CN104502553A - 一种检测黄曲霉毒素m1的磁性免疫层析试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测黄曲霉毒素M1的磁性免疫层析试剂盒，包括至少一个试纸条和一个超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液；所述试纸条由反应垫、样品垫1、样品垫2、吸水垫依次相互交错粘在底板上并覆盖透明塑料膜组装而成；其中反应垫上预包被有AFM1蛋白偶联物的检测线和预包被了可与AFM1抗体结合的抗抗体的质控线；所述超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体为AFM1抗体和超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体。本发明还涉及本发明试剂盒的制备方法及其用于检测乳及乳品中黄曲霉毒素M1的用途。本发明以磁性颗粒为标记物引入免疫层析技术中，检测快速、操作简便、线性范围广、灵敏度高。

Description

一种检测黄曲霉毒素M1的磁性免疫层析试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于食品检测领域。具体而言，本发明涉及一种检测黄曲霉毒素M1的磁性免疫层析试剂盒、其制备方法以及该试剂盒用于检测黄曲霉毒素M1的用途。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌(Aspergillus flavs)、寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)和集蜂曲霉(Aspergillus nonius)产生的一组高毒和强致癌的次生代谢产物。黄曲霉毒素M1(AflatoxinM1，AFM1)是哺乳动物摄入被黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)污染的食品或饲料之后，在体内肝微粒体单氧化酶的催化下，通过细胞色素P450的调节作用，末端呋喃环C-10被羟基化而生成。由于其主要存在于人类尤其是更容易受到毒素损害的婴幼儿的日常消费品乳制品中，AFM1的污染问题引起了社会的广泛关注。2002年，AFM1致癌的等级已被国际癌症研究机构定为一类致癌物。

目前AFM1检测技术主要包括仪器分析法与免疫分析技术。仪器分析法有高效液相色谱荧光检测法，高效液相色谱-质谱联用法。这些分析方法具有较高的灵敏度和特异性，但是需要复杂的提取净化步骤和较贵重复杂的仪器，样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备。免疫分析技术主要有酶联免疫吸附法和免疫层析技术。酶联免疫吸附法(ELISA)在AFM1检测中已经广泛应用，但是存在操作程序复杂，容易出现假阳性的结果。免疫层析技术是基于抗体抗原相互结合原理的一种色谱分析技术，兴起于上世纪九十年代，实验操作简单，仅需加样一个步骤，反应迅速。目前应用的标记物主要有胶体金颗粒。胶体金颗粒可使检测线区域显示一定的颜色，从而实现特异性的检测。但由于结果通常是人眼目测观察，容易受到观察者主观判断的影响，灵敏度较低，结果准确度不高。

磁性免疫层析技术(Magnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一种定量检测技术，它以超顺磁微粒代替胶体金标记物来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁微粒上的目标物来提供对生物样品的定量检测数据。该技术与传统技术相比具有以下优势：灵敏度较目测法高10-1000倍；测量结果可在至少4个数量级的范围内呈线性；检测仪器体积小，尺寸仅书本大小；标记物磁微粒由聚合物包被，不随时间而衰变，分析结果可存档并重新检测。该技术弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只定性不能定量的缺点，代表了当前食品检测技术的发展方向。

本发明目的是将磁性免疫层析技术应用在AFM1分析中，简化操作步骤，缩短检测时间，提高检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测黄曲霉毒素M1的磁性免疫层析试剂盒。所述试剂盒包括至少一个本发明的试纸条和一种超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液。

所述试纸条由反应垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地，例如相互交错2mm，粘在底板上并在上层覆盖透明塑料膜组装而成，所述样品垫1与样品垫2连接，反应垫一端连接样品垫2，另一端与吸水垫相连。所述硝酸纤维素膜预包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有AFM1抗原，所述质控线含有能与所述AFM1抗体特异性结合的抗抗体。

所述反应垫为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的长度可以为25mm-35mm，例如为35mm。

所述AFM1抗体为AFM1单克隆抗体或AFM1多克隆抗体，优选为AFM1单克隆抗体。

所述AFM1抗原为AFM1半抗原与载体蛋白的偶联物，所述AFM1半抗原为AFM1，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或人血清蛋白或钥孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白，优选为BSA。

所述AFM1抗体特异性结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体，优选为羊抗鼠IgG抗体。

所述样品垫1为纤维素膜或玻璃纤维膜或玻璃纤维与纤维素的混合膜。

所述样品垫2为经样品垫处理液预处理的纤维素膜或玻璃纤维膜或玻璃纤维与纤维素的混合膜。所述样品垫处理溶液例如为含有0.5％-2％BSA，1％-5％蔗糖，0.5％-3％曲拉通X-100的0.01M PBS，pH7.0-7.6。

