CN104498470A - 一种新型共固定化白腐菌凝胶颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明属于染色废水处理领域，具体涉及一种新型共固定化白腐菌凝胶颗粒。本发明利用硫酸铵和戊二醛使粗酶液中的胞外酶聚集交联，形成交联酶聚集体，再与白腐菌游离菌丝共分散固定，制得新型共固定化白腐菌凝胶颗粒。本发明白腐菌胞外酶以酶聚集体形态存在，提高了其对蛋白水解酶的抵抗能力，从而保护交联酶聚集体不被凝胶颗粒内白腐菌B所分解，保证白腐菌A分泌的胞外酶长期维持一定的酶活，启动时间更短，对染色废水环境的适应性更强，可直接用于废水处理的流化床反应器，用于所有染色废水的处理。

Description

一种新型共固定化白腐菌凝胶颗粒

技术领域

本发明属于染色废水处理技术领域，具体涉及一种新型共固定化白腐菌凝胶颗粒。

背景技术

合成染料是一类稳定的芳香族大分子化合物，具有高生物毒性、难降解和高色度等特点，对水生生物***会产生严重危害，间接或直接影响人类身体健康，是工业废水中需治理的重要污染物。考虑到处理成本、产生二次污染等因素，生物处理依然是染色废水主要的治理手段。目前较成熟的生物处理染料技术是利用厌氧菌群对偶氮染料进行非专一性偶氮还原脱色，但该工艺难以降解三苯基甲烷类和蒽醌类等其它结构类型染料，对染料的脱毒效用也较差，有时还会产生生物毒性更高的胺酚化合物。

目前已知的生物***中，白腐菌能在好氧条件下非专一性降解染料，并对其有显著的脱毒作用。白腐菌是一类以担子菌纲为主，能使木材白腐病变的真菌，其对染料的降解主要依靠在次生代谢阶段分泌的木素降解胞外酶***。该胞外酶***主要由木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶三类同工酶系组成，它们可以分别利用不同的电子中间递体氧化异生物质，由于这些胞外酶不需要与降解物直接接触，因此对染料的生物毒性具有一定的抵抗能力。

白腐菌是一类丝状真菌，降解反应器中机械力太大会破坏其丝状结构，从而破坏菌丝分泌木素降解胞外酶系，机械力太小又影响印染废水水体氧气的传质作用，从而降低白腐菌的降解能力，同时其降解反应苛刻的温度、pH条件，也极大增加了工业实际操作难度。白腐菌固定化技术能有效改善白腐菌工业应用的上述缺点，白腐菌的包埋小球也使其便于在废水处理的流动床设备中应用。但单纯固定化白腐菌细胞无法解决白腐菌工业处理染色废水的所有技术问题。

白腐菌分泌合成木素降解胞外酶***稳定性极差，即使在最适培养条件下，水体中的该胞外酶系的酶活也处于剧烈波动状态，难以稳定，这导致了废水水体停留时间的延长。同时，木素降解酶系的分泌合成处于白腐菌的次生代谢阶段，意味着工业实际应用中需要人为往废水水体中添加额外碳源，调节碳氮比。这不但带来了处理成本的增加，也极大提高了反应***的控制难度。研究还证明部分有机污染物会抑制木素降解酶系的合成，而水体中重金属的存在则多会抑制木素降解酶系的酶活，尤其是对锰过氧化物酶的酶活影响显著，这些物质在废水水体中的存在限制了传统白腐菌反应器的应用。

在工业上单纯利用固定化木素降解酶***虽然能一定程度解决上述问题，但又引入了新的问题，木素过氧化物酶和锰过氧化物酶是以过氧化氢为最终电子受体，直接使用固定酶处理废水需要向水体添加过氧化氢或酶促反应产生过氧化氢的物质。而由于自然环境进化的需要，对特定印染废水木素降解酶系氧化能力较大的同时，菌丝生长能力也较强的白腐菌菌种在自然环境中的菌种寻找难度较大，这也成为有待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供了一种用于染色废水的高效处理，适应条件广泛的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒。

上述目的通过以下技术方案实现的：

一种新型共固定化白腐菌凝胶颗粒是通过以下步骤制备得到：

1）白腐菌A胞外酶交联聚集体的制备：白腐菌A在培养液中培养6-20天后，收集培养液，透析去除无机离子，浓缩，制得粗酶液，粗酶液中加入硫酸铵，搅拌，制得反应液；向反应液中滴加浓度为25%的戊二醛，在恒温震荡条件下交联数小时，离心，蒸馏水多次洗涤沉淀，制备酶交联聚集体，加入蒸馏水制得酶聚集体悬浮液；

