CN104436182B - 一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法，通过选定菌液浓度为2.4×10⁹CFU/mL，在冰浴条件下，使用超声波粉碎机Φ6的变幅杆，对菌液进行超声波破碎处理，破碎条件为超声波输出功率400W，单次辐射时间12s和超声波间隔时间16s交替循环、总辐射时间16min，获得了高达94％的破碎率，同时抗原效价保持为1/320的浸泡疫苗。通过此方法，既获得了大量的亚单位菌体碎片，提高了浸泡免疫时鱼对疫苗的吸收率，又最大限度保持了细菌的抗原活性。与传统全菌浸泡疫苗相比，相对免疫保护率达38.14％，为制备嗜水气单胞菌菌体成分亚单位浸泡疫苗，防止渔业生产中爆发危害极大的细菌性败血病提供了一种良好的解决方案。

Description

一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)属弧菌科气单胞菌属，是人类、鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类的共同致病菌。致病性嗜水气单胞菌是池塘养殖鱼类爆发细菌性性败血症的重要病原，常致鱼类大量死亡。

在国内，嗜水气单胞菌的防治以抗生素和化学药物为主。使用抗生素和化学药物防治会引起鱼类生理障碍及药物残留、环境污染、水中有益菌群失调，进一步会提高细菌的抗药性并潜在影响着人类细菌性传染病的防治，且由于养殖业抗菌药物的不恰当使用，致病性嗜水气单胞菌已经具有磺胺、四环素、链霉素以及氯霉素的多重抗药性，治疗效果较差。目前，使用疫苗防治是效果较好的方法，疫苗在在水产动物的施用中，主要方式有注射免疫和浸泡免疫，注射免疫效果最好，但对于鱼类实际应用性差。浸泡免疫是最适合渔业生产的免疫方式，具有鱼体应激小、可操作效果好、受养殖者欢迎的优点。但是在浸泡免疫中，全菌苗由于颗粒大，难以被鱼体侧线及鳃吸收，导致免疫效果较差。因此，利用超声波破碎嗜水气单胞菌，制备出小颗粒的菌体亚单位疫苗，然后进行浸泡免疫有助于克服传统浸泡免疫的缺点，取得较好的免疫效果。本发明即为制备嗜水气单胞菌浸泡免疫菌体成分亚单位疫苗的一种方法。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种新型的嗜水气单胞菌的菌体亚单位浸泡疫苗制备方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的是提供一种嗜水气单胞菌菌体成分亚单位浸泡免疫疫苗的方法，用于制备嗜水气单胞菌菌体成分亚单位浸泡疫苗，克服全菌灭活苗在对鱼类浸泡免疫过程中由于颗粒大、不易被吸收导致免疫效果较差的问题，为防止渔业生产中嗜水气单胞菌导致的细菌性性败血症发生提供实用的解决方法。

本发明提供了一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法，所述方法选用浓度为2.4×10⁹CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液，使用超声波粉碎机Φ6变幅杆进行超声破碎，超声波粉碎机工作参数设定为：输出功率400W，单次超声辐射12s和超声波间隔16s交替循环，超声波辐射总时间16min。

进一步地，所述浓度为2.4×10⁹CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液具体制备方法为：将嗜水气单胞菌接种于pH 7.5的胰酪胨大豆肉汤培养基中，于28℃、160rpm摇床震荡培养24h；24h后将得到的培养液移入置于50mL规格的高速塑料离心管内，置于大容量低温高速离心机4℃、12000rpm离心20min，完毕后弃上清液，加入适量生理盐水制成浓度为2.4×10⁹cfu/mL的菌悬液。

进一步地，所述使用超声波粉碎机Φ6变幅杆进行超声破碎具体包括超声波破碎菌体前准备，所述超声波破碎菌体前准备的具体方法为：将制备好的菌悬液30mL置50mL规格的高速塑料离心管内，将离心管置于碎冰当中固定，选用工作频率为20-24KHz的超声波细胞粉碎机，选用Φ6变幅杆，***离心管的液面以下，并接近离心管底部6-10mm位置，不接触管壁。

进一步地，所述使用超声波粉碎机Φ6变幅杆进行超声破碎具体包括使用超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，破碎过程中及时添加碎冰。

进一步地，所述使用超声波粉碎机Φ6变幅杆进行超声破碎还包括破碎完毕后使用0.1％甲醛、18h杀灭剩余活菌体，即制成目的浸泡疫苗。

进一步地，所述目的浸泡疫苗置于4℃冰箱保存。

本发明取得的有益效果是：是一种免疫效果较好的的嗜水气单胞菌菌体亚单位浸泡疫苗的制备方法，方法简便快速，细胞破碎率高达94％且抗原活性保持为1/320。易于实验室及工厂利用本发明实现大量获取嗜水气单胞菌胞内容物及制备嗜水气单胞菌菌体成分亚单位疫苗。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1不同超声波功率对破碎率及抗原活性的影响。

