CN104435025A - 苦丁茶在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苦丁茶的新用途,即苦丁茶在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途,特别是苦丁茶提取物及苦丁茶总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
Description
技术领域
本发明涉及苦丁茶的新用途,特别是苦丁茶提取物及苦丁茶总黄酮的新用途,即在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆(VD)是老年期痴呆中最常见的类型。《中国老年学杂志》收载的“阿尔茨海默病发病机制中炎性反应的研究进展”,公开了AD占痴呆病人总数的50%~60%,VD占15%~20%。其特征性病理学改变是大脑皮层和皮层下神经原纤维缠结(NFT)、细胞外大量老年斑(SP)形成及神经元缺失。大量研究认为β淀粉样蛋白(βamyloidprotein,Aβ)在AD发病中起着主轴作用,Aβ的神经毒作用是多种因素导致AD发病的共同通路。目前针对Aβ的神经毒作用的防治措施主要有以下几方面:减少Aβ的前体即β淀粉样前体蛋白(βamyloidprecursorprotein,APP)的量;调节APP的裂解,减少Aβ的产生;促进Aβ的降解和清除;防止Aβ的聚集和沉积;阻断Aβ作用机制的关键环节等(“阿尔茨海默病中β淀粉样蛋白神经毒性作用研究进展”,《中国神经精神疾病杂志》)。
《本草纲目》中记载苦丁茶煮饮能止渴、明目、除烦,令人不唾,消痰利水,通小肠,治淋,止头痛烦热,噙咽,清上膈,利咽喉。《中国医学大辞典》记载苦丁茶“散肝风,清头目,治耳呜,耳聋,聤耳流脓,活血脉,凉子宫。”
苦丁茶中含有苦丁皂甙、氨基酸、维生素C、多酚类、黄酮类、咖啡碱、蛋白质等200多种成分。苦丁茶中的化学成分主要为黄酮类和三萜及皂苷类。目前从大叶冬青及苦丁茶冬青植物中分离鉴定出8种黄酮类成分,多为黄酮及黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮类化合物及Kaempferol、Isorhamnetin、Nicotiflorin、Quercetin。
根据已有的苦丁茶研究结果,认为苦丁茶具有降糖降脂、降血压、抗菌、抗氧化、调节免疫、减肥清脂、改善心脑***及抗生育等多种作用。
“苦丁茶的心血管药理作用研究”《中药材》公开通过大鼠实验表明:苦丁茶水提取液对于防治冠心病缓解心绞痛是有益的。
“苦丁茶冬青叶的降压作用研究”《医学教育探索》公开苦丁茶冬青叶提取物对2K1CH大鼠和SHR这两种重要的研究人类原发性高血压发病机理不可缺少的动物模型均可产生明显降压作用。
“苦丁茶降血脂的实验及临床研究”《护理研究》对苦丁茶醇溶和醇不溶两种成分进行了实验和临床研究,结果苦丁茶醇溶和醇不溶两种成分均有明显地降低大鼠三酰甘油的作用;对人的降脂总有效率为78.57%,对血脂异常者,TC、TG降低,HDL-C升高。
“苦丁茶提取物抗氧化作用的研究”《广西民族学院学报》,公开苦丁茶提取物对大鼠肝体外脂质过氧化均有一定的抑制作用。而且大叶冬青叶水煎液对大鼠肾上腺素性高血糖有明显抑制作用,临床使用可显著调节患者的各项指标和临床症状,疗效明显。
“苦丁茶对豚鼠离体气管平滑肌收缩功能的影响”《中国中药志》表明苦丁茶可拮抗多种介质引起的支气管平滑肌收缩作用,可能具有非特异性气管平滑肌Ca2+拮抗作用。
“苦丁茶对小鼠免疫功能的影响”《牡丹江医学院学报》发现苦丁茶煎液有增强和调节机体免疫功能作用的结论。
“苦丁汤治疗慢性***80例疗效观察”《广西中药》发现自拟苦丁茶汤对慢性***炎的主要症状具有良好的改善作用,其中对局部疼痛不适和尿道症状改善尤为明显。
“苦丁茶提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆的影响”《中国老年学杂志》发现苦丁茶提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆力具有促进作用。
此外,还有一些文献公开了苦丁茶冬青具有提高小鼠耐缺氧,耐低温,增加运动能力的作用;对胃癌患者化疗后静脉炎、血管硬化有一定治疗作用;有一定的抗肿瘤活性,而其中老叶乙醇提取物和鲜叶挥发油抗肿瘤活性最高。