所述吸水垫为纤维素膜。

所述超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液为AFM1抗体与超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体溶解在保存液中形成的溶液。所述保存液例如为1％BSA，0.5％Tween-20，5％蔗糖的pH8.5的硼酸缓冲液。

所述超顺磁性复合粒子为Fe₃O₄纳米粒子，粒径为50-300nm，优选为100-200nm。所述超顺磁性复合粒子表面带有易于与AFM1抗体偶联的基团，这些基团可以是羧基、氨基等基团，优选的基团是羧基基团。

本发明还涉及用于制备本发明的检测黄曲霉毒素M1的磁性免疫层析试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

I.超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体的制备：

(1)将超顺磁性复合粒子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和浓度例如为0.1M、pH＝4.7的2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲液混匀，EDC与NHS的摩尔比为1∶2，在37℃下反应大约30min，得到活化的磁性粒子；

(2)将步骤(1)得到的活化的磁性粒子、AFM1抗体和浓度为50mM pH＝8.5的硼酸缓冲液混匀，37℃反应3h，得到偶联后磁性粒子反应液；(3)向步骤(2)中的反应液加入含有BSA的例如50mM pH＝8.5的硼酸缓冲液，使BSA终浓度为5％，在37℃下反应30min，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；再将封闭后的磁性粒子进行洗涤、保存，得到超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体；所述洗涤液为50mM pH＝8.5的硼酸缓冲液，所述保存液为1％BSA，0.5％Tween-20，5％蔗糖的pH8.5的硼酸缓冲液；

II.反应垫的处理：用例如含有1％-2％BSA的0.01M PBS、pH7.0-7.6的包被缓冲液将AFM1抗原及抗抗体分别稀释至例如0.1-2mg/mL的浓度，并通过定量喷液装置例如以0.8-1.5μL/cm的量分别将二者喷到硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，AFM1抗原与抗体的间隔(即检测线和质控线之间的间隔)在0.5-1cm之间，喷完后晾干，放入干燥器中备用；

III.样品垫2的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡例如大约0.5-2小时后取出，在大约25℃-35℃烘干大约6-12小时；

其中所述样品垫处理溶液例如为含有大约0.5％-2％BSA，1％-5％蔗糖，0.5％-3％曲拉通X-100的0.01M PBS，pH7.0-7.6。

IV.试纸条的组装：将反应垫、样品垫、吸水垫依次相互交错例如2mm粘在含有不干胶的底板上并在上层覆盖透明塑料膜，得到试纸板，并切割成宽度为例如3-5mm的试纸条。

本发明进一步涉及根据本发明磁性免疫层析试剂盒用于检测AFM1的用途，所述试剂盒可以用于检测乳及乳制品，例如牛奶、奶粉等中的AFM1。

在实际应用中，将本发明试剂盒中偶联有AFM1抗体的磁颗粒与样品液混合，施加于试纸条上，按免疫层析原理对样品进行检测，结合读磁仪进行检测，即可完成快速定量检测，操作简单，方便实用。

本发明的试剂盒是利用竞争法原理定量检测样品中的AFM1，当待测样品中含有AFM1时，样品中的AFM1竞争地与免疫磁微粒上的AFM1抗体结合，从而抑制免疫磁微粒上的AFM1抗体与检测线上的AFM1抗原结合，因此结合在检测线上的免疫磁微粒较少；当待测样品中不含有AFM1时，随着层析作用的进行，免疫磁微粒移动到检测线位置，免疫磁微粒上的AFM1抗体与检测线上的AFM1抗原相结合并聚集于此；无论样品中是否含有AFM1，未结合在检测线上的免疫磁微粒随着层析作用最终前行到质控线上，抗抗体与磁微粒上的AFM1抗体结合并聚集。整个反应在30分钟内进行完全，一般在反应20分钟后即可读磁仪进行检测，检测线与质控线都会产生磁性响应，计算检测线与质控线的比值，根据预设的标准曲线，对样品进行定量。

本发明以磁性颗粒为标记物引入免疫层析技术中，较以光学检测原理为基础的免疫层析技术具有更高的检测灵敏度。因为光学原理测定易受杂质干扰，且只能检测表面10％的信号标记物，而90％的信号标记物无法测定，而磁性测定具有穿透性，可测定100％的信号标记物，抗干扰能力强。

在本发明中，若无特别说明，所用的百分比含量为质量百分比。

附图说明

图1所示为本发明所述检测AFM1的磁性免疫层析试剂盒中的试纸条。

图2所示为AFM1标准曲线图。

附图标记说明：

1-样品垫1；2-样品垫2；3-反应垫；4-吸水垫；5-检测线；6-质控线。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但是本发明保护的范围不限制于实施例所表示的范围。本发明实施例中使用的试剂均可市场购得。