步骤1）中将白腐菌A的胞外酶制成交联酶聚集体，增加胞外酶对蛋白质水解酶的抵抗力，以使其可在凝胶颗粒中长期维持酶活性。

2）白腐菌B细胞匀浆的制备：白腐菌B在培养液中培养3-10天，滤布收集菌丝，置于蒸馏水中，玻璃珠打散菌丝，制得白腐菌B的细胞匀浆。

3）共固定化凝胶颗粒的制备：将步骤1）制得的酶聚集体悬浮液和步骤2）制得的白腐菌B的细胞匀浆混合加入海藻酸钠，制得均匀混合物，将均匀混合物滴入2%的CaCl₂溶液中，室温静置固定，将所得颗粒物用蒸馏水洗涤，制得新型共固定化白腐菌凝胶颗粒。

步骤3）中，将白腐菌A的胞外酶交联聚集体与白腐菌B的菌丝细胞共固定化，消除了两种白腐菌的竞争抑制作用。

所述的，培养液的组分：2g/LKH₂PO₄、0.25g/LMgSO₄、0.1g/LCaCl₂、5mg/LMnSO₄、5mg/LVB1、0.2g/L酒石酸铵、20g/L葡萄糖和150ml/L的微量元素储备液。

所述的，微量元素储备液的组分：NaCl1.0g/L、MgSO₄·7H₂O3.0g/L、FeSO₄·7H₂O100mg/L、CoSO₄·7H₂O100mg/L、CaCl₂100mg/L、ZnSO₄·7H₂O100mg/L、CuSO₄·5H₂O10mg/L、KAl(SO₄)₂100mg/L、H₃BO₃10mg/L和NaMoO₄10mg/L。

所述的，步骤1）中硫酸铵的加入量为粗酶液质量的60%-90%，搅拌10-60min。

所述的，步骤1）中戊二醛在反应液中的质量浓度为0.2-0.4%，交联温度为20-30℃，交联的震荡频率为100rpm，交联时间为20-30h，离心速度为14000r/min，离心时间为10min。

所述的，步骤3）中均匀混合物的木素降解胞外酶系总酶活大于50U/ml，其包含的菌丝细胞干重大于5mg/ml。

所述的，步骤3）中海藻酸钠在混合物中的质量浓度为2%，固定时间为1-3h。

粗酶液包含木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶中的一种或多种。

本发明的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒，其制备工艺路线见图1。

在上述共固定化白腐菌凝胶颗粒中，白腐菌A和白腐菌B可是任何相同或相异的白腐菌菌种。根据适用废水环境条件，选择对异生质降解能力较强的菌种为白腐菌A，制备交联酶聚集体，生长速率较快的菌种为白腐菌B，制备细胞匀浆，可制得适应能力更强、生长较快、处理效能更高的凝胶颗粒。

本发明的有益效果：

1.本发明在包埋白腐菌胞外酶前，使用交联剂戊二醛将白腐菌A胞外酶形成交联酶聚集体。与游离酶相比，酶聚集体静电力和酶分子间的疏水作用增大，有利于防止酶分子发生去折叠或解离，从而增强了蛋白质对热和其它变性剂的稳定性。同时，交联酶聚集体相对有序的三维结构，提高了对蛋白水解酶的抵抗能力，从而保护交联酶聚集体不被凝胶颗粒内白腐菌B所分解，保证白腐菌A分泌的胞外酶长期维持一定的酶活。而交联酶聚集体的这种无载体固定，也使其充分利用凝胶颗粒内部有限空间，使每一粒凝胶颗粒能容纳更多体积的白腐菌胞外酶。

2.本发明的共固定化白腐菌凝胶颗粒启动前已含有木素降解酶系，有效缩短固定化白腐菌的启动时间。同时凝胶颗粒内胞外酶交联聚集体的存在，减小了对白腐菌B分泌木素降解酶系的需求，可应用于存在抑制白腐菌分泌木素降解酶系污染物的废水处理，增强了该凝胶颗粒***对染色废水环境的适应性。

3.本发明的凝胶颗粒内，除包埋白腐菌胞外酶聚集体的同时，还包埋白腐菌菌丝细胞。这些菌丝可直接利用废水中污染物和其降解产物生成过氧化氢，为酶***的氧化降解提供电子受体终端。

4.本发明的共固定化白腐菌凝胶颗粒可直接使用于废水处理的流化床反应器，用于所有染色废水的处理。

附图说明

图1为本发明的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒的制备工艺路线；

图2为本发明的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒对偶氮染料的降解效能；

图中，a为实施例1对偶氮染料的降解效能，b为实施例2对偶氮染料的降解效能；

图3为本发明的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒对三苯基甲烷类染料的降解效能；

图中，a为实施例1对三苯基甲烷类染料的降解效能，b为实施例2对三苯基甲烷类染料的降解效能；

图4为实施例1的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒的对变性剂Cr（VI）的稳定性测试；

图5为实施例2的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒的对变性剂Cr（VI）的稳定性测试。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的优势做进一步具体的说明，但是本发明并不限于如下实施例。

