CN102139103B - 半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备与使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法，其特征在于：将美人鱼发光杆菌ST1菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃培养24h，加入终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，得灭活菌体；取黄芪用蒸馏水浸泡后煎煮，过滤，浓缩得黄芪浸出液；将灭活菌体与得黄芪浸出液混合制得半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗。本发明疫苗能使半滑舌鳎产生良好的免疫应答，增强半滑舌鳎对病原美人鱼发光杆菌的免疫力，提高半滑舌鳎养殖的成活率，增加半滑舌鳎养殖的产量，提高半滑舌鳎养殖生产的经济效益。从根本上解决了目前半滑舌鳎养殖生产过程中易发生美人鱼发光杆菌所致疾病的问题。本发明还公开了一种半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物抗病疫苗的制备方法，特别是涉及一种半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法。本发明还涉及该疫苗的使用方法。
背景技术
美人鱼发光杆菌广泛存在于海水及寄生于海产动物中，主要感染变温动物尤其是养殖鱼类，除感染雀鲷科鱼类外，还感染鲨鱼、大菱鲆、五条鰤、半滑舌鳎等，对水产养殖生产的危害是相当严重的，近年来，随着半滑舌鳎养殖规模的扩大，由美人鱼发光杆菌引起的疾病给半滑舌鳎养殖生产造成了很大的损失，因此，对美人鱼发光杆菌引起的疾病的有效预防，以最大限度地降低其危害程度，将能显著地提高半滑舌鳎养殖生产的经济效益。
目前尚未见有半滑舌鳎抗病疫苗的研究与应用，目前养殖户大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制疾病的发生与流行，市场上缺乏一种适用于半滑舌鳎的抗美人鱼发光杆菌疫苗。因此，开发研制半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗，对于有效控制半滑舌鳎美人鱼发光杆菌引起的疾病的发生与流行具有重要的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高半滑舌鳎免疫力、降低半滑舌鳎养殖生产中由病原美人鱼发光杆菌所造成的危害、以满足半滑舌鳎养殖生产上的抗病需求的半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法。
本发明所要解决的另一个技术是提供了几种如上所述的半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的免疫使用方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法，其特点是：它以美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其具体步骤如下：
（1）将美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃培养24h，加入终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，得灭活菌体；
（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；
（3）将灭活菌体与得黄芪浸出液混合，制得水剂型黄芪佐剂半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗；疫苗中病原美人鱼发光杆菌免疫原为1.17×1011cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL。
本发明方法中涉及的美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）已经在《半滑舌鳎病原美人鱼发光杆菌表型及分子特征》（Phenotypic and molecular characterization of Photobacterium damselae, a pathogen of the cultured tongue sole Cynoglossus semilaevis in China.）中公开，该公开文献的发表刊物为：新西兰《海洋与淡水研究》，2011, 45 (1):1-13（New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research, 2011, 45 (1):1-13.）。该菌株的分离菌DNA序列长度及登录号如下表：
分离菌DNA序列长度及登录号
以上所述的制备方法所制得的半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的免疫使用方法是：
1、它可以采用浸泡免疫的方法：先将半滑舌鳎在充气条件下用质量浓度为8% 的NaCl溶液浸泡5min，然后按体积比1：5用水稀释半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗得半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗溶液，再将半滑舌鳎放于半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗溶液中充气浸泡1h，一周后按前述方法加强免疫1次。
2、它可以采用注射免疫的方法：取体长为15-20cm的半滑舌鳎按0.2mL/尾的免疫剂量进行初次注射免疫，后每隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。
3、它可以采用口服免疫方法：将硬颗粒饲料用半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗浸泡后投喂，每天半滑舌鳎摄入灭活菌体量为1.17×107cells/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行加强免疫一周。
发明人于2010年度2月~5月在江苏省淮海工学院水产动物病害实验室用本发明的制备的疫苗及免疫方法进行半滑舌鳎免疫保护实验。免疫期结束后，受免鱼尾静脉取血，分离免疫血清，与美人鱼发光杆菌全菌抗原进行血清凝集反应，测定血清抗体凝集效价。实验结果为本发明的美人鱼发光杆菌疫苗经浸泡、口服及注射三种方式免疫半滑舌鳎，受免鱼均能产生免疫应答，以注射方式免疫效果最好，血清抗体效价最高，浸泡、口服及注射三种方式免疫的受免鱼血清抗体效价分别为1:16、1:128、1:8192。
免疫鱼血清抗体效价
| 组别 | 血清抗体效价 |
| 浸泡免疫组 | 1:16 |
| 口服免疫组 | 1:128 |
| 注射免疫组 | 1:8192 |
本发明半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗及其免疫使用方法，能使半滑舌鳎产生良好的免疫应答，增强半滑舌鳎对病原美人鱼发光杆菌的免疫力，提高半滑舌鳎养殖的成活率，增加半滑舌鳎养殖的产量，提高半滑舌鳎养殖生产的经济效益。从根本上解决了目前半滑舌鳎养殖生产过程中易发生美人鱼发光杆菌所致疾病的问题。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法，它以美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其具体步骤如下：
（1）将美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃培养24h，加入终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，得灭活菌体；
（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；
（3）将灭活菌体与得黄芪浸出液混合，制得水剂型黄芪佐剂半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗；疫苗中病原美人鱼发光杆菌免疫原为1.17×1011cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL。
实施例2。一种如实施例1所述的制备方法所制得的半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的使用方法。它采用浸泡免疫的方法，先将半滑舌鳎在充气条件下用质量浓度为8% 的NaCl溶液浸泡5min，然后按体积比1：5用水稀释半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗得半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗溶液，再将半滑舌鳎放于半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗溶液中充气浸泡1h，一周后按前述方法加强免疫1次。
实施例3。一种如实施例1所述的制备方法所制得的半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的使用方法。它采用注射免疫的方法，取体长为15-20cm的半滑舌鳎按0.2mL/尾的免疫剂量进行初次注射免疫，后每隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。
实施例4。一种如实施例1所述的制备方法所制得的半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的使用方法。它采用口服免疫方法，将硬颗粒饲料用半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗浸泡后投喂，每天半滑舌鳎摄入灭活菌体量为1.17×107cells/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行加强免疫一周。
Claims (1)
1.一种半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备方法，其特征在于：它以美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其具体步骤如下：
（1）将美人鱼发光杆菌ST1（Photobacteriumdamselae ST1）菌株接种在普通营养琼脂肉汤培养基上，28℃培养24h，加入终浓度0.3%的甲醛28℃灭活48h，得灭活菌体；
（2）取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/mL，得黄芪浸出液；
（3）将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制得水剂型黄芪佐剂半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗；疫苗中病原美人鱼发光杆菌免疫原为1.17×1011cells/mL，黄芪浸出液为1g/mL。
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