CN104489268A - 一种微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生态制剂，所述微生态制剂为β-环糊精包合物，并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：本发明提供的一种微生态制剂及其制备方法，由于β-环糊精具有独特的内疏水外亲水的结构而与许多尺寸适宜的客体分子形成包合物，通过β-环糊精对益生菌包合可形成较为稳定的包合物，包合物的形成能够有效保护化合物免于氧化或水解等反应，同时也增加药物的稳定性，增强水溶性,控制微生态制剂释放提高生物利用率。

Description

一种微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种微生态制剂及其制备方法。

背景技术

抗生素的使用对畜牧业的发展起到了极大的推动作用,随着科学与生活水平的提高,人们逐渐认识到,抗生素长期添加于饲料中,使动物病原菌产生抗药性,导致抗生素用量增加,引起畜禽内源性感染和二重感染,造成动物机体免疫力的下降、动物胃肠道菌群的失调等不良的后果,也通过食物链对人类的健康造成危害。目前,美国及西欧一些国家相继禁止或限制饲用抗生素，因此,开发研制抗生素的替代品已经成为动物养殖业中的一个急待解决的问题。

微生态制剂作为一种无公害、无残留的绿色饲料添加剂并具有促进动物的生长,提高动物的免疫力,降低动物生产对环境的污染程度等优点而成为研究和应用的热点，我国微生态制剂的研究开始于上世纪70年代,80年代后期才开始重视微生物饲料添加剂的研究与开发。由于环糊精具有独特的内疏水外亲水的结构而与许多尺寸适宜的客体分子形成包合物，通过环糊精对头孢噻呋包合可形成液态包合物。包合物的形成能够有效保护化合物免于氧化或水解等反应，同时也增加药物的水溶性，增强稳定性,降低毒副作用，控制药物释放提高生物利用率。近来，环糊精用来改善药物的物理化学及生物学性质方面的研究应用越来越受到人们的关注。特别是用来提高疏水药物的稳定性和生物利用度，有一些溶液中包合作用的报道，而环糊精包合微生态制剂的制备及其性质的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种微生态制剂及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种微生态制剂，所述微生态制剂为β-环糊精包合物。

进一步的，上述的一种微生态制剂，所述β-环糊精包合物是将乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌分别培养后再混合培养，最后加入β-环糊精包合得到的。

本发明的第二个目的是提供了上述一种微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）首先将三种菌粉配成质量体积百分比（W/V）为5%的液体，将0.1ml乳酸菌、0.1ml芽孢杆菌和0.1ml酵母菌分别接种于MRS液体培养基、肉汤液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时后取出，得到乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液；

2）将步骤1）得到的乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液按照体积比2：1：2的比例与灭菌后的酒糟、麸皮混合均匀，再置于31.8℃培养箱中培养24小时后得到微生物培养剂，酒糟和麸皮的加入量均为为三种菌培养液总质量的200倍量；

3）将步骤2）得到的微生物培养剂中加入β-环糊精进行包合，包合温度为-20℃-65℃，搅拌时间为2-5小时，β-环糊精的加入比例按照重量比计微生物培养剂：β-环糊精为10：（1-3），干燥即得到微生态制剂。

进一步的，上述的一种微生态制剂的制备方法，所述步骤3）中，包合温度为20℃，搅拌时间为4小时。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种微生态制剂及其制备方法，由于β-环糊精具有独特的内疏水外亲水的结构而与许多尺寸适宜的客体分子形成包合物，通过β-环糊精对头孢噻呋包合可形成较为稳定的包合物，包合物的形成能够有效保护化合物免于氧化或水解等反应，同时也增加药物的稳定性，增强水溶性,降低毒副作用，控制微生态制剂释放提高生物利用率。

具体实施方式

本发明技术方案中所用到的试剂来源：

乳酸菌：沧州旺发生物技术研究所有限公司（RS20140122-3）；

芽孢杆菌（解淀芽孢杆菌）：保定瑞谷生物科技有限公司（20140308YB）；

酵母菌：沧州旺发生物技术研究所有限公司（XM20140220-7）；

MRS液体培养基：上海泸峰化工有限公司（60541609-2216e）；

肉汤液体培养基：上海泸峰化工有限公司（60541609-2200a）；

马铃薯葡萄糖液体培养基：上海鼓臣生物技术有限公司(P0185)；

β-环糊精：河南省孟州市鸿基生物有限公司（20131222）。

实施例1：

一种微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）首先将三种菌粉配成5%（W/V）的液体，将0.1ml乳酸菌、0.1ml芽孢杆菌和0.1ml酵母菌分别接种于MRS液体培养基、肉汤液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时后取出，得到乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液；

