CN104428280A - 制造含有叔氨基的脂质的方法 - Google Patents

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Abstract

在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基的阳离子脂质的生产中，从顺式形式向反式形式的异构化受到抑制。使由下式(I)所表示的化合物：R1-X…(I)(式中，R1表示在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基并具有8至24的碳数的烃基，X表示释放基团)与(B)在分子中具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物，在具有5至10的碳数的饱和烃类溶剂中，在碱催化剂存在下进行反应。

Description

制造含有叔氨基的脂质的方法
技术领域
本发明涉及用于制造含有叔氨基的脂质的方法。
背景技术
近年来，基因疗法成为能够预期在基因水平上使引起各种疾病的异常情况恢复和正常化的医学治疗。然而，基因是非常不稳定的。例如，在将基因原样给药的情形中，基因经历由体内的核酸酶等造成的分解。因此，用于基因疗法的载体的选择是非常重要的。
过去使用的病毒载体是表现出高度基因转移效率的有效载体。然而，已经报道了临床试验与死亡相关联的情况，使得对安全性存在顾虑。因此，具有高安全性和高基因导入效率的非病毒载体的开发已变成主流，并且已在世界各地进行积极研究。
非病毒载体包括诸如聚乙烯亚胺的阳离子聚合物与基因的复合物(多聚物-核酸复合物(polyplex))，和由阳离子脂质制成的脂质体与基因的复合物(脂质-核酸复合物(lipoplex))。
最重要的是，由于容易被官能化以便取决于所混合的脂质的类型而在血液中具有提高的持留性、积累到靶细胞等，脂质-核酸复合物是目前最通常使用的载体，并且极有希望进入实际应用。
对于脂质-核酸复合物的典型实例来说，Wheeler等报道了将含有用作致融脂质的二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、阳离子脂质等的稳定化的质粒脂质离子(SPLP)用聚乙二醇脂质包衣(NPL 1)。在所述报告中，对于阳离子脂质来说，为了提高药物递送效率，使用具有致融性质并含有一个不饱和键例如油烯基的脂质(例如DODAC(二油烯基二甲基氯化铵))。
此外，有报告指出，通过使用具有至少两个不饱和键例如亚油烯基并表现出提高的柔性的阳离子脂质，药物递送效率与以往相比进一步提高(PTL 1)。另外，存在着使用类似的阳离子脂质的报告(PTL 2)。
对于其中使用的阳离子脂质来说，脂质部分与具有阳离子基团的骨架使用醚基键合。与脂质部分和具有阳离子基团的骨架使用酯基键合的阳离子脂质等相反，由于不发生水解，因此表现出显著的稳定性。
一般来说，在合成这样的包含具有醚基的键的阳离子脂质的情形中，使用Williamson等的方法，其中将具有阳离子基团和羟基的化合物与具有离去基团的脂质化合物在有机溶剂中，在强碱存在下，在高温下反应。用于制造阳离子脂质化合物的具体方法的实例，包括从含有阳离子基团(二甲基氨基)的3-二甲基氨基-1，2-丙二醇和长链脂肪溴化物或长链脂肪甲磺酸酯，在芳香化合物溶剂例如苯、甲苯或二甲苯中，在强碱催化剂例如氢氧化钠或氢氧化钾存在下，在高温例如回流下进行的生产(PTL 1和2)。
总的来说，已知在分子中具有夹在两个顺式形式的双键之间的亚甲基的脂肪酸例如亚油酸，由于所述亚甲基具有高反应性，因此在高温、碱等的条件下容易被氧化并且容易异构化。所述异构化的脂肪酸(反式脂肪酸)表现出不同的生物活性。存在着例如过量摄入增加死亡风险的报告。因此，可能在体内发挥不利效应。
同时，已知具有一个双键的脂肪酸例如油酸，由于在所述双键的两侧包含亚甲基，因此也经历氧化，尽管反应性与亚油酸等的分子中夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基的反应性相比特别低，因此不容易发生异构化。
[引用文献列表]
[非专利文献]
[NPL 1]Wheeler等，基因治疗(Gene Therapy)6：271-281(1999)
[专利文献]
[PTL 1]日本未经审查的专利申请公布(PCT申请的翻译版本)No.2008-501729
