CN107630012A

CN107630012A - 一种好氧反硝化菌的包埋方法

Info

Publication number: CN107630012A
Application number: CN201710972082.XA
Authority: CN
Inventors: 王涵; 谢玮璇; 姚俊冲
Original assignee: Wuyi University
Current assignee: Wuyi University
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-01-26

Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化菌的包埋方法，包括以下步骤：制备好氧反硝化菌菌液；将聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液混合制备得到混合液A，将混合液A滴入饱和硼酸和氯化钾混合液中制得小球，放入冰箱进行交联反应，取出用无菌水洗净，用生理盐水浸泡；然后培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。采用本发明的包埋方法，可以防止菌株的流失，降低成本；使菌株不受运输等条件的限制。

Description

一种好氧反硝化菌的包埋方法

技术领域

本发明属于微生物固定领域，具体地说，涉及一种好氧反硝化菌的包埋方法。

背景技术

固定化方法分为表面吸附法、共价结合法、交联发、包埋法；四种方法的性能比较中，包埋法较适合用于菌株的固定化。

现在包埋材料一般分为天然高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料包括琼脂、卡拉胶、海藻酸钠等，合成高分子材料包括聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。天然高分子材料对生物毒害小，但机械强度、化学性能较差；合成高分子材料有良好化学性能，但生物毒性较大。

现在的包埋技术一般是采用单一的材料进行包埋，难以兼顾生物毒性和包埋小球性能两方面。包埋后传质阻力大，反应启动速度慢；机械强度相对于其他固定化方法低。

发明内容

有鉴于此，本发明针对游离菌易流失、包埋材料的问题，提供了一种好氧反硝化菌的包埋方法，本发明采用两种不同材料混合使用的包埋手段，能够较好地降低生物毒性，同时提高包埋小球性能；同时与单一的包埋材料进行对比，观察单一材料和混合材料的脱氮性能的差异。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种好氧反硝化菌的包埋方法，包括以下步骤：

步骤1、制备好氧反硝化菌菌液；

步骤2、将聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液混合制备得到混合液A，将混合液A滴入饱和硼酸和氯化钾混合液中制得小球，放入冰箱进行交联反应，取出用无菌水洗净，用生理盐水浸泡；

步骤3、然后培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。

进一步地，所述好氧反硝化菌菌液的质量分数为15％-25％。

进一步地，所述聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液的体积比为8:1-10:1；所述聚乙烯醇与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为3:100-8:100；海藻酸钠与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为1:100-3:100。

进一步地，所述饱和硼酸和氯化钾混合液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为40:100-50：100；硼酸与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为3.5:100-4.0:100；氯化钾与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为2:100-3:100。

进一步地，所述交联时间为8-16h，所述交联温度为4℃。

进一步地，所述步骤3中的培养条件为：培养pH为6.0-9.0、温度为25-40℃、转速为140-200rpm。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明的方法固定化菌株不易流失，可以用简单方法回收再利用，使用后保存一个月仍具有活性。

2)本发明的方法固定化后菌株集中在较小区间，菌株浓度提高，比游离菌具有更好的脱氮性能。

3)游离菌容易流失，需要不断加入，造成成本提高，采用本发明的包埋方法，可以防止菌株的流失，降低成本。

4)游离菌受到运输等条件的限制，不能对较远地区投入使用，限制了反硝化菌的推广；本发明固定化后菌株克服了这一限制。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明NO₃ ^--N去除率随时间变化情况；

图2是本发明NH₄ ⁺-N去除率随时间变化情况；

图3是本发明TN去除率随时间变化情况。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种好氧反硝化菌的包埋方法，包括以下步骤：

步骤1、制备好氧反硝化菌菌液：

具体地，制备得到的好氧反硝化菌菌液的质量分数为15％-25％。

好氧反硝化菌也可以选择现有的细菌作为试验材料，或者通过以下方法制备得到：

实验样品分别来自武夷山污水处理厂和武夷山通宝养猪场废水，将样品废水接种到DM培养基中，30℃恒温培养2d，选取长势好的菌株进行纯化培养，至少纯化至第五代，确保培养基上菌株群落形态单一，纯化过程同样是30℃恒温培养2d。将纯化得到的菌株利用16S rDNA鉴定所在菌属，为假单胞菌属Pseudomonas koreensis。

