CN104487574B - 治疗糖尿病和/或促进胰岛移植后存活的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用SMAD7表达或功能的特异性抑制剂来治疗和/或预防糖尿病的方法。还公开了使用SMAD7表达或功能的特异性抑制剂来促进器官和/或细胞例如胰岛细胞移植后存活的方法。

Description

治疗糖尿病和/或促进胰岛移植后存活的方法

与相关申请的交叉引用

本申请要求2012年4月18日提交的美国临时申请61/625,904的利益，所述临时申请的全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明一般涉及针对SMAD7的反义寡核苷酸及其在治疗和/或预防糖尿病和/或促进胰岛细胞移植后存活中的用途。

背景技术

糖尿病是以血液中高的糖水平为特征的代谢疾病。两种最普遍的糖尿病类型是1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)。1型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)是以产生胰岛素的胰岛中的β细胞的大量丧失为特征的慢性自体免疫疾病。在肌肉、脂肪和肝细胞不能对胰岛素正常应答(胰岛素抗性)时，患有2型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。特别是，受到许多国家中肥胖和久坐生活方式增加以及人口总体老龄化的影响，2型糖尿病变为一种流行病。在最近的临床实践中，由于许多患有T1DM的儿童在诊断时体重过重，并且相当大比例的医生诊断为T2DM的年轻人有证据显示胰腺自体免疫，因此辨别T1DM与T2DM变得日益困难(Badaru,A.和Pihoker,C，“儿童期2型糖尿病：β-细胞自体免疫的临床特征和作用”(Type2 diabetes in childhood:clinical characteristics and role of beta-cellautoimmunity)，Curr.Diab.Rep.,2012,12,75-81)。在2011年，全世界超过3亿4千6百万人患有糖尿病。

最近的研究证实，TGF-β在胰岛功能和糖尿病发展中发挥作用(Moritani,M.等，“通过转基因旁分泌TGF-β1在非肥胖糖尿病小鼠中自体免疫糖尿病的废除和针对效应淋巴细胞的保护”(Abrogation of autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice andprotection against effector lymphocytes by transgenic paracrine TGF-β1)，J.Clin.Invest.,1998,102,499-506；Olivieri,A.等，“在非肥胖糖尿病小鼠和人类中糖尿病发展期间的血清转化生长因子β1”(Serum transforming growth factorβ1 duringdiabetes development in non-obese diabetic mice and humans)，Clin.Exp.Immunol.,2010,162,407-414)。例如，已显示，TGF-β表达的为期一周的胰岛特异性脉冲，在NOD小鼠中延缓糖尿病发展(M.等，“TGF-β的胰岛特异性脉冲废除CTL功能并促进不依赖于Foxp3⁺T细胞的β细胞存活”(An islet-specific pulse of TGF-βabrogates CTL function and promotesβcell survival independent of Foxp3⁺Tcells)，J.Immunol.,2011,186,2543-2551)，所述NOD小鼠是1型糖尿病的一种常用的动物模型(Roep,B.O.等，“(不)保证的满意：重新评估1型糖尿病动物模型的用途”(Satisfaction(not)guaranteed:re-evaluating the use of animal models of type 1diabetes)，Nat.Rev.Immunol.,2004,4,989-997)。TGF-β1不仅有效地在糖尿病NOD小鼠中治愈糖尿病并阻断胰岛破坏性自体免疫，而且有效地诱导胰岛再生(Luo,X.等，“在明显的糖尿病非肥胖糖尿病小鼠中***性转化生长因子β1基因疗法诱导Foxp3+调节性细胞，恢复自身耐受，并促进β细胞功能的再生”(Systemic transforming growth factor-β1 genetherapy induces Foxp3+regulatory cells,restores self-tolerance,andfacilitates regeneration of beta cell function in overtly diabetic nonobesediabetic mice)，Transplantation,2005,79,1091-1096)。因此，沿着这条通路的治疗性干预可能不仅终止疾病的进展，而且甚至可能在高血糖症发作后恢复功能(即，产生足够的胰岛素)。

TGF-β1-3参与各种不同生物功能，包括细胞生长、器官发育、纤维形成和免疫细胞的调控。TGF-β1是在免疫***中表达的主要形式，并且它现在已被明确认为是在免疫应答中可以抑制T细胞应答的关键调控因子(Li,M.O.和Flavell,R.A.，“TGF-β：所有T细胞掌控者的贸易”(TGF-beta:a master of all T cell trades)，Cell,2008,134,392-404)。具体来说，TGF-β1结合含有两个亚基TGF-β1 R1和TGF-β1R2的异二聚体跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体。在配体结合后，TGF-β1 R1受体被持续活化的TGF-β1 R2受体磷酸化，并通过属于SMAD家族的蛋白将信号传递到细胞核。活化的TGF-β1 R1直接磷酸化SMAD2和SMAD3蛋白，它们然后与SMAD4相互作用。SMAD2/SMAD3/SMAD4复合物转入到细胞核并调节某些基因的转录。SMAD7是这个蛋白质家族的另一个成员，其通过负反馈机制起到针对TGF-β的通用拮抗剂的作用(Yan,X.和Chen,Y.G.，“Smad7：不仅是调控因子，而且是TGF-β信号传导的交互作用介导物”(Smad7:not only a regulator,but also a cross-talk mediator of TGF-betasignalling)，Biochem.J.,2011,434,1-10)。