[PTL 2]日本未经审查的专利申请公布(PCT申请的翻译版本)No.8-509953
发明内容
[技术问题]
也就是说，为了通过相关领域中的方法，通过在分子中具有夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基的化合物，例如亚油烯基团，的醚化获得含有叔氨基的阳离子脂质，需要高温和强碱条件。因此，存在着夹在顺式形式的双键之间的活性亚甲基的质子被容易地抽出，发生从顺式形式向反式形式的异构化，并且在目标物质中含有许多异构体的问题。
[解决问题的技术方案]
为了解决上述问题，本发明人进行了深入研究。结果，在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基的阳离子脂质的生产中，成功实现了从顺式形式向反式形式的异构化的显著抑制。
(1)一种用于制造含有叔氨基的脂质的方法，该方法包括：
使(A)由下述式(I)所表示的化合物
R1-X  ...(I)
(在式中，R1表示在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基并具有8至24的碳数的烃基，X表示释放基团)与(B)在分子中具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物，在具有5至10的碳数的饱和烃类溶剂中，在碱催化剂存在下进行反应。
(2)上述的制造方法，其中，所述饱和烃类溶剂是己烷或甲基环己烷。
(3)上述的制造方法，其中，R1是亚油烯基。
(4)上述的制造方法，其中，所述项(B)的在分子中具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物选自由下述式(II-1)所表示的化合物
[式中，Z表示具有1至8的碳数的二价至八价烃基，其可以采取直链、支链或环状形状，k1满足1≤k1≤7，k2满足1≤k2≤3，并满足2≤k1+k2≤8，并且Y是由下列结构所表示的官能团之一，
(R2和R3独立地表示具有1至8的碳数的直链、支链或环状烃基，并且W表示O或NR4(R4表示具有1至3的碳数的烷基))]，以及由下述式(II-2)所表示的化合物
(在式中，m表示1至4，R5表示具有1至4的碳数的直链或支链烷基或-(CH2)n-OH(n表示1至4))。
(5)上述的制造方法，其中，X是甲磺酸酯基(-OSO2CH3)。
(6)上述的制造方法，其中，所述碱催化剂是氢氧化钾。
[本发明的有利效果]
在使用本发明的制造方法的情形中，异构化被抑制，并且此外可以提高反应的转化程度。其中异构化如上所述受到抑制的含有叔氨基的脂质具有高纯度。因此，在作为例如用于基因导入的脂质-核酸复合物的非病毒载体的组成成分的用途中，作为载体存在着均匀的优点，并且由于降低了在体内发挥不利效应的可能性，因此表现出有用性。
具体实施方式
对于由式(I)所表示的化合物(在后文中也简称为“化合物(A)”)来说，R1表示在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基并具有8至24的碳数的烃基，并且是具有2至6个顺式形式的不饱和双键并具有8至24的碳数的烃基。优选地，R1是在分子中具有1至4个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基的烃基，更优选为具有1或2个所述亚甲基的烃基。
对于R1来说，通常使用源自于脂肪醇的脂族烃基，尽管不限于此。对于包括在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基并具有8至24的碳数的烃基的官能团来说，可以提到下面的基团。
可以提到的是9，12-十八碳二烯基(亚油烯基(缩写为C18：2，这是由于在18的碳数中包括2个顺式形式的不饱和双键，另外添加(1)是因为夹在两个顺式形式的双键之间的业甲基的数量为1，并且在后文中缩写以同样方式进行)，10，13-十九碳二烯基(C19：2，(1))，9，12，15-十八碳三烯基(α-亚麻烯基，C18：3，(2))，6，9，12-十八碳三烯基(γ-亚麻烯基，C18：3，(2))，11，14-二十碳二烯基(C20：2，(1))，8，11，14-二十碳三烯基(C20：3，(2))，11，14，17-二十碳三烯基(C20：3，(2))，5，8，11，14-二十碳四烯基(花生烯基C20：4，(3))，5，8，11，14，17-二十碳五烯基(C20：5，(4))，7，10，13，16，19-二十二碳五烯基(C22：5，(4))，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯基(C22：6，(5))，13，16-二十二碳二烯基(C22：2，(1))，13，16，19-二十二碳三烯基(C22：3，(2))和7，10，13，16-二十二碳四烯基(C22：4，(3))。
