CN104450923A - 利用囊胚腔液游离dna检测胚胎染色体异常的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，包括以下步骤：囊胚腔液游离DNA的获取、囊胚腔液DNA的检测、游离DNA全基因组扩增、全基因组扩增产物分析、基因组DNA进行片段化处理、片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析、文库构建、上机测序、生物信息分析。本发明采用的高通量测序法避免了传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，能完整地分析单细胞基因组的遗传信息，操作简便，省时高效；同时，使用囊胚腔液游离DNA作为检测样本，取材方便、安全，导致后期胚胎发育出现异常的概率小，能保证胚胎在后续发育中不会受到影响。

Description

利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法

【技术领域】

本发明涉及分子细胞生物学领域，具体地说，是利用囊胚腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法。

【背景技术】

生物体内产生的某些特定生物标志物，诸如蛋白质、肽、脂质、RNA、DNA和他们的变体与修饰，可应用于疾病的诊断、预后和治疗。这些生物标志物可存在于多种体液中，包括血液、血浆、血清、母乳、腹水和尿液等，已被应用于癌症(***癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌等)、类似癌症、B细胞淋巴瘤、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病、性朊病毒疾病等相关疾病和遗传病检测。目前已经发现在孕妇外周血含有胎儿的循环游离DNA，并通过胎儿游离DNA来检测胎儿的染色体是否存在异常，此项技术已被广泛应用于临床。而在肿瘤患者的血液中发现的肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)目前也正在进行深入研究，有望被应用于肿瘤的临床检测和预后治疗。

基于以往的研究，用囊胚腔液游离DNA代替胚胎单个细胞进行胚胎植入前的检测成为可能，胚胎植入前遗传学检测是指胚胎植入着床之前，对体外受精的胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎染色体的结构和数目，分析胚胎是否有遗传物质异常的一种早期产前筛查方法。传统的胚胎植入前遗传学筛查主要采用的样本是卵裂期单卵裂球1-2个或囊胚期滋养外胚层细胞5-10个。这种通过取卵裂期或囊胚期单细胞进行胚胎植入前染色体筛查在临床应用较多，但是没有大量的临床数据证明，卵裂期或者囊胚期的单细胞取材对胚胎后期发育是否存在影响，因此在临床上寻找一种更安全的、对胚胎没有任何影响的检测标志物非常有必要。

目前，相对于Array-CGH，高通量测序技术在胚胎植入前检测上的应用已被证实更加准确、高效，因此利用囊胚腔游离DNA结合高通量测序技术进行胚胎植入前检测在取材和检测方式上更具优势。而这首先需要建立通过囊胚腔液游离DNA高通量测序进行染色体异常检测的流程。本发明通过对小鼠囊胚腔液的检测，发现在小鼠囊胚腔液中也存在游离的DNA，并对DNA进行基因组扩增，利用高通量测序技术，对扩增产物基因组DNA进行测序并进行生物信息学分析，与单细胞测序结果进行比较分析，结果无明显差异。这使得应用二代测序技术对人的囊胚腔液DNA进行胚胎植入前染色体检测迈出了一大步。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供基于非治疗目的的利用胚囊腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

基于非治疗目的利用胚囊腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，包括以下步骤：

(1)囊胚腔液游离DNA的获取：使用微穿刺技术，利用无菌的针头吸取，得到囊胚腔液游离DNA。

(2)囊胚腔液DNA的检测：使用实时荧光定量PCR的方法，检测囊胚腔液微量DNA的存在。

(3)游离DNA全基因组扩增：对分离得到的囊胚腔液游离DNA，使用DOP-PCR法，利用3’端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导，以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，进行全基因组DNA扩增，以达到二代测序技术所要求的DNA起始量。

(4)全基因组扩增产物分析：对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显示无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验；所述定量分析方法为琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100Bioanalyzer检测或Qubit dsDNA HS Assay Kit。