研究证实，SMAD7在糖尿病和β-细胞功能中发挥作用。已显示，SMAD7这种细胞内蛋白干扰SMAD2/SMAD3与TGF-β1 R1的结合，阻止这些蛋白质的磷酸化和活化，导致TGF-β1介导的信号传导的抑制。已显示，SMAD7在胰腺β-细胞中的表达阻断TGF-β信号传导并诱导可逆的糖尿病(Smart,N.G.等，“Smad7在胰腺β细胞中的条件性表达阻断TGF-β信号传导并诱导可逆的糖尿病”(Conditional expression of Smad7 in pancreatic beta cellsdisrupts TGF-beta signaling and induces reversible diabetes mellitus)，PLoSBiol.,2006,4,e39)。此外，NOD小鼠中的结果也暗示了在糖尿病形成中活化的树突细胞中的Smad2和TGF-β信号传导通路，并且存在来自于人类全基因组关联研究的证据支持Smad7在人类1型糖尿病中的作用(Hook,S.M.等，“Smad2：鼠类自体免疫性糖尿病位点Idd21.1的候选基因”(Smad2:A candidate gene for the murine autoimmune diabetes locusIdd21.1)，J.Clin.Endocrinol.Metab.,2011,96,E2072-E2077)。由于已显示TGF-β1有助于细胞因子产生的抑制、T细胞应答的抑制和调节性T细胞(Treg)的诱导(Kawamoto,K.等，“转化生长因子β1(TGF-β1)和雷帕霉素协同增效，通过FoxP3⁺Treg的上调有效地抑制人类T细胞应答”(Transforming growth factor beta 1(TGF-β1)and rapamycin synergize toeffectively suppress human T cell responses via upregulation of FoxP3⁺Tregs)，Transpl.Immunol.,2010,23,28-33)，因此通过支持移植物功能、限制毒性和防止免疫排斥，SMAD7调节在胰岛移植中也可能是有益的。

因此，对于糖尿病和胰岛移植中的新疗法，存在着未满足的需求。

发明概述

本发明方法是部分地基于发现抑制SMAD7并因此恢复TGF-β信号传导的SMAD7表达或功能的特异性抑制剂，例如针对SMAD7的反义寡核苷酸。示例性的针对SMAD7的反义寡核苷酸包含例如SEQ ID No:5或SEQ ID No：6，其可用于药物组合物中。所公开的SMAD7抑制剂可用于治疗和/或预防糖尿病例如1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。所述针对SMAD7的反义寡核苷酸也可用于促进胰岛细胞移植后存活。

通过引用下面的图、详细描述和权利要求书，可以更充分地理解本发明的上述方面和实施方式。当在本文中使用时，“包括”意味着没有限制，并且引用的实例是非限制性的。

附图简述

图1(A)提供SMAD7的核酸序列(SEQ ID NO：1)，并且(B)提供了SMAD7的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2(A)是示出在HEK-Blue TNF-α感应细胞(sensor cell)中TGFβ和GED-0301(一种SMAD7反义寡核苷酸，SEQ ID NO：6)对NF-κB活化的影响的图，并且(B)是示出了在分别用TNF-α和CD40L刺激的HEK-Blue CD40L感应细胞中TGFβ和GED-0301对NF-κB活化的影响的图。

图3(A)是示出在小鼠中，在通过各种不同途径给药后荧光素标记GED-0301的器官特异性摄取的流式细胞术结果的分析中使用的选通方法的图，并且图3(B)示出了在所指示的器官组织中，在活细胞中的相应摄取百分数(FITC+)。

图4是示出来自于对照小鼠和皮下给药荧光素标记GED-0301的小鼠(给药后4小时)的胰腺切片的多通道高分辨率显微镜图像。颜色图例说明：绿色–荧光GED-0301，灰色–DAPI(细胞核的标志物)，红色–胰岛素(指示产生胰岛素的β-细胞)，以及蓝色–CD45(指示CD45或白细胞共同抗原LCA，LCA是白细胞这种包含免疫和炎性细胞的循环血液***的要素的标志物)。

图5(A)是示出在高血糖症发作后，用SMAD7反义寡核苷酸GED-0301(AS GED-0301)、相应的正义对照(S对照)和盐水(对照)(125μg/动物，皮下(s.c.)，每日)治疗的NOC小鼠中血糖水平的图，图5(B)是示出了保持无糖尿病的动物的百分数随时间变化的相应的Kaplan-Meier存活曲线。

图6是比较在到研究结束(第150天)时GED-0301治疗的没有患糖尿病的NOD小鼠和对照小鼠中进行的口服葡萄糖耐受试验的结果的图。

图7示出了比较来自于到研究结束(第150天)时GED-0301治疗的没有患糖尿病的NOD小鼠和相应对照的胰腺的代表性含胰岛切片的多通道高分辨率Z-堆叠共聚焦显微术图像。颜色图例说明：蓝色–DAPI(细胞核的标志物)，红色–胰岛素(指示产生胰岛素的β-细胞)，绿色–胰高血糖素(指示产生胰高血糖素的α-细胞)。

发明内容

本发明总的来说涉及针对SMAD7的反义寡核苷酸及其在治疗和/或预防糖尿病和/或促进胰岛细胞移植后存活中的用途。

抗SMAD7疗法

本发明方法涉及将特异性SMAD7抑制剂用于治疗和/或预防糖尿病和/或用在促进胰岛细胞移植后存活中的用途，所述特异性SMAD7抑制剂选自由小结合分子(例如天然和合成的化合物)、抗体、适体(aptamer)、intramers、RNAi(双链RNA，siRNA)和抗SMAD7反义分子所组成的组。SMAD7抑制剂还可以包含截短和/或突变的SMAD7分子，其干扰SMAD7并因此抑制SMAD7功能。