优选地，可以提到的是9，12-十八碳二烯基(亚油烯基)、9，12，15-十八碳三烯基(α-亚麻烯基)和6，9，12-十八碳三烯基(γ-亚麻烯基)，更优选地，可以提到的是9，12-十八碳二烯基(亚油烯基)。
符号X表示官能团，该官能团通过与具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物中的羟基反应以便形成醚键被释放。具体来说，可以提到的是甲磺酸酯基(-OMs)、对甲苯磺酸酯基(-OTs)、三氟甲磺酸酯基(-OTf)、三氟乙磺酸酯基(-OTresyl)、氯、溴、碘等。
优选地，可以提到的是甲磺酸酯基和溴，更优选地，可以提到的是甲磺酸酯基。
对与化合物(A)反应的化合物(在后文中也简称为“化合物(B)”)没有特别限制，只要在分子中包含叔氨基和羟基各至少一个即可。优选情况的实例包括由式(II-1)和(II-2)所表示的化合物。
在式(II-1)中，Z表示具有1至8的碳数的二价至八价烃基，其可以采取直链、支链或环状形状。优选地，Z为二价至六价，更优选地，Z为二价或三价。碳数优选为1至6，更优选为1至3。具体来说，对于二价的Z来说，可以提到的是直链官能团例如亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基，以及环状官能团例如亚环己基和业苯基。对于三价的Z来说，可以提到的是通过从甘油移除三个羟基而衍生的烃基。例如，对于四价的Z来说，可以提到的是通过从赤藓糖醇移除四个羟基而衍生的烃基，对于五价的Z来说，可以提到的是通过从木糖醇移除5个羟基而衍生的烃基，对于六价的Z来说，可以提到的是通过从甘露糖醇或山梨糖醇移除6个羟基而衍生的烃基。通过从甘油移除3个羟基而衍生的烃基是优选的。
符号k1满足1≤k1≤7，k2满足1≤k2≤3，并且满足2≤k1+k2≤8。优选地，k1满足1≤k1≤5，k2是1，并且满足2≤k1+k2≤6。更优选地，k1是2，k2是1，并保持k1+k2＝3。
符号Y是由下述结构所表示的官能团之一。
符号R2和R3独立地表示具有1至8的碳数的直链、支链或环状烃基，并且R2和R3可以相同或不同。优选地，碳数为1至4，更优选地，碳数为1或2。对于烃基来说，可以提到的是脂族、脂环族和芳香族烃基。具体实例包括甲基、乙基、异丙基、环己基、苯基和苯甲基。甲基、乙基和异丙基是优选的。甲基是优选的。
符号W表示O或NR4，并且R4表示具有1至3的碳数的烷基。具体来说，可以提到的是甲基、乙基和丙基，并且甲基是优选的。
在式(II-2)中，m表示1至4，优选地，m是2。符号R5表示具有1至4的碳数的直链或支链烷基或-(CH2)n-OH，其中n表示1至4，优选地n是2。R5的具体实例包括甲基、乙基、异丙基和对应于n为2的情况的羟乙基。
化合物(A)的量相对于化合物(B)的一个羟基通常为1至5摩尔当量，优选为1至3摩尔当量，更优选为1至1.5摩尔当量。在化合物(A)的量相对于化合物(B)的一个羟基为小于1摩尔当量的情形中，由于化合物(B)变得过量，目标物质的产率可能低。
对于在反应中使用的溶剂来说，可以提到的是具有5至10的碳数的饱和烃类溶剂。对具有5至10的碳数的饱和烃类溶剂没有特别限制，并且可以是采取直链、支链或环状形状的。饱和烃类溶剂的碳数优选为5至8，更优选为6至7。其实例包括戊烷、2-甲基丁烷、环戊烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、环己烷、甲基环己烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，4-二甲基戊烷、辛烷、异辛烷、乙基环己烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷和癸烷。