(5)基因组DNA进行片段化处理：使用酶切处理方法，将基因组DNA处理为适合Ion Proton测序***上机需要的片段大小，所述基因组DNA为囊胚腔液游离DNA使用Sigma基因组扩增试剂盒扩增后的DNA产物。

(6)片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析：对于片段化后的DNA，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量分析，使用Agilent 2100Bioanalyzer检测进行片段大小分析。

(7)文库构建：采用常规的全基因组DNA文库构建方法进行上机测序前文库构建处理；具体文库构建流程参考Life Tech的Ion Proton Library Protocol进行文库构建。

(8)上机测序：文库质检合格后，采用二代测序技术进行DNA测序，所述测序技术为Illumina Hiseq 2000测序***、AB Solid 4.0测序***、RocheGSFLX Titanium System***或Life Technologies Ion Proton。

(9)生物信息分析：对测序结果进行生物信息分析，通过对囊胚腔液游离DNA和正常胚胎的测序数据进行分析、研究和比较来检测胚胎染色体是否异常。

注：本发明的方法为应用于实验室科研及筛选，为非诊断或治疗目的发明。

本发明的目的是利用囊胚腔液游离DNA建立囊胚腔液高通量测序流程，以取代胚胎单细胞测序，作为胚胎植入前检测的新方法。

本发明提取了小鼠囊胚腔液体，用荧光定量PCR进行目的片段的检测，证实了小鼠囊胚腔液中存在游离的基因组DNA。

本发明进一步将囊胚腔液游离DNA测序与囊胚腔细胞测序结果进行比较分析，证实了囊胚腔液DNA测序结果与单细胞测序结果无明显差异，操作流程如下：

a、分离小鼠囊胚单细胞并进行裂解，得到完整的细胞基因组DNA；在显微操作条件下进行小鼠囊胚腔液游离DNA的抽取，获得微量基因组DNA。

b、进行单细胞和囊胚腔液DNA进行全基因组扩增

高通量测序技术要求起始DNA量为微克级别水平，需要经过全基因组扩增技术(WGA)，使DNA量达到能够进行上机测序的要求。已知的全基因组扩增技术包括两大类：基于PCR基础的WGA技术和基于等温反应基础的WGA技术，基于PCR基础的WGA技术包括：PEP、DOP-PCR、LM-PCR和MALBAC，基于等温反应基础的WGA技术如：PWGA、多重链置换扩增(MDA，Multiple Displancement Amplification)，本发明使用的DOP-PCR扩增技术，在全基因组扩增后进行质检和筛选，保证扩增后的产物可以进行基因组测序。

c、对扩增产物进行定量检测及定性检测

扩增产物定量检测和定性分析的方法主要有琼脂糖凝胶电泳法，Agilent2100生物分析法，荧光定量PCR等等。

d、检测合格的样品进行片段化处理

全基因组DNA进行片段化处理的方法有雾化、超声片段化法以及酶切处理法等，这些方法可以将基因组DNA处理成175bp左右的片段。

e、片段化DNA文库构建并测序

片段化的DNA经过末端修饰，使用末端修复酶进行修复处理，以产生平端化的DNA，然后使用该试剂盒的连接酶，在DNA两端加上接头，以此为模板进行PCR扩增。将扩增产物进行高通量测序，通过数据分析比较囊胚腔液DNA测序与囊胚细胞测序的区别。

在此基础上，本发明还公布了一种利用小鼠囊胚腔液进行测序分析从而检测小鼠胚胎染色体异常的方法。

本发明优点在于：利用本发明能高效地利用小鼠囊胚腔液DNA基因组进行分析和研究。一方面，采用的高通量测序法避免了传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，完整地分析单细胞基因组的遗传信息，操作简便，省时高效；另一方面，使用囊胚腔液游离DNA作为检测样本，取材方便、安全，导致后期胚胎发育出现异常的概率小，能够保证胚胎在后续发育过程中不会受到影响。

