甲醇，含0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在1％甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。

将含1％甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为30％甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用3倍柱体积的40％，50％，60％，70％，90％甲醇水溶液梯度洗脱，其中在含90％甲醇水洗脱液中得到表面活性素的纯品，纯度为95％，共100mg。

90％甲醇水洗脱液氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为40％甲醇水溶液，再上样于C18固相萃取柱；采用10倍柱体积的75％，80％，85％，90％，95％，100％甲醇水溶液梯度洗脱，其中在80％洗脱液、85％洗脱液得到目标化合物表面活性素A、B、C的纯化物。上述洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，分别得到表面活性素的纯品80mg，纯度约为98％。实施例4表面活性素的Tricine-SDS-PAGE电泳

Tricine-SDS-PAGE中分离胶浓度为16.5％，夹层胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％。将表面活性素纯品1.0μg和蛋白质标准品10μL上样于凝胶中加样孔，然后在4℃中，110V电泳4小时；电泳后凝胶采用考马斯亮蓝染色，然后采用乙酸：甲醇：水(1：1：8)溶液脱色至呈现出清晰的条带。

实施例5表面活性素的高效液相色谱分析

提取的表面活性素高效液相色谱的检测条件为：采用C18(5μm；250by4.6mm；VYDAC218TP；VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸(80：20：0.5vol/vol)；流速为0.5mL·min-1；紫外检测波长为210nm。表面活性素同系物A的平均保留时间分别为29min；表面活性素同系物B平均保留时间为42min；表面活性素同系物C平均保留时间为56min。

实施例6表面活性素的质谱分析

将分离纯化后的表面活性素甲醇溶解后，通过电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2，在正离子方式下测定结果显示表面活性素包含有3个主要的质荷比峰(m/z)，即1008.6、1022.7、1036.7，它们是分子量为1007.6、1021.7和1035.7，属于相差一个亚甲基(-CH2)的表面活性素同系物A、B、C。

实施例7表面活性素的溶血活性

取不同浓度的表面活性素溶液滴加至含5％新鲜绵阳血细胞的血清琼脂平板中，37℃培养至呈现透明溶血圈。

实施例8表面活性素的抗菌性能

采用平板对峙法和带毒平板法测定表面活性素对水稻纹枯病、西瓜枯萎病菌都具有一定的抑制效果，抑制的IC₅₀分别为23.5μg/ml和30.2μg/ml。

Claims

1.一株枯草芽胞杆菌胞外脂肽抗生素表面活性素，其特征在于：从枯草芽胞杆菌胞外产物中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定，分子量为1007.6、1021.7和1035.7等相差一个亚甲基(-CH2)的表面活性素同系物。

2.一种如权利要求1所述的一株枯草芽胞杆菌胞外表面活性素的分离纯化方法，其特征在于：

a、从保藏号为CGMCC No.0808的枯草芽胞杆菌B.subtilis916中构建脂肽抗生素杆菌霉素L，泛革素合成缺失的双突变株BBFM；

b、从双突变株BBFM的发酵液中采用酸沉淀甲醇抽提分离表面活性素的粗提物；

c、将粗提物采用去离子水稀释为含30％甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH₂固相萃取柱，分别用含50％甲醇水溶液，100％甲醇，含0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脱；在紫外光OD210nm处检测，其中在含1％甲酸甲醇洗脱溶液中检测到表面活性素；

d、将含1％甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩、再用去离子水稀释为30％甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用梯度洗脱30％，50％，70％，90％甲醇水溶液洗脱。在紫外光OD210nm处检测，其中在含90％甲醇水洗脱溶液中检测到表面活性素；

e、将90％甲醇水洗脱溶液氮气吹干后再用去离子水稀释为40％甲醇水溶液，再上样于C18固相萃取柱；采用10倍柱体积的75％，80％，85％，90％，95％，100％甲醇水溶液梯度洗脱，其中在80％、85％洗脱液得到目标化合物表面活性素，合并80％、85％洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，得到表面活性素的纯品；

f、提取的表面活性素采用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有一条带。提取的表面活性素高效液相色谱的检测条件为：采用C18(5μm；250by4.6mm；VYDAC218TP；VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸(80：20：0.5vol/vo1)；流速为1mL·min-1；紫外检测波长为210nm；已经达到色谱纯。

3.根据权利要求2所述的一种枯草芽胞杆菌胞外表面活性素的分离纯化方法，其特征在于：从保藏号为CGMCC No.0808的双突变株BBFM中分离脂肽粗提物是：将突变株BBFM转接到LB培养液中，在28℃、180r/min条件下振荡培养72h，发酵液离心除去菌体，用浓盐酸调至pH2.0沉淀过夜；8000g离心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物经0.22μmo1·L^-1微孔滤膜后，即为粗制备的表面活性素样品。