例如，抗SMAD7疗法包括针对SMAD7的靶向疗法(例如抗SMAD7反义疗法，即针对SMAD7的反义寡核苷酸，以及针对SMAD7的抗体)。反义寡核苷酸是短的合成寡核苷酸序列，其与编码靶蛋白(例如SMAD7)的信使RNA(mRNA)互补。反义寡核苷酸序列杂交mRNA，产生双链杂合体，其可以引起遍在催化酶例如RNase H的激活，所述RNase H降解DNA/RNA杂合链，由此阻止蛋白质翻译。

在某些实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸可以靶向人类SMAD7 mRNA(例如SEQ IDNO：1)的位点403、233、294、295、296、298、299和/或533(即分别为403、233、294、295、296、298、299和533位核苷酸)(参见图1)。在示例性实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸靶向人类SMAD7 mRNA的403-423位核酸。

在某些实施方式中，反义寡核苷酸可以源自于下列抗SMAD7反义寡核苷酸5'-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3'(SEQ ID NO：3)。

在本文中设想了靶向SMAD7的反义寡核苷酸可以包含混合骨架，其中CpG对中的胞嘧啶残基被5’-甲基胞嘧啶取代(缩写为Me-dC)。在反义寡核苷酸的5’和/或3’端处也可以放置甲基膦酸酯连键(缩写为MeP)。所设想的抗SMAD7反义寡核苷酸的膦酸酯骨架可以任选地包含1、2、3、4个或更多硫代磷酸酯键(例如硫代磷酸酯键取代磷酸二酯键)。在实施方式中，所有膦酸酯键可以是硫代磷酸酯键。

靶向SMAD7的示例性反义寡核苷酸疗法包含但不限于：

5'-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3'(SEQ ID NO：4)，其中X是包含选自由胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶或2'-O-甲基胞嘧啶核苷所组成的组的含氮碱基的核苷酸，并且其中Y是包含选自由鸟嘌呤和5-甲基鸟嘌呤或2'-O-甲基鸟嘌呤核苷所组成的组的含氮碱基的核苷酸，条件是至少一个核苷酸X或Y包含甲基化的含氮碱基；

5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'(SEQ ID NO：5)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单磷酸；

5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3'(SEQ ID NO：6)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单磷酸；

5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3'(SEQ ID NO：7)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单磷酸并且Z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯；

5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3'(SEQ ID NO：8)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单磷酸并且Z是2'-脱氧鸟苷甲基膦酸酯。

在特定实施方式中，所设想的SMAD7反义物可以是包含下列之一的序列：

5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3'(SEQ ID NO：9)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单硫代磷酸酯；

5'-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC-3'(SEQ ID NO：10)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单硫代磷酸酯；

5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3'(SEQ ID NO：11)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单磷酸并且Z是2'-脱氧鸟苷甲基硫代膦酸酯；

5'-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3'(SEQ ID NO：12)，其中X是5-甲基2'-脱氧胞苷5'-单磷酸并且Z是2'-脱氧鸟苷甲基硫代膦酸酯。

例如，SEQ ID NOs.9-12包含1、2、3、4个或更多硫代磷酸酯键。在实施方式中，SEQID NOs.9-12的所有O,O膦酸酯键是硫代磷酸酯键。

治疗方法

本文中提供促进器官和/或细胞例如胰岛细胞移植后存活的方法，所述方法包含向需要的患者给药有效量的SMAD7表达或功能的特异性抑制剂，例如针对SMAD7的反义寡核苷酸。

本文中还提供了治疗和/或预防糖尿病例如1型糖尿病和2型糖尿病的方法，所述方法包含向需要的患者给药有效量的SMAD7表达或功能的特异性抑制剂，例如针对SMAD7的反义寡核苷酸。

糖尿病包括以高血糖或酮酸中毒以及由长期高血糖状态或葡萄糖耐受降低引起的慢性、普遍的代谢异常为特征的一组代谢疾病。糖尿病包括所述疾病的1型和2型两种形式、妊娠期糖尿病和胰岛素缺乏的其他病症。

应该认识到，所公开的方法还适用于治疗和预防隐匿性自体免疫糖尿病(即1.5型糖尿病)、代谢失衡、糖尿病前期状态、代谢综合征、与脂类或葡萄糖相关的障碍例如高脂血症和/或高胆固醇血症，以及其他相关障碍。

代谢失衡可以包括与血浆葡萄糖升高相关的任何障碍或疾病状态或病症。代谢失衡包括例如糖尿病、妊娠期糖尿病、β-细胞功能的遗传缺陷、胰岛素作用的遗传缺陷、胰腺外分泌的疾病、内分泌病、药物或化学物质诱导的感染、与糖尿病相关的其他遗传综合征、糖尿病前期状态和代谢综合征。

代谢综合征以一个人中一组代谢风险因子为特征，正如由美国心脏协会(American Heart Association)(AHA)所描述的。代谢综合征还被称为代谢综合征X、综合征X、胰岛素抵抗综合征、Reaven's综合征或CHAOS。所述风险因子包括但不限于腹型肥胖、动脉粥样硬化血脂异常、高血压、胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受、血栓前状态(高血纤维蛋白原或纤溶酶原激活物抑制剂-1)和促炎症状态(高C-反应性蛋白)。