具体地讲，可以通过以下方法制备得到：

一、菌的分离

(一)2017年1月，在超净工作台中，将污水处理厂废水和养猪场废水按梯度进行稀释后涂布在DM培养基平板上，30℃条件下培养48小时，菌落布满整个平板。

(二)用接种环挑取平板上长势较好的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于好氧反硝化菌鉴定实验。将得到的反硝化能力强的一株菌命名为D2菌。

二、鉴定

(一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株D2进行形态特征和生理生化特性鉴定，具体结果如下：

菌体的形态和生理生化特性：

形态特性：

在DM培养基，30℃培养2天，菌体杆状，直径约为0.5^-1μm×1.5^-4μm；菌落蓝色，圆形，微凸，边缘整齐。

生理生化特征：

鞭毛数：1；荧光色素：－；脓青素：－；类胡萝卜素：－；在41℃生长：+；从蔗糖中产生果聚糖：－；精氨酸双水解酶：+；氧化酶反应：+；明胶水解：+；淀粉水解：－；聚-β-羟基丁酸盐：－；2-酮基葡萄糖酸盐：+；间-肌醇：－；L-脯氨酸：+；β-苯丙氨酸：+；DL-精氨酸：+。

将纯化得到的菌株利用16S rDNA鉴定所在菌属，为假单胞菌属Pseudomonaskoreensis。

具体地，所述聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液的体积比为8:1-10:1；所述聚乙烯醇与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为3:100-8:100；海藻酸钠与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为1:100-3:100。

具体地，所述饱和硼酸和氯化钾混合液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为40:100-50：100；硼酸与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为3.5:100-4.0:100；氯化钾与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为2:100-3:100。

具体地，所述交联时间为8-16h，所述交联温度为4℃。

步骤3、然后培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。

具体地，所述步骤3中的培养条件为：培养pH为6.0-9.0、温度为25-40℃、转速为140-200rpm。

具体地讲，温度范围是25℃～40℃，温度过低，会抑制菌株的活性；温度过高，包埋小球无法维持正常形态。pH的范围是6.0～9.0。废水的pH经测定为偏碱性，菌株在相似pH环境才能生存，酸性或碱性过强都会杀死菌体。转速的范围是140～200rpm。本实验菌体是好氧性菌体，需要较高的转速来提供溶解氧，转速过低则溶解氧不足，减慢菌体生殖速度；转速过高，对菌体剪切作用大，且超过实际状况所需溶氧量。

在温度为40℃环境中，固定化小球经过6h后溶解，25、30、35℃环境中96h后小球形状保持良好，4个温度环境均在60h时达到最大吸光度，其中25℃吸光度最高，硝态氮从138.6mg/L经过96h下降至30.2mg/L，降解了78％。

固定化菌在140～200rpm的转速环境下，12h开始进入生长对数期，48h进入稳定期，最高吸光度出现在180rpm培养基，硝态氮从138.6mg/L，96h后变为15.3mg/L，降解了89％。

随着反应进行，环境pH不断上升，在pH为6.0时，硝态氮从138.6mg/L经过96h降至21.1mg/L，降解了85％。

实施例1

制备好氧反硝化菌菌液，制备得到的好氧反硝化菌菌液的质量分数为20％。将聚乙烯醇(2.25g)和海藻酸钠(0.9g)混合液45ml与5ml质量分数为20％的好氧反硝化菌菌液混合制备得到混合液A，将混合液A滴入饱和硼酸(3.8g)和氯化钾(2.5g)混合液100ml中制得小球，放入4℃冰箱进行交联反应12h，取出用无菌水洗净，用生理盐水浸泡，然后在pH为6.0、温度为25℃、转速为160rpm条件下培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。