戊烷、2-甲基丁烷、环戊烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、环己烷、甲基环己烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，4-二甲基戊烷、辛烷、异辛烷和乙基环己烷是优选的，并且己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、，3-二甲基丁烷、环己烷、甲基环己烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷和2，4-二甲基戊烷是更加优选的。
对溶剂的量没有特别限制。然而，所述量以重量计为化合物(A)的量的0.1至100倍，优选为以重量计0.5至30倍，更优选为以重量计1至10倍。
碱催化剂是含有碱金属的化合物。具体实例包括氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾、氢化钠、氢化钾和金属钠。氢氧化钾和氢氧化钠是优选的，氢氧化钾是更加优选的。
此外，为了抑制异构化，可以向溶剂加入水。在这种情况下，添加的水的重量为0.5至5重量份，优选为0.5至3重量份，更优选为1至3重量份，其中所使用的溶剂的重量被指定为100重量份。
同时，在向***添加水的情况下，也可以导入相转移催化剂，以便促进有机层与水层之间的反应，并减少反应时间。
对于相转移催化剂来说，可以使用例如季铵盐、冠醚、鏻化合物和手性相转移催化剂。具体实例包括四乙基溴化铵、四丁基氢氧化铵，四丁基溴化铵、苯甲基三丁基氯化铵、四乙基氯化铵、四丁基氯化铵、18-冠-6，15-冠-5，12-冠-4、四丁基溴化鏻、四甲基碘化铵和四丁基碘化铵。优选地，可以提到的是四丁基氯化铵、四丁基溴化铵和四丁基碘化铵，更优选地，可以提到的是四丁基溴化铵。它们可以单独使用，或者至少两种类型可以组合使用。
在使用相转移催化剂的情况下，相转移催化剂的用量相对于化合物(B)为0.01至1摩尔当量，优选为0.01至0.5摩尔当量，更优选为0.01至0.1摩尔当量。
对于化合物(A)与化合物(B)之间在具有5至10的碳数的饱和烃类溶剂中的反应来说，温度为0℃至110℃，优选为5℃至80℃，更优选为10℃至50℃。即使在反应温度低的情况下，反应也能进行，尽管反应可能缓慢。反应温度可以根据所使用的饱和烃类溶剂的沸点适合地调整。
化合物(A)在分子中具有至少一个夹在两个相邻顺式形式的双键之间的亚甲基，因此容易被氧化并且容易被异构化。因此，优选情况下，反应和精制在惰性气体例如氮气或氩气气氛中进行，以便避免暴露于空气。
对于反应后的处理来说，碱催化剂可以通过倾析、过滤等来除去。将通过用这些方法除去碱催化剂而获得的溶液与水、缓冲溶液等混合，然后分离成两层。除去水层，并将有机层回收、脱水和浓缩，以便可以获得含有叔氨基的脂质。
或者，可以不通过倾析、过滤等除去碱催化剂，向含有碱盐的反应溶液加入水、缓冲溶液等。在加入水和缓冲溶液的情形中伴有产热，并且可能发生异构化。因此，优选情况下，将反应溶液冷却至25℃以下，并通过例如滴加逐步加入水和缓冲溶液。在分离成两层后，除去水层，并将有机层回收、脱水和浓缩，以便可以获得含有叔氨基的脂质。
得到的含有叔氨基的脂质预期含有目标物质之外的杂质。因此，也可以通过PTLs 1和2中描述的方法、下文中描述的方法等，通过精制来移除得到的含有叔氨基的脂质中的杂质。对于精制来说，可以使用常用方法例如重结晶、结晶、液-液萃取和硅胶柱层析，对此没有限制。在本发明的方法中，优选情况下通过硅胶柱层析，通过精制来移除含有叔氨基的脂质中的杂质，以便获得作为目标物质的含有叔氨基的脂质。
对用于硅胶柱层析的溶剂没有特别限制。例如，氯仿、甲醇、己烷、乙酸乙酯、水、缓冲液等可以单独使用，或者至少两种类型可以组合使用。实例包括溶剂的组合，例如氯仿/甲醇、氯仿/甲醇/水和己烷/乙酸乙酯。氯仿/甲醇和己烷/乙酸乙酯是优选的，己烷/乙酸乙酯是更加优选的。
氯仿/甲醇和己烷/乙酸乙酯的可用比例范围是100/0至40/60(vol/vol)，并且以100/0至50/50使用是优选的。
[实施例]
本发明的实施例将在下文中描述。
(生产例1)
(甲磺酸亚油酯的合成)