术语“治疗”(treat)、“治疗”(treatment)、“治疗”(treating)等在本文中用于通常指获得所需的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分地预防疾病或其症状而言可能是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的不利影响而言可能是治疗性的。当在本文中使用时，术语“治疗”涵盖在哺乳动物、尤其是人类中疾病的任何治疗，并包括：(a)在可能对疾病易感但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中预防所述疾病发生；(b)抑制疾病，即停滞其发展；或(c)缓解疾病，即使疾病消退。

在某些实施方式中，受试者对使用抗SMAD7疗法的治疗的反应，可以相对于从治疗前的受试者获得的对照样本(在下文描述)来说明。如果存在SMAD7表达的降低，如果存在总胰腺胰岛素含量的增加，如果β-细胞功能得以维持和/或恢复(例如，正如通过标准方法例如静脉内葡萄糖耐受试验IVGTT所评估的)，和/或如果正常血糖、即正常的血液葡萄糖含量得以维持和/或恢复，则受试者可以被确定为对使用抗SMAD7疗法的治疗作出反应。在其他实施方式中，已接受胰岛移植物例如异体胰岛移植的受试者，如果存在排斥反应的预防和/或延长胰岛存活，可以被确定为对使用抗SMAD7疗法的治疗作出反应。

可以在例如疗法开始后第1周、第2周、第4周、第8周、第10周或更晚时间从患者获得试验样本，以判定对治疗的敏感性。在某些实施方式中，可以在例如疗法开始后一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、五个月、六个月和/或一年或更长时间获得试验样本，以监测对初始治疗的敏感性。

对照样本可以包括在用抗SMAD7疗法治疗之前从受试者获得的样本(例如，血液或组织样本)。对照样本为监测受试者的治疗进展提供了基线。对照样本可以在抗SMAD7疗法首次给药的当天(例如治疗方案的第1天)从受试者获得。在其他实施方式中，对照样本可以在抗SMAD7疗法开始前一天(例如治疗方案的第0天)从受试者获得。或者，对照样本可以在抗SMAD7疗法开始前2、3、4、5、6、7或更多天从受试者获得。例如，某些细胞样本的上调或下调，可以在治疗之前(例如对照样本)、治疗期间和/或治疗之后进行测量，以监测受试者对疗法例如抗SMAD7疗法的反应。

对照样本可以包括例如用于监测受试者的葡萄糖水平的样本，其中所述样本在使用抗SMAD7疗法治疗之前从所述受试者获得。

在某些实施方式中，可以在受试者中某些细胞群体的长期监测的基础上为受试者建立对照水平。在这样的情形中，设想了受试者可以经历使用抗SMAD7疗法的多轮治疗。在多轮治疗后检测到的某些细胞群体的量，可以与所述受试者以前的对照水平进行比较，以判定受试者是否已经对疗法作出反应和/或可能对使用抗SMAD7疗法的进一步治疗作出反应。在其他实施方式中，可以在从随时间获得的(例如在数周、数月或数年的过程中获得的)多个基线样本判定的某些细胞群体的平均测量值的基础上，为受试者建立对照或基线水平。因此，可以将如本文中所公开的进行的任何试验或测定与以前或已建立的对照水平进行比较，并且例如如果受试者接受使用抗SMAD7疗法的超过一轮的治疗的话，可以不必从受试者获得新的对照样本用于比较。

给药和制剂

在某些实施方式中，本文中设想了包含所设想的针对SMAD7的反义寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。例如，药物组合物可以皮下给药。或者，药物组合物可以口服给药。

当在本文中使用时，“可药用载体”是指适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。载体在与制剂的其他成分相容和对受体无害的意义上应该是“可接受的”。可药用载体包含与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的用于药物活性物质的介质和试剂的使用，在本领域中是已知的。

在一种实施方式中，所设想的针对SMAD7的反义寡核苷酸及其任何药物组合物，可以通过一种或几种途径给药，包括口服给药、局部给药、肠胃外给药例如皮下注射、通过吸入喷剂或直肠给药。当在本文中使用时，术语肠胃外给药包括皮下注射、胰腺内给药、静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内注射或输注技术。例如，针对SMAD7的反义寡核苷酸可以皮下给药于受试者。在另一个实例中，针对SMAD7的反义寡核苷酸可以口服给药于受试者。

含有例如本文中所公开的针对SMAD7的反义寡核苷酸的药物组合物，可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其既定给药途径相容。有用的制剂可以通过制药技术领域中公知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第18版(Mack PublishingCompany,1990)。

药物制剂优选地是无菌的。灭菌可以例如通过无菌过滤膜过滤来实现。在组合物被冻干的情况下，过滤灭菌可以在冻干和重构之前或之后进行。

在示例性实施方式中，用于针对SMAD7的反义寡核苷酸的皮下给药的药物组合物包含例如由SEQ ID NO：6所表示的反义寡核苷酸或其可药用盐(例如钠盐)以及可药用载体。