2）将步骤1）得到的乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液按照体积比2：1：2的比例与灭菌后的酒糟、麸皮混合均匀，再置于31.8℃培养箱中培养24小时后得到微生物培养剂，酒糟和麸皮的加入量均为为三种菌培养液总质量的200倍量；

3）将步骤2）得到的微生物培养剂中加入β-环糊精进行包合，包合温度为-20℃℃，搅拌时间为2小时，β-环糊精的加入比例按照重量比计微生物培养剂：β-环糊精为10：1，干燥即得到微生态制剂。

实施例2：

一种微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）首先将三种菌粉配成5%（W/V）的液体，将0.1ml乳酸菌、0.1ml芽孢杆菌和0.1ml酵母菌分别接种于MRS液体培养基、肉汤液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时后取出，得到乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液；

2）将步骤1）得到的乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液按照体积比2：1：2的比例与灭菌后的酒糟、麸皮混合均匀，再置于31.8℃培养箱中培养24小时后得到微生物培养剂，酒糟和麸皮的加入量均为为三种菌培养液总质量的200倍量；

3）将步骤2）得到的微生物培养剂中加入β-环糊精进行包合，包合温度为65℃，搅拌时间为5小时，β-环糊精的加入比例按照重量比计微生物培养剂：β-环糊精为10：3，干燥即得到微生态制剂。

实施例3：

一种微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）首先将三种菌粉配成5%（W/V）的液体，将0.1ml乳酸菌、0.1ml芽孢杆菌和0.1ml酵母菌分别接种于MRS液体培养基、肉汤液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时后取出，得到乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液；

2）将步骤1）得到的乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液按照体积比2：1：2的比例与灭菌后的酒糟、麸皮混合均匀，再置于31.8℃培养箱中培养24小时后得到微生物培养剂，酒糟和麸皮的加入量均为为三种菌培养液总质量的200倍量；

3）将步骤2）得到的微生物培养剂中加入β-环糊精进行包合，包合温度为20℃，搅拌时间为4小时，β-环糊精的加入比例按照重量比计微生物培养剂：β-环糊精为10：2，干燥即得到微生态制剂。

实施例4：

一、微生态制剂中活菌数量的测定：

1、材料准备：首先将三种菌粉配成5%（W/V）的液体，用微量取液器吸取10^-6-10^-8倍液体各0.1ml涂布接种于MRS固体培养基平皿中(各稀释度设两个重复),置于37℃培养箱中培养24h后取出,进行乳酸菌菌落计数，用微量取液器吸取10^-6-10^-8倍液体各0.1ml涂布接种于马铃薯葡萄糖固体培养基平皿中(各稀释度设两个重复),置于37℃培养箱中培养24h后取出,进行酵母菌菌落计数，用微量取液器吸取10^-6-10^-8倍液体各0.lml涂布接种于肉汤固体培养基平皿中(各稀释度设两个重复),置于37℃培养箱中培养24h后取出,进行芽胞杆菌菌落计数。

2、微生态制剂的干燥：先通过预备试验测得微生态制剂在冷冻干燥、阴凉处风干、25℃烘箱烘干、45℃烘箱烘干，65℃烘箱烘干干燥后水分含量在12%-13%之间所用的时间分别为8h、12h、10h、8h和6h，将微生态制剂分为五个处理组,每组三个重复,每个重复500g分别采用冷冻干燥、阴凉处风干、25℃烘干、45℃烘干和65℃烘干五种不同的干燥方式,对五个组的微生态制剂进行干燥、检测干燥后各组中的乳酸菌、酵母菌和芽胞杆菌的含量。

3、结果：

不同干燥方式对微生态制剂中活菌数量的影响(1g^CFU/g)，结果如表1所示。

表1

。

从表1中可以看出,冷冻干燥组、风干组、25℃烘干组、45℃烘干组、65℃烘干组中所含乳酸菌数量及包合与未包合均差异极显著(P<0.01)，冷冻干燥组中所含乳酸菌数量最多。随着烘干温度的升高,乳酸菌的数量极显著减少，且通过包合后对热的稳定性要高于不包合的制剂。冷冻干燥组、风干组、25℃烘干组、45℃烘干组、65℃烘干组中所含酵母菌数量及包合与未包合均差异极显著(P <0.01)，冷冻干燥组中所含酵母菌数量最多，随着烘干温度的升高,酵母菌的数量极显著减少(P <0.01)，且通过包合后对热的稳定性要高于不包合的制剂。冷冻干燥组、风干组、25℃烘干组、45℃烘干组、65℃烘干组中包合物制剂含芽抱杆菌数量差异不显著(P>0.05)，其中冷冻干燥组中的芽抱杆菌含量最高,但随着烘干温度的升高,芽抱杆菌的数量呈现出逐渐减少的趋势。未包合组冷冻干燥组、风干组、25℃烘干组、45℃烘干组、65℃烘干组中所含酵母菌数量及差异极显著(P <0.01)。