实施例1

白腐菌A选用Trametes versicolor（购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号为CICC50001），白腐菌B选用Phanerochaete chrysosporium（购自广东微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号为GIM3.383）。

白腐菌A在培养液中培养10天后，4.5m滤纸收集培养液，透析去除基质中无机离子，膜过滤器浓缩10倍获得粗酶液。向粗酶液中添加占粗酶液质量60%的硫酸铵，搅拌10min，制得反应液；向反应液中缓慢滴加0.2%（w/w）的浓度为25%的戊二醛，30℃和100rpm条件下恒温震荡交联20h后，14000r/min离心10min去上清液，沉淀用蒸馏水多次洗涤，去除过量戊二醛和硫酸铵，制得交联酶聚集体，加入蒸馏水制得酶聚集体悬浮液，置于4℃冰箱中保存备用。

白腐菌B培养3天后，滤布收集菌丝，置于蒸馏水中，玻璃珠打散菌丝，制得白腐菌B的细胞匀浆。酶聚集体悬浮液和细胞匀浆混合均匀，制得混合物，向混合物中加入2%海藻酸钠(w/w)，制得均匀混合物。均匀混合物中包含12.5mg/ml的菌丝细胞和2.34×10⁶U/ml的酶交联聚集体。将均匀混合物滴入2%的CaCl₂溶液中室温静置固定2h后，蒸馏水冲洗制得3±0.2mm直径的共固定化白腐菌凝胶颗粒。

培养液的组分：2g/LKH₂PO₄、0.25g/LMgSO₄、0.1g/LCaCl₂、5mg/LMnSO₄、5mg/LVB1、0.2g/L酒石酸铵、20g/L葡萄糖和150ml/L微量元素储备液。

微量元素储备液的组分：NaCl1.0g/L、MgSO₄·7H₂O3.0g/L、FeSO₄·7H₂O100mg/L、CoSO₄·7H₂O100mg/L、CaCl₂100mg/L、ZnSO₄·7H₂O100mg/L、CuSO₄·5H₂O10mg/L、KAl(SO₄)₂100mg/L、H₃BO₃10mg/L和NaMoO₄10mg/L。

实施例2

白腐菌A和白腐菌B均选用白腐菌Phanerochaete chrysosporium（购自广东微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号为GIM3.383）。

白腐菌A在培养液中培养20天后，4.5m滤纸收集培养液，透析去除基质中无机离子，膜过滤器浓缩10倍获得粗酶液。向粗酶液中添加占粗酶液质量90%的硫酸铵，搅拌60min，制得反应液；向反应液中缓慢滴加0.4%（w/w）的浓度为25%的戊二醛，20℃和100rpm条件下恒温震荡交联30h后，14000r/min离心10min去上清液，沉淀用蒸馏水多次洗涤，去除过量戊二醛和硫酸铵，制得交联酶聚集体，加入蒸馏水制得酶聚集体悬浮液，置于4℃冰箱中保存备用。

白腐菌B培养10天后，滤布收集菌丝，置于蒸馏水中，玻璃珠打散菌丝，制得白腐菌B的细胞匀浆。酶聚集体悬浮液和细胞匀浆混合均匀，制得混合物，向混合物中加入2%海藻酸钠(w/w)，制得均匀混合物。均匀混合物中包含20.7mg/ml的菌丝细胞和1.73×10⁷U/ml的酶交联聚集体。将均匀混合物滴入2%的CaCl₂溶液中室温静置固定3h后，蒸馏水冲洗制得3±0.2mm直径的共固定化白腐菌凝胶颗粒。

培养液的组分和微量元素储备液的组分同实施例1。

新型凝胶颗粒对偶氮类染料的降解效能测试

称取40mg的酸性大红GR溶于1L的白腐菌培养液中，制得人工染色废水，酸性大红GR为工业常用的偶氮类染料。100ml锥形瓶中添加40ml废水和0.36±0.03g干重的共固定化白腐菌凝胶颗粒。以蒸馏水替代酶聚集体悬浮液，其它步骤同对应实施例，分别制得两个对照组的白腐菌凝胶颗粒—对照组1和对照组2，添加等质量对照凝胶颗粒。在25℃和100rpm条件下恒温振荡培养2.5天，在510nm处测定培养前后人工染色废水吸光度，按下式计算染料的脱色降解率，反映凝胶颗粒对染料的降解效能。