在另一种实施方式中，用于针对SMAD7的反义寡核苷酸的口服给药的药物片剂包含内相颗粒，其中所述内相颗粒包含例如由SEQ ID NO：6所表示的反义寡核苷酸或其可药用盐(例如钠盐)以及可药用填充剂，并且其还可以包含颗粒外相，其可以包含可药用赋形剂例如崩解剂。例如，用于口服使用的可药用片剂可以包含内相颗粒，其包含约5至约10重量％的由SEQ ID NO 6所表示的反义寡核苷酸或其可药用盐、约40重量％的甘露糖醇、约8重量％的微晶体纤维素、约5重量％的羟丙基甲基纤维素和约2重量％的羟基乙酸淀粉钠；颗粒外相，其包含约17重量％的微晶体纤维素、约2重量％的羟基乙酸淀粉钠、约0.4重量％的硬脂酸镁；以及片剂之上的肠溶包衣，其包含约13重量％的(参见例如PCT公开No.WO/2010/054826，以其全部内容通过引用并入本文)。

示例性制剂包含：包含约35mg至约500mg的针对SMAD7的反义寡核苷酸或基本上由其构成的剂量形式。例如，在本文中设想了包含约35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg或250mg针对SMAD7的反义寡核苷酸的制剂。在一种实施方式中，制剂可以包含约40mg、80mg或160mg针对SMAD7的反义寡核苷酸。给药的量取决于各种变量，例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、抗体的体内效能、药物制剂和给药途径。初始剂量可以增加超过上限水平，以便快速获得所需血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最适量，并且可以在治疗过程中逐渐增加剂量。例如被设计成从40mg至160mg运行的常规I期剂量递增研究中，人类剂量可以被优化。给药频率可以随着多种因素例如给药途径、剂量和待治疗的疾病而改变。示例性的给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。在某些实施方式中，给药每天一次，共7天。优选的给药途径是皮下给药。

在某些实施方式中，本文中提供的方法还可以包含给药针对本文中描述的疾病和障碍的治疗的至少一种其他药剂。在一种实施方式中，所设想的其他药剂可以协同给药(例如顺序或同时地)。

所设想的药剂包含：免疫抑制剂包含糖皮质激素类、细胞抑制剂、抗体、作用于亲免蛋白的药剂、干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯和小的生物药剂。例如，所设想的免疫抑制剂包含但不限于：他克莫司，环孢霉素，吡美莫司，西罗莫司，依维莫司，霉酚酸，芬戈莫德，***，氟达拉滨，环磷酰胺，甲氨蝶呤，硫唑嘌呤，来氟米特，特立氟胺，阿那白滞素，抗胸腺细胞球蛋白，抗淋巴细胞球蛋白，莫罗单抗-CD3，阿福图珠(afutuzumab)，利妥昔单抗，teplizumab，依法利珠单抗，达利珠单抗，巴利昔单抗，阿达木单抗，英夫利昔单抗和依那西普。

所设想的药剂包含用于调控血糖水平的药物疗法，包含使用降血糖药和/或口服抗糖尿病药剂的口服疗法、注射疗法等。用于调控血糖水平的非药物疗法包括但不限于糖尿病和/或锻炼控制措施。

用于调控血糖水平的口服药物疗法包含降血糖药，其可以包含但不限于：阿卡波糖，乙酰苯磺酰环己脲，氯磺丙脲，达格列酮钠，格列美脲，格列吡嗪，格列本脲，瑞格列奈，曲格列酮，妥拉磺脲和甲苯磺丁脲。

用于调控血糖水平的口服药物疗法包含抗糖尿病药物，其可以包含但不限于：阿卡波糖，乙酰苯磺酰环己脲，丁福明，布托沙明盐酸盐，卡格列波糖，氯磺丙脲，环格列酮，恩格列酮钠，盐酸依托福明，格列胺脲，格列波脲，格列他尼，格列齐特钠，格列氟胺，格列吡嗪，胰高血糖素，格列本脲，格列己脲，格列嘧啶钠，格列辛脲，格列帕脲，低精蛋白胰岛素，人类胰岛素锌，长效胰岛素，赖脯胰岛素，利诺格列，富马酸利诺格列，二甲双胍，帕莫酸甲酯，帕莫酸钠盐，盐酸吡格列酮，吡咯格列酒石酸盐，人类胰岛素原，瑞格列奈，司格列肽乙酸盐，妥拉磺脲，甲苯磺丁脲，甲苯磺吡胺，曲格列酮和唑泊司他。

用于调控血糖水平的注射剂疗法可以包含但不限于速效胰岛素、长效胰岛素和相关的胰岛素。速效胰岛素包含常规胰岛素、速效胰岛素锌悬液和胰岛素、注射液、R、Iletin II、Novolin R、纯化的Pork常规胰岛素和Velosulin BR人类胰岛素。长效胰岛素包含鱼精蛋白胰岛素锌悬液、长效胰岛素锌悬液、胰岛素和U。其他胰岛素包含低精蛋白胰岛素悬液、NPH胰岛素、低精蛋白胰岛素；胰岛素锌悬液胰岛素、人类低精蛋白胰岛素悬液/人类胰岛素注射液、50/50、70/30和70/30。

实施例

通过下面的实施例对本发明进行进一步说明。提供实施例仅仅是出于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1：SMAD7反义寡核苷酸对NF-κB激活的影响