【附图说明】

附图1是本发明的小鼠囊胚腔液DNA取样过程。

附图2是本发明实施例2中的小鼠胚胎单细胞基因组测序数据在每条染色体的覆盖率情况。(15x)

附图3是本发明实施例2中的小鼠胚囊腔液DNA基因组测序数据在每条常染色体的覆盖率情况。(15x)

附图4是本发明实施例2中的小鼠胚胎单细胞基因组测序数据在每条染色体的平均测序深度情况。

附图5是本发明实施例2中小鼠胚囊腔液DNA基因组测序数据在每条常染色体的平均测序深度情况。

附图6是小鼠胚胎单细胞测序和小鼠囊胚腔液DNA测序进行9号染色体缺失分析。

附图7是小鼠胚胎单细胞测序和小鼠囊胚腔液DNA测序进行5号染色体重复分析。

【具体实施方式】

本发明公开了一种能够利用囊胚腔液游离DNA进行全基因组DNA扩增并进行高通量测序的方法，本发明的方法如下：

1.小鼠囊胚腔液游离DNA的获取

囊胚腔液游离DNA的获取：在显微操作仪下，使用微穿刺技术，利用无菌的针头吸取，得到囊胚腔液游离DNA。

2.小鼠囊胚腔液DNA的检测

小鼠囊胚腔液DNA的检测方法，采用实时荧光定量PCR的方法，荧光定量PCR可以用来检测微量DNA的存在，检测方法灵敏、准确。

3.游离DNA全基因组扩增

对分离得到的胚胎单细胞和囊胚腔液游离DNA，进行全基因组DNA扩增，以达到二代测序技术所要求的DNA起始量。本发明主要使用DOP-PCR法，此方法对主要是利用3’端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导，以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。

4.全基因组扩增产物分析

可以采用琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100 Bioanalyzer检测、Qubit dsDNA HSAssay Kit等方法对扩增的基因组DNA进行定量分析，检测结果显示无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验。

5.基因组DNA进行片段化处理

本发明主要使用酶切处理方法，将基因组DNA处理为适合Ion Proton测序***上机需要的片段大小，基因组DNA主要为小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液游离DNA使用Sigma基因组扩增试剂盒扩增后的DNA产物。

6.片段化目的DNA进行分析和定量

对于片段化后的DNA，主要采用琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100 Bioanalyzer检测、Qubit dsDNA HS Assay Kit等方法进行片段大小分析和定量分析。本发明使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量分析、Agilent 2100 Bioanalyzer检测进行片段大小分析。

7.文库构建

采用常规的全基因组DNA文库构建方法进行上机测序前文库构建处理，具体文库构建流程参考Life Tech的Ion Proton Library Protocol进行文库构建。

8.上机测序

文库质检合格后，采用二代测序技术进行基因组DNA测序，如IlluminaHiseq 2000测序***、AB Solid 4.0测序***化、Roche GSFLX Titanium System***和Life Technologies Ion Proton等测序仪，本发明使用Ion Proton测序***。

9.生物信息分析

对测序结果进行生物信息分析，通过对小鼠囊胚腔液游离DNA和小鼠单细胞基因组的测序数据进行分析、研究和比较。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1小鼠囊胚腔液游离DNA检测

(1)囊胚腔液收集

小鼠囊胚腔液的获得及处理：小鼠囊胚腔液DNA的获取和小鼠单细胞的获得是同一个小鼠胚胎，以便于进行试验结果比较。在显微操作实验室内，室温条件下，采用微穿刺技术取样。在吸取囊胚腔液DNA过程中，避免细胞质污染和滋养层细胞受损。小鼠囊胚腔液DNA取样过程如图1所示。