目前从冬青科苦丁茶中分离鉴定出8种黄酮类成分,多为黄酮及黄酮醇,二氢黄酮,二氢黄酮类化合物及Kaempferol(山奈酚)、Isorhamnetin(异鼠李素)、Nicotiflorin、Quercetin(槲皮素)。与苦丁茶总黄酮相关的研究如下:
“苦丁茶抗氧化成分及抗氧化性能研究”《广西植物》公开了从大叶冬青中分离的多酚、多糖、生物碱、黄酮类物质在不同油脂,不同温度下,都具有明显抗氧化性能。
“大叶冬青叶若干生化指标测定及抗菌活性研究”《扬州大学学报(农业与生命科学版)》公开了大叶冬青微波干燥叶中总黄酮甙元、总黄酮甙总生物碱等具有一定抗菌活性。
目前没有文献资料提到冬青科苦丁茶或苦丁茶总黄酮可用于治疗阿尔兹海默病。
发明内容
本发明的目的是提供苦丁茶在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途;
本发明的另一目的是提供苦丁茶提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途;
本发明的另一目的是提供苦丁茶总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途;
本发明的另一目的是提供苦丁茶提取物的制备方法;
本发明的另一目的是提供苦丁茶总黄酮的制备方法。
本发明的目的是通过下列的技术方案实现的:
本发明原料来源:
苦丁茶:冬青科植物苦丁茶IlexkudingchaC.J.Tseng的干燥叶。收载在《广西中药材标准》1990年版第63页。【性味】苦、甘,凉。【功能与主治】散风热,清头目,除烦渴。用于头痛,齿痛,目赤,耳鸣,耳中流脓,热病烦渴,痢疾。
发明人在研究阿尔兹海默病的治疗过程中发现,冬青科植物苦丁茶特别是苦丁茶所含总黄酮表现出能减少神经细胞内β-淀粉样多肽的聚集,同时还具有神经保护作用,实现了对阿尔兹海默氏病病理进程的干预和病理症状的显著改善,从而有效治疗阿尔兹海默病。
AD等神经元退行性疾病发病机理复杂,其中氧自由基引起的过氧化损伤是AD等老年疾病发病的重要因素。SOD是机体清除自由基的重要酶类,其作用主要是催化生物氧化产生超氧自由基,清除并阻止由氧自由基引发的自由基连锁反应。MDA是自由基对生物细胞膜损伤的主要代谢产物,能使生物膜变性、坏死,使DNA发生突变、交链,同时使SOD活性降低,而造成自由基连锁反应的恶性循环。脑老化过程中,神经细胞膜不饱和脂肪酸被氧化产生大量自由基,损伤细胞膜、细胞器,产生炎症反应,最终引起细胞凋亡、退行性病变、学习记忆能力下降,最终导致AD等众多老年病的发生。在研究中发现,苦丁茶及苦丁茶总黄酮的给予明显减少了大鼠脑组织MDA含量的增加,而同时能够提供大鼠脑组织的SOD活性,这些数据表明苦丁茶总黄酮对AD大鼠脑组织氧自由基的清除具有明显的改善作用。
目前已有大量的研究证实了抗自由基在治疗AD的重要作用。苦丁茶总黄酮作为抗自由基作用机制可能是:用于脂质过氧化物,打断链锁反应,抑制不饱和脂肪酸过氧化,抑制磷脂酶A2及脂化酶活性,减少自由基形成。当然,苦丁茶总黄酮对AD大鼠的保护作用可能是一个复杂的机制,其具体机制还需做进一步研究。虽然目前对其具体作用机制还不完全明了,但苦丁茶总黄酮对AD等模型动物脑损伤、神经元退变都具有较好的治疗及保护作用,其对AD等神经元退变疾病的防治提供了另一种启示:即抗自由基在AD等神经元退行性疾病中可能扮演着重要角色,而通过抗自由基的使用对神经元退行性疾病可能取得不错的疗效。
本发明专利临床应用的安全性较高,在治疗阿尔兹海默病的药物治疗中不失为一种好药,其拓宽了治疗阿尔兹海默病的新方法,同时为患者解决了现有技术治疗阿尔兹海默病时出现的不良反应。
因此,申请人提供苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶总黄酮能够用于治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
本发明还公开了苦丁茶提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用,所述苦丁茶提取物的制备包括以下步骤:
苦丁茶粉碎,加入浓度为40-80%的乙醇加热回流提取三次,每次乙醇用量为药材总重量10-20倍量,每次提取时间为30-60分钟,提取温度为60-80℃,合并提取液,浓缩,过滤,得苦丁茶提取物。
本发明还公开了苦丁茶总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用,所述苦丁茶总黄酮的制备包括以下步骤:
苦丁茶粉碎后,加入浓度为40-80%的乙醇微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量10-20倍量,每次提取时间为3-10分钟,提取温度为50-90℃,合并提取液,浓缩,过滤,过弱酸性阳离子交换树脂吸附,用浓度为70-90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
本发明公开的苦丁茶总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用,所述苦丁茶总黄酮的制备还可以通过以下步骤:
苦丁茶粉碎,过80目过筛,加入浓度为70%的乙醇780W微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量15倍量,每次提取时间为5分钟,提取温度为80℃,合并提取液,浓缩,加硅藻土过滤,过ADS-17树脂吸附,用浓度为90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
本发明提供的苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶总黄酮用于治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途具有以下优点:
1、苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶总黄酮从冬青科植物苦丁茶中而得,安全无毒,可长期服用。
2、空间学习记忆能力测定显示,苦丁茶提取物及苦丁茶总黄酮组大鼠分别在不同程度上减少了大鼠的寻台潜伏期,这些数据表明苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶总黄酮对大鼠记忆力具有明显的改善作用。
3、在“对AD大鼠记忆能力的影响”实验中发现,苦丁茶提取物及苦丁茶总黄酮明显减少了大鼠脑组织MDA含量的增加,而同时能够提高大鼠脑组织的SOD活性,这些数据表明苦丁茶、苦丁茶提取物、苦丁茶总黄酮对AD大鼠脑组织氧自由基的清除具有明显的改善作用。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是,本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明,本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数,v/v表示溶液的体积比。
实施例1:
取10kg苦丁茶粉碎,加入浓度为40%的乙醇加热回流提取三次,每次乙醇用量为药材总重量10倍量,每次提取时间为60分钟,提取温度为60℃,合并提取液,浓缩,过滤,得苦丁茶提取物。
实施例2:
取10kg苦丁茶粉碎,加入浓度为40%的乙醇微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量10倍量,每次提取时间为10分钟,提取温度为50℃,合并提取液,浓缩,过滤,过ADS-17树脂吸附,用浓度为90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
以芦丁作对照品,测苦丁茶总黄酮得率为2.91%。
实施例3:
取10kg苦丁茶粉碎,过80目过筛,加入浓度为70%的乙醇780W微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量15倍量,每次提取时间为5分钟,提取温度为80℃,合并提取液,浓缩,加硅藻土过滤,过ADS-17树脂吸附,用浓度为90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
以芦丁作对照品。测苦丁茶总黄酮得率为3.67%。
实施例4:
取10kg苦丁茶粉碎,加入浓度为80%的乙醇加热回流提取三次,每次乙醇用量为药材总重量20倍量,每次提取时间为30分钟,提取温度为60℃,合并提取液,浓缩,过滤,得苦丁茶提取物。
实施例5:
取10kg苦丁茶粉碎后,加入浓度为80%的乙醇微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量20倍量,每次提取时间为3分钟,提取温度为90℃,合并提取液,浓缩,过滤,过ADS-17树脂吸附,用浓度为70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
以芦丁作对照品,测苦丁茶总黄酮得率为3.26%。
药效实验:对AD大鼠记忆能力的影响
1实验材料
1.1动物
SD大鼠清洁级,2月龄,♂,质量180~220g,购买自广西医科大学实验动物中心(生产许可证号:SCXK桂2009-0002)。
1.2仪器
Morris水迷宫XR-XM(aze)和BI2000图像分析***(上海欣软信息科技有限公司)。
1.3试剂
AlCl3·6H2O(国产分析纯),羧甲基纤维素钠(国产分析纯),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒,由南京建成生物工程研究所提供。
2.方法
2.1溶液配制
AlCl3·6H2O和羧甲基纤维素钠临用前用蒸馏水配制;苦丁茶提取物及苦丁茶总黄酮在临用前用质量浓度为0.2%羧甲基纤维素钠配制成浓度为15mg/ml。
2.2AD动物模型的建立(慢性铝过负荷建立老年痴呆(AD)大鼠模型)
大鼠按质量随机分成5组,每组12只,即:
空白对照:0.2%羧甲基纤维素钠
模型组:AlCl3溶液200mg/kg;
实施例1组:造模后大鼠给予实施例1苦丁茶提取物,给药量按生药量100mg/kg计;
实施例2组:给予实施例2苦丁茶总黄酮,给药量按生药量100mg/kg计;
实施例3组:给予实施例3苦丁茶总黄酮,给药量按生药量100mg/kg计;
实施例1、2、3组在灌胃铝1h后给药,灌胃容积按照1ml/100g大鼠体重计算,每周5d,连续20周。
2.3空间学习记忆能力测试
使用Morris水迷宫对大鼠空间学***台上适应60s,然后让其自由游泳至平台,3min内未找到平台者,实验者协助将其引至平台,从第2天起,每天训练4次,每次训练时选择1个入水点,将大鼠面向池壁放入水中,让大鼠进行定向航行,持续训练4d;第2阶段,即在第5天时进行测试,撤去平台,并任意将大鼠从最后一次训练时的入水方位放入,电脑记录大鼠第一次跨越原平台的时间即寻台潜伏期,以寻台潜伏期作为大鼠的空间定向能力成绩,超过180s以180s计算。
2.4脑组织SOD和MDA含量测定
空间学习记忆能力测试后,处死全部大鼠,取大鼠脑组织并分离出海马组织,用生理盐水配制成质量浓度为100g/L的匀浆,测定SOD活性及大鼠脑组织MDA含量,具体测定方法及步骤按照相应试剂盒说明书进行。
2.5统计学处理
实验数据用x±s表示,采用SPSS 16.0统计软件包进行方差分析,P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有极显著性差异。
3.实验结果
3.1对AD模型大鼠空间学习记忆能力的影响
空间学***台的时间在第1、2、3、4天分别比空白组明显延长(P<0.01),这表明AD模型组大鼠的学习能力明显降低。而实施例2、3组大鼠在第1、2、3、4天寻台潜伏期相比AD模型组大鼠明显缩短(P<0.01,P<0.05),实施例1组大鼠在前4d的寻台潜伏期也比AD模型组大鼠有不同程度的缩短,但缩短程度明显不如实施例2、3组,结果见表1。
表1 对AD大鼠空间学习能力的影响(n=12,x±s)
注:与空白对照组比较,*为p<0.01;与模型组比较,&为p<0.05,#为p<0.01。
水迷宫第5天测试结果则显示,AD模型组大鼠相比空白对照组大鼠寻台潜伏期明显增长(P<0.01),说明AD模型大鼠记忆重现能力受到影响。本发明试验组大鼠分别在不同程度上减少了大鼠的寻台潜伏期(P<0.01,P<0.05),且苦丁茶总黄酮组对大鼠记忆力的改善要明显好于苦丁茶提取物组,见表2。
表2 对AD大鼠空间记忆能力的影响(n=12,x±s)
注:与空白对照组比较,*为p<0.01;与AD模型组比较,&为p<0.05,#为p<0.01。