设计了HEK-Blue^TM(InvivoGen)TNF-α/IL-1β感应细胞，以通过监测NF-κB通路的激活来检测生物活性TNF-α和IL-1β。这些细胞通过用在融合到5个NF-κB和5个AP-1结合位点的IFN-β极小启动子控制下的SEAP报告基因稳定转染人类胚胎肾HEK293细胞来产生。HEK-Blue^TM(InvivoGen)CD40L感应细胞被用于通过经在CD40刺激后NF-κB激活后胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的分泌，来测量CD154(CD40L)的生物活性。这些细胞通过用人类CD40基因和可由NF-κB诱导的SEAP构建稳定转染HEK293细胞来产生。因此，HEK-Blue^TM细胞通过经在TNFR/CD40刺激后NF-κB激活后胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的分泌，来测量TNFα/CD40L的生物活性。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是参与全身炎症和免疫细胞调控的已知的细胞因子。CD40L是参与T-细胞激活和有效的免疫应答发展的共刺激蛋白，并且被认为参与自体免疫疾病包括T1DM的发展(Margolles-Clark,E.等，“小分子共刺激性阻断：CD40-CD154相互作用的有机染料抑制剂”(Small molecule costimulatory blockade:organic dye inhibitors of theCD40-CD154 interaction)，J.Mol.Med.,2009,87,1133-1143)。

将HEK Blue TNFα和CD40L感应细胞(Invivogen)(50,000/孔)与GED-0301反义(AS)或对照正义(S)寡核苷酸(OGN；4μg/mL)，在lipofectamine(LPF)存在下温育6小时，然后在培养基中温育18小时，然后在存在或不存在TGF-β(200ng/mL；24小时，DMEM P/S 2％血清)的情况下用TNFα(1ng/mL)或CD40L(25ng/mL)刺激。GED-0301是SMAD7反义寡核苷酸(GTXGCCCCTTCTCCCXGCAGC，其中X是5-甲基-2′-脱氧胞苷5′单磷酸(5-Me-dC)(SEQ ID NO：6))。在这些细胞中，由TNFα或CD40L诱导的SEAP分泌使用QUANTI-Blue^TM来定量，所述QUANTI-Blue^TM是由制造商提供并为此目的特意开发的比色酶测定法，其具有在SEAP存在下变成蓝紫色的介质，所述颜色变化可以通过在625-655nm处读取OD来定量。数据是使用每块板4份平行样的三次独立实验的平均值，使用归一化到在未处理的对照细胞中刺激的响应(单独的TNFα或CD40L)的值。

TGF-β和GED-0301对HEK-Blue细胞中NF-κB分别被TNFα和CD40L的激活的影响，示出在图2A和2B中。结果显示，TNFα和CD40L两者产生相当大的NF-κB活化(正如通过SEAP表达所测量的)，并且这两者都被TGF-β抑制。通过用SMAD7反义寡核苷酸GED-0301处理，这种抑制被进一步相当大地增强，表明这种处理能够增强和/或恢复TGF-β的效应。在细胞培养***中，取决于所使用的细胞类型，TGF-β可以促进或抑制NF-κB激活(Hong,S.等，“通过抑制核因子κB通路的激活，Smad7通过抗凋亡基因表达的抑制来致敏肿瘤坏死因子诱导的凋亡”(Smad7 sensitizes tumor necrosis factor induced apoptosis through theinhibition of antiapoptotic gene expression by suppressing activation of thenuclear factor-kappaB pathway)，Cancer Res.,2007,67,9577-9583以及其中的引用文献)。在B细胞和人类肠粘膜固有层单核细胞(LPMC)中，TGF-β是NF-κB的负调控因子。转染的HEK细胞的结果类似于对LPMC所观察到的，在LPMC中已显示，TGF-β1在正常LPMC中负调控NF-κB激活(因为用TGF-β1预处理抑制了TNF-α诱导的NF-κB激活)，并且用特异性Smad7反义寡核苷酸处理IBDLPMC，导致NF-κB激活的抑制(Monteleone,G.等，“在肠道炎症中，转化生长因子β1负调控的失效维持NF-κB持续激活”(A failure of transforming growthfactor-β1 negative regulation maintains sustained NF-κB activation in gutinflammation)，J.Biol.Chem.,2004,279,3925-3932)。

为了证实GED-0301能够穿透被测定的细胞，将HEK Blue感应细胞(50,000/孔)与荧光素标记的GED-0301 AS OGN在lipofectamine(LPF，Invitrogen)存在或不存在的情况下温育48小时，然后分析细胞摄取。显微镜成像证实了在lipofectamine存在下与荧光素标记的GED-0301温育的HEK Blue感应细胞比没有用lipofectamine处理的细胞显示出更好的摄取。

实施例2：SMAD7反义寡核苷酸在小鼠中的分布研究

向具有多次低剂量链脲菌素诱导的糖尿病(STZ，β-细胞特异性毒素；40mg/kgi.p.连续5天)的常规B6小鼠(6周，雄性；Jackson Lab.)，通过三种不同途径给药荧光素标记的GED-0301反义寡核苷酸(TriLink)：口服给药(p.o.)，腹膜内给药(i.p.)和皮下给药(s.c.)(125μg/小鼠＝5mg/kg；p.o.通过口腔喂食，使用500μL pH 9.5的碳酸氢盐溶液，以保护免受胃降解)。在两个不同时间点(4小时和24小时)，从两只不同动物收集器官并处理(一个用于显微术，一个用于流式细胞术)。收集下列器官：胰腺，肝，肾，脾，胸腺，肠，脑，血液，胰腺***，肱***，肠相关淋巴样组织。对于流式细胞分析来说，将器官用胶原酶D(Roche)消化，通过细胞滤网(70μm；BD Falcon)，重悬浮在HBSS中，并对活细胞(LIVE/可固定紫死细胞染色试剂盒；Invitrogen)和白细胞(抗小鼠CD45 APC；eBioscience)进行染色。然后使用BD LSR II流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)和软件FlowJo 7.2.2版(Ashland,OR)，对它们进行活细胞中的荧光素含量分析。图3A示出了一个实例以说明用于分析流式细胞术结果的选通方法。图3B包括为特定器官中活细胞中的相应摄取百分比获得的说明性流式细胞术结果，并且它们证实了通过胰腺、胰腺***和其他器官的显著的反义寡核苷酸摄取(FITC+的百分比)(在白细胞CD45+/FITC+和其他细胞CD45-/FITC+两者中)，特别是在s.c.给药后。一些器官例如脑未显示出显著摄取。这些结果证实，使用临床上可接受的给药途径包括皮下给药，可以将GED-0301递送到特定器官。