实施例2

制备好氧反硝化菌菌液，制备得到的好氧反硝化菌菌液的质量分数为15％。将聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液混合制备得到混合液A，所述聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液的体积比为8:1；所述聚乙烯醇与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为8:100；海藻酸钠与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为1:100；将混合液A滴入饱和硼酸和氯化钾混合液中制得小球，所述饱和硼酸和氯化钾混合液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为40:100；硼酸与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为4.0:100；氯化钾与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为2:100，放入4℃冰箱进行交联反应8h，取出用无菌水洗净，用生理盐水浸泡，然后在pH为9.0、温度为25℃、转速为200rpm条件下培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。

实施例3

制备好氧反硝化菌菌液，制备得到的好氧反硝化菌菌液的质量分数为25％。将聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液混合制备得到混合液A，所述聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液的体积比为10:1；所述聚乙烯醇与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为3:100；海藻酸钠与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为3:100；将混合液A滴入饱和硼酸和氯化钾混合液中制得小球，所述饱和硼酸和氯化钾混合液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为50：100；硼酸与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为3.5:100；氯化钾与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为3:100放入4℃冰箱进行交联反应16h，取出用无菌水洗净，用生理盐水浸泡，然后在pH为6.0、温度为40℃、转速为140rpm条件下培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。

下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：

一、实验方法

1、破损率

将制备得到的小球，每种方法选取60个放入250mL锥形瓶，加入100mL异养硝化液体培养基中，在恒温振荡器上300r/min振荡12h，观察小球破损情况，计算小球破损率。

小球破损率＝破损小球总数/原小球总数×100％；

选择聚乙烯醇(以下简称A)，卡拉胶(以下简称B)以及聚乙烯醇+海藻酸钠(以下简称C)为载体对菌种进行包埋。

2、脱氮活性

固定化的菌株与游离态的菌株分别接入相同量的DM培养基，30℃、160rpm培养4d，分光光度计测定水样中NH₄ ⁺-N去除率、NO₃ ^--N去除率、TIN去除率，表示脱氮活性。

NH₄ ⁺-N去除率＝测定时NH₄ ⁺-N浓度/初始NH₄ ⁺-N浓度×100％；

NO₃ ^--N去除率＝测定时NO₃ ^--N浓度/初始NO₃ ^--N浓度×100％；

TIN去除率＝测定时TIN浓度/初始TIN浓度×100％；

二、实验结果：

菌株的破损率件表1，包埋菌株的脱氮活性见图1至图3。

表1菌株的破损率

(1)3种包埋小球的NO₃ ^--N去除率均达到90％以上，包埋小球C的NH₄ ⁺-N和TN去除率最高。因此，根据包埋后菌种活性判断，包埋小球C的活性最高。

(2)包埋小球B和C的机械强度最佳，包埋小球A在实验过程中易发生粘连现象，机械强度低于B和C。

(3)综合比较上述几种包埋固定化小球的NO-3-N、NH+4-N和TN去除率，固定化操作和机械强度，发现聚乙烯醇(PVA)+海藻酸钠是适合好氧反硝化菌的固定化材料。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种好氧反硝化菌的包埋方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、制备好氧反硝化菌菌液；

步骤3、然后培养4d，制备得到好氧反硝化菌的包埋小球。

2.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，所述好氧反硝化菌菌液的质量分数为15％-25％。

3.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，所述聚乙烯醇和海藻酸钠混合液与好氧反硝化菌菌液的体积比为8:1-10:1；所述聚乙烯醇与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为3:100-8:100；海藻酸钠与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的质量体积比(g/ml)为1:100-3:100。

4.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，所述饱和硼酸和氯化钾混合液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为40:100-50：100；硼酸与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为3.5:100-4.0:100；氯化钾与饱和硼酸和氯化钾混合液的质量体积比(g/ml)为2:100-3:100。

5.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，所述交联时间为8-16h，所述交联温度为4℃。

6.根据权利要求1所述的包埋方法，其特征在于，所述步骤3中的培养条件为：培养pH为6.0-9.0、温度为25-40℃、转速为140-200rpm。