图2不同超声波单次辐射时间对破碎率及抗原活性的影响。

图3不同超声波辐射总时间对破碎率及抗原活性的影响。

图4不同超声间隔时间对破碎率及抗原活性的影响。

图5不同菌液浓度对破碎率及抗原活性的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明的一个较佳实施例提供了一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)制备嗜水气单胞菌菌悬液

1.1)嗜水气单胞菌活化

将嗜水气单胞菌接种于pH 7.5的胰酪胨大豆肉汤培养基中，于28℃、160rpm摇床震荡培养24h。

1.2)嗜水气单胞菌菌体细胞的清洗与富集

将培养液置于大容量低温高速离心机，以4℃，12000rpm，20min离心除去培养液，加入适量无菌生理盐水制成菌悬液，再次以上述条件用离心清洗细胞一次，弃上清，加入适量生理盐水重悬细菌。测量600nm处OD值，对比标准曲线，调整菌悬液浓度为2.4×10⁹cfu/mL，将调好浓度的菌液30mL置于50mL高速塑料离心管内备用。

2)超声波破碎菌体前准备

待破碎菌液在超声波细胞粉碎机中的安置。打开JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机之隔音箱，选用Φ6变幅杆，将前述调整好菌液浓度的离心管套进超声波变幅杆，使超声波变幅杆尖端深入液面以下，然后将离心管垂直固定于盛放碎冰烧杯的碎冰中央并用碎冰压紧，注意变幅杆不要接触离心管壁，距离底部6-10mm，关闭隔音箱门。

3)超声波破碎条件的设定

4)超声波破碎并收集菌体破碎碎片

启动超声波细胞粉碎机进行细胞破碎，破碎过程中及时添加碎冰。完毕后使用0.1％甲醛、18h杀灭剩余活菌体，即制成目的浸泡疫苗，置于4℃冰箱保存。

其中，超声波通过强烈的空化作用使菌体细胞破裂，其破碎效果与超声波功率、每次辐射时间、破碎总时间、菌液浓度、微生物类型等因素有关，但同时超声波对抗原活性也有一定损害。为取得高破碎率及尽可能保持抗原活性，需要对上述因素进行超声波破碎条件的单因素试验优化。

超声波破碎条件的单因素优化包括：

1)超声波功率优化

取上述制备好的菌液30mL置于50mL规格的高速塑料离心管中，选择超声波单次辐射时间10s，超声间隔时间20s交替循环，工作总时间为10min，分别以200W、300W、400W、500W、600W的输出功率进行细胞破碎。对破碎后菌液使用微量凝集法和试管凝集法测定抗原活性，然后对悬液离心后弃上清液，等体积重悬，检测破碎率，发现400W-500W时抗原活性和破碎率均为较好水平，参见说明书附图1。

2)超声波单次辐射时间优化

取上述制备好的菌液30mL置于50mL规格的高速塑料离心管中，选用超声破碎的条件为超声间隔时间20s，输出功率400W，工作总时间10min，超声波单次辐射时间分别为5s，10s，15s，20s，25s的条件进行细胞破碎。对破碎后菌液使用微量凝集法和试管凝集法测定抗原活性，然后将悬液离心后弃上清液，等体积重悬，检测破碎率，发现单次辐射时间10s-15s时抗原活性和破碎率均为较好水平，参见说明书附图2。

3)超声波破碎总时间优化

取上述制备好的菌液30mL置于50mL规格的高速塑料离心管中，选用超声破碎的条件为输出功率为400W，超声波单次辐射10s，超声间隔时间20s交替循环，超声波工作总时间分别设定为5min，10min，15min，20min，25min进行细胞破碎。对破碎后菌液使用微量凝集法和试管凝集法测定抗原活性，然后将悬液离心后弃上清液，等体积重悬，检测破碎率，发现超声波工作总时间10min-15min时抗原活性和破碎率均为较好水平，参见说明书附图3。

4)超声波破碎辐射间隔时间的优化

取上述制备好的菌液30mL置于50mL规格的高速塑料离心管中，选用超声波输出功率为400W，单次辐射10s，工作总时间为10min，调整间隔时间分别为8s，14s，20s进行超声波细胞破碎。对破碎后菌液使用微量凝集法和试管凝集法测定抗原活性，然后将悬液离心后弃上清液，等体积重悬，检测破碎率，发现间隙时间为8s-12s时抗原活性和破碎率均为较好水平，参见说明书附图4。