实施例1：制备本发明的试剂盒

I、试纸条的制备：

(1)反应垫的处理：用包被缓冲液(含2％BSA的0.01M PBS溶液，pH为7.2，过0.22μm滤膜)将AFM1-BSA(美国Sigma-Aldrich公司，产品号A6412)稀释为0.5mg/mL，羊抗鼠IgG抗体(上海杰一生物技术有限公司，产品号JY-QT03)稀释为1mg/mL，使用Biodot公司XYZ3060喷膜机的Biojet喷头以1μL/cm的量将二者以0.8cm的间隔喷涂于硝酸纤维素膜上，37℃晾干后，加入干燥剂封存备用。

(2)样品垫2的处理：样品垫处理液为含有3％酪蛋白和0.1％Tween-20的0.01M pH7.2的PBS缓冲液。将1cm宽的样品垫放入适量样品垫处理液中浸泡1小时后取出，30℃烘干8小时备用。

(3)磁免疫层析试纸条的组装与切割

试纸板的组装：将35mm宽的反应垫，25mm宽的吸水垫，10mm宽的样品垫粘贴在透明塑料底板上，上层盖上透明塑料膜，组成试纸板。

试纸条的裁切：使用上海金标生物科技有限公司ZQ2000切条机将上述试纸板切成5mm宽的试纸条。

将切割好的5mm宽的试纸条放入塑料底卡的卡槽内，盖上上盖，利用压卡机(美国Quantum Design公司，产品号4094-497-01)将上下两片塑料卡压紧，确保整个试纸条处于绷紧状态。加入干燥剂室温下封存备用。

II、超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液的制备：

将2.5mg粒径为200nm的超顺磁性复合粒子(美国Quantum Design公司，产品号100001)、0.96mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，美国Thermo公司，产品号22980)、1.15mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS，美国Thermo公司，产品号24500)和1mL浓度为0.1M pH＝4.7的2-(N-***啉)乙磺酸(MES，美国Sigma-Aldrich公司，产品号M3671)缓冲液(称取1.066g MES，0.45g NaCl溶于50mL纯水，调pH至4.7)混匀，37℃反应30min，得到活化后磁性粒子；

用磁铁吸附磁微粒，弃上层清液，并用上述MES缓冲液洗涤两次；再加入0.8mL的pH8.5、浓度为50mM的硼酸缓冲液和0.2mg AFM1单克隆抗体(北京市理化分析测试中心，1B6)，37℃反应3h；

向上述反应液中加入含有BSA(美国Sigma-Aldrich公司，产品号A4612)的50mM pH＝8.5的硼酸缓冲液，使BSA终浓度为5％，37℃反应30min，得到含有封闭后的磁性粒子的反应液；用磁铁吸附磁微粒，弃上层清液，并用0.8mL pH8.5的硼酸缓冲液洗涤两次；最后加入0.5mL含有1％BSA，0.5％Tween-20，5％蔗糖的pH8.5的硼酸缓冲液，得到超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液，于4℃下保存备用。

实施例2本发明试剂盒标准曲线建立和回收率测定

1.试剂盒标准曲线的建立

取适量AFM1标准品(美国Sigma-Aldrich公司，产品号46319-U)以不含AFM1的牛奶(北京市理化分析测试中心提供)稀释为3.33，1.11，0.37，0.12，0.04和0.01ng/mL，分别与等体积PBST溶液(0.01M的pH7.2的PBS含1％曲拉通X-100)混合，取100μL上述混合液与2μL超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液加入实施例1中的试纸条中，等待反应20min后，将试纸条***读磁仪(美国Quantum Design公司，产品号8094-600-01)的插卡口中，采用读磁仪读取检测线与质控线的MAR值，结果见表1。检测结果通过四参数逻辑斯蒂回归拟合，其标准曲线如图2所示，其中横坐标为AFM1浓度，纵坐标为检测线MAR值与质控线MAR值的比值(即T/C)。由图可以看出，标准曲线拟合良好，R²＝0.999。

表1 读磁仪测定MAR值

2.试剂盒回收率的测定

向不含AFM1的牛奶中加入AFM1标准品，使终浓度分别为0.8、0.5、0.05ng/mL。将添加AFM1标准品的牛奶与等体积PBST溶液(0.01M的pH7.2的PBS含1％曲拉通X-100)混合，取100μL与2μL超顺磁性复合粒子标记AFM1抗体溶液加入实施例1中的试纸条中，等待反应20min后，将试纸条***读磁仪(美国Quantum Design公司，产品号8094-600-01)的插卡口中，用读磁仪读取检测线MAR值(T值)与质控线的MAR值(C值)，得出T/C值，带入上述标准曲线中，求出AFM1浓度，每个浓度测定6次，计算回收率。