多通道高分辨率显微镜图像(图4)，证实了在荧光标记的反义寡核苷酸的皮下给药后GED-0301在小鼠胰腺中的分布，其与流式细胞术结果(图3B)相一致。颜色图例说明：绿色–荧光GED0301，灰色–DAPI(细胞核的标志物)，红色–胰岛素(指示产生胰岛素的β-细胞)，以及蓝色–CD45(指示CD45或白细胞共同抗原，LCA，其是白细胞这种包含免疫和炎性细胞的循环血液***的要素的标志物)。

实施例3：使用SMAD7反义寡核苷酸的体内研究

进一步的体内研究可用于确立在动物模型中的治疗效果。

在NOD小鼠中SMAD7反义寡核苷酸的高血糖症逆转研究

非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠例如NOD小鼠被用于干预型糖尿病预防试验，其中治疗仅在高血糖症发作后开始。NOD小鼠是1型糖尿病的常用动物模型(Roep,B.O.等，“(不)保证的满意：重新评估1型糖尿病动物模型的用途”(Satisfaction(not)guaranteed:re-evaluating the use of animal models of type 1 diabetes)，Nat.Rev.Immunol.,2004,4,989-997)，并且它们已被用于评估大量可能的治疗(Shoda,L.K.等，“NOD小鼠中的干预以及转化的含义的综合性评述”(A comprehensive review of interventions inthe NOD mouse and implications for translation)，Immunity,2005,23,115-126)。获得8周龄的糖尿病前期雌性动物(Taconic)，并且从第10周(适应环境后)开始，每周两次监测糖尿。在转为阳性的动物中，每周三次监测血糖水平(血糖)。连续两天具有升高的葡萄糖水平(非禁食血糖>200mg/dL)的动物接受一颗持续释放胰岛素小球植入物(LinBit,LinShin Canada,Inc.)，以避免严重的高血糖症和剩余的β-细胞的力竭/过度工作，并且开始对它们进行治疗。治疗是s.c.给药，因为这一途径与临床相关，并且上面描述的分配研究表明它在靶向胰腺、胰腺LN和可能感兴趣的其他器官中有效。将动物按照预定的旋转模式，以它们的高血糖症发展的次序指派到三个治疗组之一。每日给药治疗(GED-0301＝Smad7AS OGN；125μg/小鼠)和相应的对照(S OGN和仅盐水)。动物每周进行两次监测，并评估它们维持正常血糖的能力。在植入的胰岛素小球的效果消失(约25天)后，具有3个连续的>250mg/dL的葡萄糖读数的动物被当作患有糖尿病并处死，收集代表性器官(胰腺，PLN)。在未患有糖尿病的动物中，在10周后停止每日治疗，并对它们继续监测12周(直至总共150天)，以确定是否存在持久效果。在结束时，将所有动物处死并收集代表性器官(胰腺，PLN及其它)。

来自于研究的结果示出在图5中，其中血糖水平在图5A中，在图5B中示出了保持无糖尿病的动物的百分比随时间的变化的相应的Kaplan-Meier存活曲线。治疗在高血糖症发作后开始，此时β-细胞损伤已经发生。因此，严重的高血糖症可以非常快速地发展。正如由到第20-25天在具有持续释放胰岛素的LinBit植入物耗尽之后它们的高血糖症(血糖>250mg/dL)所指示的，用盐水或正义寡核苷酸对照治疗的所有动物发展出糖尿病(分别为n＝7和6)。对于用有活性的GED-0301反义寡核苷酸治疗的动物来说，直至治疗停止(第70天)后很长时间，研究结束(第150天)时，治疗的11只动物中的6只没有发展出高血糖症，并且它们保持无糖尿病。

为了验证无糖尿病动物在研究结束时(第150天)的葡萄糖响应，在几只GED-0301治疗的以及对照小鼠中进行了口服葡萄糖耐受试验(OGTT)。通过口腔喂食向禁食16小时的小鼠给药150mg的葡萄糖剂量，并以预定时间间隔收集血样直至150分钟。图6中示出的结果证实，葡萄糖响应以及因此胰岛素分泌能力与健康动物相当。在所有动物中，在口服刺激的150分钟内，血糖水平恢复正常。