5)超声波破碎使用菌液浓度的优化

选择超声波输出功率为400W，超声波单次辐射10s，超声波间隙20s交替循环，超声波工作总时间10min，调整菌浓度为1.2×10⁹CFU/mL、2.4×10⁹CFU/mL、3.6×10⁹CFU/mL，4.8×10⁹CFU/mL进行超声波细胞破碎；对破碎后菌液使用微量凝集法和试管凝集法测定抗原活性，然后将悬液离心后弃上清液，等体积重悬，检测破碎率，发现菌浓度为2.4×10⁹CFU/mL时抗原活性和破碎率均为较好水平，参见说明书附图5。

按照单因素试验结果，决定固定菌液浓度为2.4×10⁹CFU/mL，然后对超声波功率、每次辐射时间、破碎总时间、超声间隔时间4个因素，每个因素选择3个水平(表1)，采用L9(34)表，以抗原活性和破碎率为测定指标完成正交试验，每组做3个平行实验，探索最佳制备工艺(表1)。

表1 正交试验因素水平表

正交实验结果表明，获取最好破碎率和抗原活性的优组合均为：超声波功率400W，单次辐射时间12s、总辐射时间16min、间隔时间12s(表2)。

表2 正交实验结果

按照优组合方案与实验3方案做对比验证实验，每组3重复，优组合破碎率分别为90.2％，88.5％，88.5％，抗原效价分别为1/320、1/160、1/160；试验3方案破碎率分别为93.5％，94.7％，93.7％，抗原效价1/320、1/320、1/160。方差分析表明此二方案的破碎率差异极其显著(P＝0.002<0.01)。但是抗原效价无明显差异(P>0.05)，故决定采用破碎率高的试验3方案为最终疫苗制备方案，即超声波功率400W、单次辐射时间12s和超声波间隔时间16s交替循环、总辐射时间16min，菌液浓度2.4×10⁹CFU/mL。破碎率达94％，抗原效价1/320。

按照最终疫苗制备方案(菌液浓度为2.4×10⁹CFU/mL，单次辐射时间12s、间隙时间16s、总辐射时间16min，超声波功率400W)制备菌体亚单位浸泡疫苗作为免疫组，同时制备菌液浓度为2.4×10⁹CFU/mL的普通全菌浸泡疫苗作为对照组，将两种菌液都稀释到1×10⁸cfu/mL。取饲养1周健康且体重为20g左右的60尾鲤鱼，先于2％的生理盐水中脱水2min，然后每30尾分别放入盛有免疫组、对照组疫苗的容器中浸泡30min后放回正常条件下进行饲养。分别于第一次免疫后10天、20天、30天、60天重复上述实验操作，距离第1次免疫120天对2组鱼按照20倍LD50浓度腹腔注射嗜水气单胞菌液进行攻毒(0.2mL/尾)，之后放入28℃恒温水中养殖，一周后统计2组鱼死亡率，计算相对保护率。

结果表明：免疫组死亡13条(死亡率43.3％)，对照组死亡21条(死亡率70.0％)，免疫保护率分别为56.7％和30.0％。按照相对保护率(RSP)＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]*100％公式计算，相对保护率为38.14％，取得了比较满意的免疫效果。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法，其特征在于，所述嗜水气单胞菌超声破碎菌体成分亚单位疫苗制备方法包括：

(1)将嗜水气单胞菌接种于pH 7.5的胰酪胨大豆肉汤培养基中，于28℃、160rpm摇床震荡培养24h；24h后将得到的培养液移入置于50mL规格的高速塑料离心管内，置于大容量低温高速离心机4℃、12000rpm离心20min，完毕后弃上清液，加入生理盐水制成浓度为2.4×10⁹cfu/mL的菌悬液；

(2)将制备好的菌悬液30mL置50mL规格的高速塑料离心管内，将离心管置于碎冰当中固定，选用工作频率为20-24KHz的超声波细胞粉碎机，选用Φ6变幅杆，***离心管的液面以下，并接近离心管底部6-10mm位置，不接触管壁；超声波粉碎机工作参数设定为：输出功率400W，单次超声辐射12s和超声波间隔16s交替循环，超声波辐射总时间16min；破碎过程中及时添加碎冰；

(3)破碎完毕后使用0.1％甲醛、18h杀灭剩余活菌体，即制成目的浸泡疫苗；

(4)目的浸泡疫苗置于4℃冰箱保存。