(2)目标基因和引物设计

使用GAPH和TBCD两个基因作为检测基因，设计引物进行定量分析检测。GAPDH和TBCD两个基因的扩增片段大小为100bp和120bp。

扩增引物序列如下。

GAPDH：

P1 TGTCTCACC TTATTAGCC

P2 CCGCAAAGAT TTTCAGAG

TBCD：

P3 CTGCGAGCGC CGCCGAGG

P4 TGTGCACCGC CGGCAAGC

(3)Real-time PCR检测

荧光定量PCR的反应体系：

含有PBS的囊胚腔液(～4μ)，P1、P2、P3、P4各0.5μl(10μmol)，SYBRGreen 10μl，PCR TagMIX 15μl，总的体系为30μl。轻弹管底将溶液混匀，短暂离心。反应体系配置操作时不要碰到PCR管，整个反应体系配置在冰上进行。荧光定量PCR的反应条件：94℃1min，{94℃30s，50℃30s，72℃30s(40cycles)}。

(4)PCR产物检测分析

溶解曲线显示结果均有单峰存在，配置2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以电压100V电泳30min，检测结果显示在100bp和120bp处有目的条带出现，说明囊胚液存在游离DNA。

实施例2

小鼠基因组测序覆盖度比较(小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液DNA)

(1)单细胞分离和囊胚腔液DNA获得及处理：

挑取10个小鼠胚胎单细胞样本和10个小鼠囊胚腔液样本，每个小鼠胚胎单细胞样本和小鼠囊胚腔液样本分别一一对应，来自同一个小鼠胚胎。

a.小鼠胚胎单细胞分离及处理：在显微镜下，通过激光打孔技术分离出单个细胞，分离的单个细胞放入含有不到2μl PBS的200μl PCR管中，加水至终体积为9μl。向PCR管中加入1μl新鲜配置好的细胞裂解缓冲液，混匀。将得到的混合液进行孵育：50℃1h，99℃4min，15℃hold，置于冰上冷却，离心。

b.小鼠囊胚腔液的获得及处理：小鼠囊胚腔液DNA的获取和小鼠单细胞的获得是同一个胚胎，以便进行试验结果比较，在显微操作实验室内，室温条件下，采用微穿刺技术进行取样。在吸取囊胚腔液DNA的过程中，避免细胞质污染和滋养层细胞受损。

(2)DOP-PCR全基因扩增

a：使用Sigma公司的GenomePlex Single Cell Whole Genome AmplificationKit单细胞全基因组扩增试剂盒。在含有单细胞DNA的PCR管中(步骤1的产物)加入2μl 1x Single Cell Library Preparation Buffer，再加入1μl LibraryStabilization Solution，混匀，95℃2min，15℃hold。置冰上冷却，离心，再置冰上。加入1μl Library Preparation Enzyme，混匀并短暂离心。加热样品：16℃20min，24℃20min，37℃20min，75℃5min，15℃hold。

b：向产物加入7.5μl 10x Amplification Master Mix、48.5μl水、5μl的DNAPolymerase，混合均匀，离心，进行扩增，条件如下：

95℃3min，{94℃30s，65℃5min(25cycle)}，15℃hold。

c：扩增产物进行纯化，去掉离子和杂质等。

(3)扩增产物质检：

使用Qubit dsDNA HS Assay Kit检测扩增产物浓度，按照试剂盒说明书进行操作。检测合格的产物，即总量超过1μl的产物，进行DNA文库构建及上机测序。经检测，本发明中单细胞样本扩增产物均大于1μl，囊胚腔液样本有9个扩增成功，其中1个样本浓度低于500ng，该样本我们也进行了后续的建库和测序。

(4)片段化处理：

按照NEB Next dsDNA Fragmentase试剂盒说明书进行试验操作，片段化处理结束，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit和Agilent 2100 Bioanalyzer进行结构分析。

(5)文库构建及上机测序

处理好的DNA样品，采用Ion Proton Library Protocol文库构建方法进行上机测序前文库构建处理，文库构建流程包括末端补平、连接反应和PCR扩增反应，文库构建产物进行质检，质检合格后，采用Ion Proton测序***进行小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液DNA测序分析。