回收率结果见表2，回收率范围在87.3～96.7％之间，相对标准偏差(RSD)在3.6～5.4％之间，准确性好。

表2 回收率测定

Claims (10)

1.一种检测黄曲霉毒素M1的磁性免疫层析试剂盒，包括：至少一个试纸条和一种超顺磁性复合粒子标记黄曲霉毒素M1抗体溶液。

2.根据权利要求1所述的磁性免疫层析试剂盒，其中所述超顺磁性复合粒子标记黄曲霉毒素M1抗体溶液为黄曲霉毒素M1抗体与超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体溶解在保存液中形成的溶液，所述超顺磁性复合粒子为表面带有易于与黄曲霉毒素M1抗体偶联的基团的Fe₃O₄纳米粒子。

3.根据权利要求1所述的磁性免疫层析试剂盒，其中所述试纸条由反应垫、样品垫1、样品垫2、吸水垫依次相互交错地粘在底板上并在上层覆盖透明塑料膜组装而成；所述反应垫一端连接样品垫，另一端与吸水垫相连；所述反应垫预包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有黄曲霉毒素M1抗原，所述质控线含有能与所述黄曲霉毒素M1抗体特异性结合的抗抗体。

4.根据权利要求3所述的磁性免疫层析试剂盒，其中所述反应垫为硝酸纤维素膜，所述样品垫1为纤维素膜或玻璃纤维膜或玻璃纤维与纤维素的混合膜，所述样品垫2为经样品垫处理液预处理的纤维素膜或玻璃纤维膜或玻璃纤维与纤维素的混合膜；所述吸水垫为纤维素膜。

5.根据权利要求4所述的磁性免疫层析试剂盒，其中所述黄曲霉毒素M1抗体为黄曲霉毒素M1单克隆抗体或黄曲霉毒素M1多克隆抗体，所述黄曲霉毒素M1抗原为黄曲霉毒素M1半抗原与载体蛋白的偶联物；所述黄曲霉毒素M1抗体特异性结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。

6.根据权利要求5所述的磁性免疫层析试剂盒，其中所述黄曲霉毒素M1半抗原为黄曲霉毒素M1，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或人血清蛋白或钥孔血蓝蛋白或卵清蛋白。

7.根据权利要求1所述的磁性免疫层析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

I.超顺磁性复合粒子标记黄曲霉毒素M1抗体的制备：

(1)将超顺磁性复合粒子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和2-(N-***啉)乙磺酸(MES)缓冲液混匀，反应得到活化的磁性粒子；

(2)将步骤(1)得到的活化的磁性粒子、黄曲霉毒素M1抗体和硼酸缓冲液混匀，反应得到偶联后磁性粒子反应液；

(3)向步骤(2)中的反应液加入含有牛血清白蛋白的硼酸缓冲液，反应得到含有封闭后磁性粒子的反应液；再将封闭后的磁性粒子进行洗涤、保存，最终得到超顺磁性复合粒子标记黄曲霉毒素M1抗体；

II.反应垫的处理：用包被缓冲液将黄曲霉毒素M1抗原及抗抗体分别稀释至合适的浓度，并通过定量喷液装置以一定的间隔分别将二者喷到硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，喷完后晾干，放入干燥器中备用；

III.样品垫2的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡后取出烘干；

IV.试纸条的组装：将反应垫、样品垫、吸水垫依次相互交错粘在含有不干胶的底板上并在上层覆盖透明塑料膜，得到试纸板，并切割成试纸条。

8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤I中所述用于洗涤的溶液为50mM的pH＝8.5的硼酸缓冲液，所述用于保存的溶液为1％牛血清白蛋白、0.5％Tween-20和5％蔗糖的pH8.5的硼酸缓冲液；步骤II中的所述包被缓冲液为含有1％-2％BSA的0.01M PBS、pH7.0-7.6的溶液；步骤III中所述样品垫处理溶液为含有0.5％-2％牛血清白蛋白、1％-5％蔗糖和0.5％-3％曲拉通X-100的0.01M PBS，pH7.0-7.6。

9.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤I(1)中，在37℃下反应30分钟，在步骤I(2)中，在37℃下反应3小时；在步骤I(3)中，在37℃下反应30分钟；在步骤II中，黄曲霉毒素M1抗原与抗体的间隔为0.5-1cm；在步骤III中，样品垫2在样品垫处理液中浸泡1小时。

10.根据权利要求1-4任一项所述的磁性免疫层析试剂盒用于检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的用途。