AD模型大鼠空间学习记忆能力试验结果提示本发明能显著提高大鼠的空间学习记忆能力,且苦丁茶总黄酮的效果优于苦丁茶提取物。
3.2对AD大鼠脑组织SOD活性的影响
与正常对照组相比,AD模型组大鼠SOD活性呈现降低的趋势,本发明药物能改善AD模型组大鼠SOD活性的趋势,且苦丁茶总黄酮的改善效果优于苦丁茶提取物,结果见表3。
表3 对AD大鼠脑组织SOD活性的影响(n=12,x±s)
注:与空白对照组比较,*为p<0.01;与AD模型组比较,&为p<0.05,#为p<0.01。
3.3对AD大鼠脑组织MDA含量的影响
与正常大鼠相比,AD模型组大鼠脑组织的MDA含量显著升高,而苦丁茶总黄酮组及苦丁茶提取物组大鼠脑组织MDA含量较AD模型组的大鼠明显降低,且苦丁茶总黄酮组对MDA活性的改善尤为明显(p<0.01),见表4。
表4 对AD大鼠脑组织MDA的影响(n=12,x±s)
注:与空白对照组比较,*p<0.01;与AD模型组比较,&p<0.05,#p<0.01。
4讨论
本试验采用慢性铝过负荷方法建立大鼠AD动物模型,实验数据表明,AD模型大鼠学习记忆能力明显减退,同时AD模型大鼠脑组织SOD活性出现降低趋势,MDA含量则明显升高。这些数据表明本试验采用的建模方法是可信的,相比以往通过侧脑室内注射神经毒素建立的AD等神经元退变动物模型,本试验模型更能代表AD实际临床的病理过程,研究结果也更具实际意义。
在研究中发现,苦丁茶总黄酮的给予明显减少了大鼠脑组织MDA含量的增加,而同时能够提供大鼠脑组织的SOD活性,这些数据表明苦丁茶总黄酮对AD大鼠脑组织氧自由基的清除具有明显的改善作用,能有效改善大鼠学习及记忆力。提示本发明对神经元退行性疾病有较佳的治疗效果,对于临床治疗阿尔兹海默病等老年性疾病药物的开发研究及临床治疗都具有参考意义。
总体实验效果显示,本发明可有效治疗阿尔兹海默病,治疗效果最优为苦丁茶总黄酮,苦丁茶提取物次之,但两者均显示出显著的治疗效果。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.苦丁茶在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
2.苦丁茶提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于所述苦丁茶提取物通过以下步骤制备而得:苦丁茶粉碎,加入浓度为40-80%的乙醇加热回流提取三次,每次乙醇用量为药材总重量10-20倍量,每次提取时间为30-60分钟,提取温度为60-80℃,合并提取液,浓缩,过滤,得苦丁茶提取物。
4.苦丁茶总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病方面的新用途。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于所述苦丁茶总黄酮通过以下步骤制备而得:苦丁茶粉碎后,加入浓度为40-80%的乙醇微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量10-20倍量,每次提取时间为3-10分钟,提取温度为50-90℃,合并提取液,浓缩,过滤,过弱酸性阳离子交换树脂吸附,用浓度为70-90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
6.根据权利要求4所述的用途,其特征在于所述苦丁茶总黄酮通过以下步骤制备而得:苦丁茶粉碎,过80目过筛,加入浓度为70%的乙醇780W微波提取三次,每次乙醇用量为药材总重量15倍量,每次提取时间为5分钟,提取温度为80℃,合并提取液,浓缩,加硅藻土过滤,过ADS-17树脂吸附,用浓度为90%的乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得苦丁茶总黄酮。
7.苦丁茶提取物与医药学上可接受的载体配合成在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
8.苦丁茶总黄酮与医药学上可接受的载体配合成在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
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