对来自于到研究结束时(第150天)为患有糖尿病的GED-0301治疗的NOD小鼠的胰腺切片进行了高分辨率共聚焦显微镜成像，以证实产生胰岛素的β-细胞的存在。图7示出了来自于GED-0301治疗的小鼠及相应对照的胰腺的代表性含胰岛切片的一系列多通道Z-堆叠图像。不同的颜色(列)如下：蓝色是DAPI(细胞核的标志物)，红色是胰岛素(指示产生胰岛素的β-细胞)，绿色是胰高血糖素(指示产生胰高血糖素的α-细胞)。比例尺指示100μm。尽管正常的非糖尿病对照动物具有含有产生胰岛素和胰高血糖素的两种细胞的正常胰岛(顶行)，但在研究期间患有糖尿病的NOD小鼠从它们的胰岛中失去了产生胰岛素的β-细胞(底行；来自于未恢复正常血糖的正义寡核苷酸治疗的小鼠)。在高血糖症发作时开始的治疗后为患有糖尿病的GED-0301反义寡核苷酸(AS)治疗的动物，具有失去了其产生胰岛素细胞的几个胰岛(从上数第二行，示出了胰高血糖素的存在，但是未示出胰岛素)，但是它们也具有保留了产生胰岛素细胞的胰岛(从上数第三行)。因此，在高血糖症发作时开始的GED-0301治疗似乎能够对抗NOD小鼠中自体免疫攻击的效应，并保留足够数量的产生胰岛素的β-细胞，以维持正常血糖响应并避免高血糖症的发作。

胰岛移植中SMAD7反义寡核苷酸的研究

在实验性异体胰岛移植模型中，包括在隐匿性自体免疫疾病存在下，有望恢复在局部微环境中TGF-β信号传导。可以进行使用GED-0301的治疗以确立靶向SMAD7的反义寡核苷酸对异体胰岛移植物的存活和/或耐受的影响。具体来说，在通过给药β细胞特异性毒素(STZ)而产生糖尿病的啮齿动物中，可以确定GED-0301在异体移植模型中在防止胰岛排斥反应和/或延长胰岛存活中的效果。主要终点可以包括与移植位点中Smad7的表达/调节相关联的胰岛异体移植存活，T淋巴细胞、树突细胞上的活化标志物，Treg和其他抑制细胞的频率和抑制功能。

2型糖尿病中SMAD7反义寡核苷酸和低度炎症的研究

由于低度全身和局部炎症是糖尿病前期和2型糖尿病的特征，因此可以确定SMAD7在胰岛内低度炎症的发展中的潜在作用。此外，可以研究SMAD7在糖尿病中的胰岛血管并发症中的作用。

糖尿病肾病中SMAD7反义寡核苷酸的研究

在人类糖尿病肾病和其他蛋白尿性肾小球疾病中，Smad7被强烈上调。这种上调主要发生在足细胞这种负责肾小球过滤屏障的完整性和防止白蛋白尿的肾小球细胞中，所述白蛋白尿是普通群体中心血管结果的独立预测因子。TGF-β的靶向已成为大量转化研究努力(translational effort)的主题(使用吡非尼酮的试验)。在这些努力中，对于糖尿病肾病和其他慢性肾病的治愈来说，结果出人意料地是否定的。通过Smad7抑制来恢复正确的TGF-β信号传导，可能是治疗这些病症的有希望的新方法。由NIH糖尿病并发症学会(Consortium on Diabetic Complications)开发的已建立的糖尿病肾病实验模型，可用于产生关于软硬肾病转归(白蛋白尿、肾小球滤过率、肾小球硬化症)的初步体内数据。随后的临床研究可以在糖尿病研究所(Diabetes Research Institute)的糖尿病肾病诊所中开发。

SMAD7反义寡核苷酸对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的研究

具有Smad7过表达的胰腺β-细胞的小鼠，以胰岛素释放受损和禁食葡萄糖升高为特征。因此，Smad7抑制可能引起胰腺β-细胞功能的改善。可以在进行了遗传操作以表达不同水平的SMAD7的人类胰岛中，进行葡萄糖刺激的胰岛素释放实验。在将来的研究中，可以对人类患者进行研究以确定Smad7抑制在糖尿病前期受试者中的葡萄糖不耐受中的作用。

通过引用并入

本文中引用的每个专利文献和科技论文的全部公开内容，为所有目的通过引用并入本文。

等同性

本发明可以在不背离其本质特征的情况下体现为其他特定形式。因此，上述实施方式被视为说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。由随附的权利要求书而不是由前面的描述指明本发明的范围，并且意图将进入权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims (13)

1.一种有效量的针对SMAD7的反义寡核苷酸在制备用于治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用，所述针对SMAD7的反义寡核苷酸由选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所组成的组的序列所表示。

2.一种有效量的针对SMAD7的反义寡核苷酸在制备用于促进胰岛细胞移植后存活的药物中的应用，所述针对SMAD7的反义寡核苷酸由选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所组成的组的序列所表示。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述针对SMAD7的反义寡核苷酸由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所表示。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述SEQ ID NO：10的寡核苷酸的一个以上核苷间键是硫代磷酸酯键。

5.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述针对SMAD7的反义寡核苷酸为肠胃外给药。

6.如权利要求5所述的应用，其中，所述针对SMAD7的反义寡核苷酸为皮下给药。

7.如权利要求1所述的应用，所述应用包括给药包含所述针对SMAD7的反义寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。

8.如权利要求2所述的应用，所述应用包括给药包含所述针对SMAD7的反义寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。

9.如权利要求7或8所述的应用，其中，所述针对SMAD7的反义寡核苷酸由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10所表示。

10.如权利要求9所述的应用，其中，所述SEQ ID NO：10的寡核苷酸的一个以上核苷间键是硫代磷酸酯键。

11.如权利要求7或8所述的应用，其中，所述药物组合物为皮下给药。

12.如权利要求1或7所述的应用，其中，所述糖尿病选自由1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病所组成的组。

13.如权利要求7或8所述的应用，其中，所述药物组合物为肠胃外给药。