染料的脱色降解率（%）=（A₀-A_t）/A₀*100%

其中，A₀和A_t分别为人工染色废水培养前后的吸光度。

平行实验10次，实验结果见图2。实验表明，共固定化白腐菌凝胶颗粒相对于传统的固定化白腐菌启动时间更短，对染料具有更强的降解能力。

新型凝胶颗粒对三苯基甲烷类染料的降解效能测试

按上述降解偶氮类染料相似的测试方法，以碱性品红替代酸性大红GR制得人工染色废水，碱性品红为工业常用三苯基甲烷类染料。恒温振荡培养7天，在540nm处测定培养前后人工废水吸光度，计算染料的脱色降解率。平行实验10次，实验结果见图3。实验证明，对于三苯基甲烷类染料，本发明的共固定化白腐菌凝胶颗粒具有更强的降解能力。同时，对比图2和图3，可以根据废水组分的不同，可选择采用不同的白腐菌胞外酶系和菌丝细胞。

对变性剂Cr（VI）的稳定性测试

前人研究表明Cr（VI）对木素降解酶系的酶活有明显抑制作用，以不同浓度Cr（VI）表征废水环境的恶劣程度。以游离酶液替代酶聚集体悬浮液，其它步骤同对应实施例，分别制得两个对照组的共固定白腐菌凝胶颗粒—对照组1和对照组2。100ml锥形瓶中添加40ml白腐菌培养液、40mg/L酸性大红GR、0.48±0.02g干重的共固定化凝胶颗粒和不同浓度的Cr（VI）。在25℃和100rpm条件下恒温振荡培养3天后，在510nm处测定培养前后水体脱色度，实验结果见图4和图5。由图中可以看出，包含交联酶聚集体的凝胶颗粒明显比含游离酶（不含交联酶聚集体）的凝胶颗粒对Cr（VI）抑制作用具有更强的抵抗能力。即使在180mg/L高浓度Cr（VI）条件下，该发明的新型共固定化白腐菌凝胶颗粒均能对酸性大红GR依然能维持50%左右的脱色降解度。

Claims (7)

1.一种新型共固定化白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，是通过以下步骤制备得到：

1）白腐菌A胞外酶交联聚集体的制备：白腐菌A在培养液中培养10-20天后，收集培养液，透析去除无机离子，浓缩，制得粗酶液，粗酶液中加入硫酸铵，搅拌，得反应液；向反应液中滴加浓度为25%的戊二醛，在恒温震荡条件下交联，离心，蒸馏水洗涤沉淀，制备得酶交联聚集体，加入蒸馏水制得酶聚集体悬浮液；

2）白腐菌B细胞匀浆的制备：白腐菌B在培养液中培养3-10天，滤布收集菌丝，置于蒸馏水中，玻璃珠打散菌丝，制得白腐菌B的细胞匀浆；

 3）共固定化凝胶颗粒的制备：将步骤1）制得的酶聚集体悬浮液和步骤2）制得的白腐菌B的细胞匀浆混合，得混合物；向混合物中加入海藻酸钠，制得均匀混合物，将均匀混合物滴入2%的CaCl₂溶液中，室温静置固定，将所得颗粒物用蒸馏水洗涤，制得新型共固定化白腐菌凝胶颗粒。

2.根据权利要求1所述的白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，所述培养液的组分：2 g/L KH₂PO₄、0.25 g/L MgSO₄、0.1 g/L CaCl₂、5 mg/L MnSO₄、5 mg/L VB1、0.2 g/L酒石酸铵、20 g/L葡萄糖和150 mL/L微量元素储备液。

3.根据权利要求2所述的白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，所述微量元素储备液的组分：NaCl1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 3.0g/L、FeSO₄·7H₂O 100mg/L、CoSO₄·7H₂O 100mg/L、CaCl₂ 100mg/L、ZnSO₄·7H₂O 100mg/L、CuSO₄·5H₂O 10mg/L、KAl(SO₄)₂ 100mg/L、H₃BO₃ 10mg/L和NaMoO₄ 10mg/L。

4.根据权利要求1所述的白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，所述步骤1）中硫酸铵的加入量为粗酶液质量的60 %-90 %，搅拌10-60min。

5.根据权利要求1所述的白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，所述步骤1）中戊二醛在反应液中的质量浓度为0.2-0.4%，交联温度为20-30℃，交联的震荡频率为100 rpm，交联时间为20-30 h，离心速度为14000r/min，离心时间为10min。

6.根据权利要求1所述的白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，所述步骤3）中均匀混合物的木素降解胞外酶系总酶活大于50 U/mL，其包含的菌丝细胞干重大于5 mg/mL。

7.根据权利要求1所述的白腐菌凝胶颗粒，其特征在于，所述步骤3）中海藻酸钠在混合物中的质量浓度为2%，固定时间为1-3 h。