向四颈烧瓶加入脱水甲苯(500g)、亚油醇(顺，顺-9，12-十八碳二烯-1-醇，100g，375mmol)和三乙胺(46g，450mmol)，并在氮气气氛中进行搅拌。在冷却至10℃后，在2小时内滴加甲磺酰氯(47g，413mmol)，以使反应温度变成30℃以下。滴加完成后1小时，对反应溶液取样，并通过TLC确定亚油醇斑点的消失(氯仿展层，磷酸-硫酸铜显色)。加入乙醇(5.2g，113mmol)，并过滤出三乙胺盐酸盐。将滤液用离子交换水(150g)洗涤，并舍弃水层。再次进行相同的用离子交换水的洗涤操作。将有机层用无水硫酸镁(20g)脱水，然后进行过滤和浓缩，以便获得甲磺酸亚油酯(生产量：120g，得率：93％)。
将得到甲磺酸亚油酯用1H-NMR(600MHz，CDCl3)进行分析，并在下述数据的基础上被确定是目标物质：δ3.00(s，3H，OSO2CH 3)，5.42至5.30(m，4H，2x CH＝CH)，2.06(q，4H，2x CH2CH 2CH＝)，4.22(t，2H，CH2CH 2OSO2CH3)，2.79(t，2H，＝CHCH 2CH＝)，0.89(t，3H，CH2CH 3)。
在实施例1至7和比较例1至4中，将在生产例1中获得的甲磺酸亚油酯用作原材料，并与各种物质反应。对于每个实施例和比较例中的反应后的样品和目标物质来说，使用1H-NMR(600MHz，CDCl3)进行测量。
(确定反应终止点的方法)
取样一部分反应溶液。对于取样的溶液来说，通过用PTFE滤器(0.5μm，由ADVANTEC生产)过滤来除去碱催化剂，并在除去溶剂后，使用1H-NMR(600MHz，CDCl3)进行测量。反应在源自于甲磺酸亚油酯的甲基的δ3.00(s，3H，OSO2CH 3)处残留甲磺酸亚油酯的量变为5.0％以下(积分值：0.3以下)的时间点处终止，其中在源自于亚油烯基的不饱和键的δ5.42至5.30处的信号的积分值被指定为8H(质子)。
(用于计算异构体的积分值的方法)
异构体的积分值从δ6.29、5.94和5.67处的信号(源自于反式不饱和键)的平均积分值计算，其中在源自于亚油烯基的不饱和键的δ5.42至5.30处的信号的积分值被指定为8H(质子)。
(用于计算转化程度的方法)
实施例1、实施例2、实施例4、实施例6、实施例7和比较例1至3中目标物质的转化程度，从源自于二甲基氨基的δ2.28处的信号的积分值计算(当6H(质子)时为100％)，其中在源自于亚油烯基的不饱和键的δ5.42至5.30处的信号的积分值被指定为8H(质子)。
同样地，实施例3中目标物质的转化程度从δ3.69(源自于吗啉基)处的信号的积分值计算(当4H(质子)时为100％)。实施例5中目标物质的转化程度从δ2.32(源自于N-甲基)处的信号的积分值计算(当3H(质子)时为100％)。
(实施例1)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
向螺纹管加入己烷(30ml)和氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)，并在搅拌下，在氮气气氛中滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.72g，6.04mmol：DAP)。然后，滴加在生产例1中获得的甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在室温下进行搅拌。48小时后，由于残留的甲磺酸亚油酯变为0.9％而终止反应(转化程度：65.0％，异构体的积分值：0.017)。
对反应溶液进行倾析，并将上清溶液加入到pH 6的磷酸缓冲液(75ml)中，然后搅拌。在静置分层后，舍弃水层。加入乙腈(20ml)。在搅拌和静置后，除去下层(乙腈层)。再一次加入乙腈(20ml)并再次进行同样的操作。将己烷层用硫酸镁(1.0g)脱水并过滤。随后除去溶剂，以便获得粗略精制的产物(3.3g)。将其用硅胶柱(DAISOGEL IR-60-25/40)，使用含有5至20体积百分数的乙酸乙酯的己烷溶液进行精制，以便获得目标物质(2.0g)(异构体的积分值：0.015)。