(6)生物信息分析

用15x的测序数据量进行统计分析，将测序所得序列与小鼠基因组进行比对分析，统计各样本的覆盖率以及测序深度。图2为小鼠胚胎单细胞基因组测序覆盖率；图3为小鼠囊胚腔液游离DNA基因组测序覆盖率；图4为小鼠胚胎单细胞基因组测序平均深度；图5为小鼠囊胚腔液游离DNA基因组测序平均深度。结果显示1个囊胚腔液样本的覆盖率明显偏低，可能是由于单细胞扩增失败导致，其余囊胚腔液样本与单细胞样本分析结果无明显区别，说明囊胚腔液样本可取代单细胞样本进行染色体分析。10例小鼠囊胚单细胞及小鼠囊胚腔液DNA测序覆盖率和平均深度见表1。

表1 10例小鼠囊胚单细胞及小鼠囊胚腔液DNA测序覆盖率和平均深度统计表

实施例3

小鼠基因组测序染色体异常分析(小鼠胚胎单细胞和小鼠囊胚腔液DNA)

(1)本实验旨在分析囊胚腔液能够进行染色体异常分析，进行取代单细胞样本。挑选2个本实验室的基因敲除小鼠，其中一个为染色体缺失，一个为染色体重复。每个小鼠进行了囊胚腔液获取和胚胎单细胞分离，基因组DNA扩增后，扩增产物检测合格，进行片段化处理和文库构建，实验流程同实施例2。

(2)上机测序。对上述实验构建的样本进行质检，质检合格，采用IonProton***进行全基因组测序。

(3)生物信息分析。对小鼠的囊胚腔液DNA和小鼠的单细胞用Ion Proton***进行全基因组测序，测序深度为1x，测序结果经生物信息分析，结果显示有1个囊胚腔液样本和单细胞扩增样本均显示了9号染色体的缺失，有1个囊胚腔液样本和单细胞样本均显示了5号体染色体的重复。其中小鼠囊胚腔液测序和小鼠单细胞测序9号染色体的缺失见图6，小鼠囊胚腔液测序和小鼠单细胞测序5号染色体的重复见图7。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.基于非治疗目的利用胚囊腔液游离DNA检测胚胎染色体异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)囊胚腔液游离DNA的获取：使用微穿刺技术，利用无菌的针头吸取，得到囊胚腔液游离DNA；

(2)囊胚腔液DNA的检测：使用实时荧光定量PCR的方法，检测囊胚腔液微量DNA的存在；

(3)游离DNA全基因组扩增：对分离得到的囊胚腔液游离DNA，使用DOP-PCR法，利用3’端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导，以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，进行全基因组DNA扩增，以达到二代测序技术所要求的DNA起始量；

(4)全基因组扩增产物分析：对扩增的基因组DNA进行定量分析，分析检测结果显示无降解、无污染、符合二代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以进行下一步实验；所述定量分析方法为琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100Bioanalyzer检测或Qubit dsDNA HS Assay Kit；

(5)基因组DNA进行片段化处理：使用酶切处理方法，将基因组DNA处理为适合Ion Proton测序***上机需要的片段大小，所述基因组DNA为囊胚腔液游离DNA使用Sigma基因组扩增试剂盒扩增后的DNA产物；

(6)片段化目的DNA进行定量分析和片段大小分析：对于片段化后的DNA，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量分析，使用Agilent 2100Bioanalyzer检测进行片段大小分析；

(7)文库构建：采用常规的全基因组DNA文库构建方法进行上机测序前文库构建处理；

(8)上机测序：文库质检合格后，采用二代测序技术进行DNA测序，所述测序技术为Illumina Hiseq 2000测序***、AB Solid 4.0测序***、RocheGSFLX Titanium System***或Life Technologies Ion Proton；

(9)生物信息分析：对测序结果进行生物信息分析，通过对囊胚腔液游离DNA和正常胚胎的测序数据进行分析、研究和比较来检测胚胎染色体是否异常。