二、饲料级微生态制剂制粒工艺及活菌含量的测定方法：

1、制粒工艺中饲料的组成：

饲料为生长猪粉料,其配方为22%豆粕、54%玉米、40%预混料、200kg油糠。

2、制粒工艺：

按照1g/kg的添加量,将包合后的微生态制剂添加到生长猪粉状饲料中,于混合机内混合1Omin，将这些与包合后的微生态制剂混合均匀的粉状饲料分为五个组,每组三个重复,每个重量5kg。对其中的四个组进行制粒,在制粒工艺过程中,分别选择15秒、30秒、45秒、60秒调质时间进行调质处理,制作出四组不同调质时间的颗粒料。

3、饲料制粒中活菌含量的测定：

按照制作出四组不同调质时间的颗粒料，取样后采用与检测微生态制剂中菌群含量相同的方法对粉状饲料和四组颗粒料中的活菌进行计数，不同调质时间对微生态制剂中活菌数量的影响(lg^CFU/g)，结果如表2所示。

表2

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从表2中可以看出,未包合的制剂0秒、15秒、30秒、45秒、60秒调质时间组中所含乳酸菌数量差异极显著(P <0.01)，随着调质时间的增加,乳酸菌的数量极显著减少(P <0.01)，而包合的差异不显著。未包合的制剂0秒、15秒、30秒、45秒、60秒调质时间组中所含酵母菌、芽抱杆菌数量差异显著。而包合的差异不显著。本发明中,在对该制剂采取环糊精保护措施下,微生态制剂按0.1%的添加量配制的粉状饲料在60秒调质时间下制粒后,所含乳酸菌、酵母菌、芽胞杆菌数量的对数值分别为7.04、7.15、7.46与未进行制粒的原生物制剂相比,三种菌数量均未显著的降低。试验证明,未包合微生态制剂不适合在这种条件下制粒，但通过倍他环糊精，可以通过该工艺制备颗粒。

三、微生态制剂对生长猪生产性能及粪中微生物的影响：

1、试验材料与方法：

饲料级微生态制剂制粒:自制（见试验一）。

2、试验动物分组及日粮配方“

试验选用体重25kg左右、健康状况基本一致的杜长大三元杂交生长猪150头。随机分为五个处理组,即1个空白组、1个对照组、3个试验组,每个处理3个重复,每个重复10头猪,公母各半。 空白组饲喂基础日粮；对照组饲喂基础日粮加抗生素的日粮(l00ml/kg吉它霉素和300mg/mg土霉素)；试验组I饲喂基础日粮加500mg/kg微生态制剂(日粮中含量为0.05%)的日粮；试验组Ⅱ饲喂基础日粮加1000m/kg微生态制剂(日粮中含量为0.10%)的日粮；试验组Ⅲ饲喂基础日粮加1500mg/kg微生态制剂(日粮中含量为0.15%)的日粮。具体试验设计与分组如表3所示。

表3

。

3、结果与分析：

微生态制剂对生长猪生产性能的影响，结果如表4所示。

表4

。

从表4中可以看出,各组采食量不存在显著差异，试验组I试验组Ⅱ试验组Ⅲ的平均日增重与空白组相比,分别提高了7.14%、9.04%、7.62%；与对照组相近。与空白组相比,试验组I试验组Ⅱ试验组Ⅲ的腹泻率降低，与对照组相近。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为β-环糊精包合物。

2.根据权利要求1所述的一种微生态制剂，其特征在于，所述β-环糊精包合物是将乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌分别培养后再混合培养，最后加入β-环糊精包合得到的。

3.如权利要求1或2所述的一种微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将三种菌粉配成质量体积百分比为5%的液体，再将0.1ml乳酸菌、0.1ml芽孢杆菌和0.1ml酵母菌分别接种于MRS液体培养基、肉汤液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于37℃培养箱中培养24小时后取出，得到乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液；

2）将步骤1）得到的乳酸菌培养液、芽孢杆菌培养液和酵母菌培养液按照体积比2：1：2的比例与灭菌后的酒糟、麸皮混合均匀，再置于31.8℃培养箱中培养24小时后得到微生物培养剂，酒糟和麸皮的加入量均为为三种菌培养液总质量的200倍量；

3）将步骤2）得到的微生物培养剂中加入β-环糊精进行包合，包合温度为-20℃-65℃，搅拌时间为2-5小时，β-环糊精的加入比例按照重量比计微生物培养剂：β-环糊精为10：（1-3），干燥即得到微生态制剂。

4.根据权利要求3所述的一种微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，包合温度为20℃，搅拌时间为4小时。