将得到的目标物质用1H-NMR(600MHz，CDCl3)分析，并根据1H-NMR(600MHz，CDCl3)确定为是目标物质：δ5.42至5.30(m，8H，4x CH＝CH)，3.59to 3.44(m，7H，OCH，3x OCH 2)，2.79(t，4H，2x＝CHCH 2CH＝)，2.40(m，2H，NCH 2)，2.28(s，6H，2x NCH 3)，2.06(q，8H，4x CH2CH 2CH＝)，1.56(m，4H，2x CH 2CH2O)，1.41to 1.28(m，32H)，0.89(t，6H，2x CH2CH 3)。
此外，确定获得了与PTL 1中描述的相同化合物的信号相同的信号。
下面将描述比较例1中的实验。
(比较例1)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
向四颈烧瓶加入脱水的甲苯(30ml)和60％氢化钠(1.2g，30.0mmol)，并在搅拌下在氮气气氛中滴加DAP(0.57g，4.84mmol)。随后，滴加甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在110℃进行3小时搅拌(转化程度：59.0％，异构体的积分值：0.073)。在冷却至室温后，用冰进行冷却，并将反应溶液逐步加入乙醇(3ml)。此外，用150ml甲苯进行稀释，随后用蒸馏水(150ml×2次)和饱和盐溶液(150ml)进行洗涤。向有机层加入硫酸镁(1.0g)进行脱水，然后进行过滤和溶剂去除，以获得粗略精制的产物。将所述粗略精制的产物用硅胶(DAISOGEL IR-60-25/40)柱层析，使用含有0％至5％甲醇的氯仿溶液进行精制，以便获得目标物质(1.6g)(异构体的积分值：0.071)。
实施例1和比较例1的异构体积分值结果示出在表1中。
[表1]
表1.异构体积分值的变化
反应后 柱精制后
实施例1 0.017 0.015
比较例1 0.073 0.071
如表1中所示，对于使用己烷作为反应溶液的实施例1来说，反应后异构体的积分值与使用甲苯的比较例1的积分值相比显著降低。
同时，对于其后的柱精制来说，异构体的积分值降低，并且显然异构体没有被完全除去，尽管异构体被略微去除。也就是说，发现目标物质中的异构体含量受到反应中异构体含量的影响。
随后，对于下面描述的实施例2至7和比较例2至4来说，在反应后异构体的积分值的基础上进行了比较。
(实施例2)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入己烷(30ml)、氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)和水(0.6g：以100重量份的己烷计3重量份)，并在搅拌下滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.72g，6.04mmol：DAP)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在40℃进行19小时的搅拌。由于残留的甲磺酸亚油酯变为1.0％而终止反应(转化程度：64.0％，异构体的积分值：0.009)。
(实施例3)
1，2-二亚油烯氧基-吗啉丙烷的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入己烷(30ml)和氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)，并在搅拌下滴加3-吗啉-1，2-丙二醇(0.98g，6.1mmol：MPP)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在室温进行23小时的搅拌。由于甲磺酸亚油酯消失而终止反应(转化程度：72.3％，异构体的积分值：0.012)。
(实施例4)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入甲基环己烷(30ml)和氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)，并在搅拌下滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.72g，6.04mmol：DAP)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在40℃进行13小时的搅拌。由于残留的甲磺酸亚油酯变为2.1％而终止反应(转化程度：68.0％，异构体的积分值：0.024)。
(实施例5)
N，N-二亚油烯氧基乙基-N-甲基胺的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入己烷(30ml)和氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)，并在搅拌下滴加N-甲基二乙醇胺(0.72g，6.04mmol：MDA)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在室温进行5小时的搅拌。由于残留的甲磺酸亚油酯变为3.9％而终止反应(转化程度：87.0％，异构体的积分值：0.011)。
(实施例6)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
在氮气气氛中，将己烷(30ml)、氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)、水(0.6g：以100重量份的己烷计3重量份)和四丁基溴化铵(0.04g，0.12mmol：TBAB)置于四颈烧瓶中，并在搅拌下滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.72g，6.04mmol：DAP)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在室温进行11小时的搅拌。由于残留的甲磺酸亚油酯变为0.9％而终止反应(转化程度：65.0％，异构体的积分值：0.011)。
(实施例7)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
在氮气气氛中，将己烷(30ml)和氢氧化钾(6.1g，108.7mmol)置于四颈烧瓶中，并在搅拌下滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.72g，6.04mmol：DAP)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在室温进行3小时的搅拌。由于残留的甲磺酸亚油酯变为0.2％而终止反应(转化程度：59.2％，异构体的积分值：0.027)。
(比较例2)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入脱水甲苯(30ml)和氢氧化钾(1.8g，28.8mmol)，并在搅拌下滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.57g，4.78mmol)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并在110℃进行3小时的回流。由于残留的甲磺酸亚油酯变为4.8％而终止反应(转化程度：51.1％，异构体的积分值：0.142)。
(比较例3)
1，2-二亚油烯氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入脱水甲苯(30ml)和氢氧化钾(4.9g，87.0mmol)，并在搅拌下滴加3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(0.57g，4.78mmol：DAP)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并将反应在室温进行14.5小时。尽管残留的甲磺酸亚油酯为51.1％并因此不满足5.0％以下，但由于异构体增加到0.079％而终止反应(转化程度：28.9％，异构体的积分值：0.079)。
(比较例4)
N，N-二亚油烯氧基乙基-N-甲基胺的合成
在氮气气氛中，向四颈烧瓶加入脱水甲苯(30ml)和氢氧化钾(3.1g，54.4mmol)，并在搅拌下滴加N-甲基二乙醇胺(0.72g，6.04mmol：MDA)。然后加入甲磺酸亚油酯(5.0g，14.5mmol)，并将反应在室温进行44小时。由于残留的甲磺酸亚油酯变为3.5％而终止反应(转化程度：39.5％，异构体的积分值：0.042)。
[表2]
表2.反应后的异构体积分值
底物 溶剂 催化剂 当量 温度 时间 转化程度 异构体的平均积分值
实施例1 DAP 己烷 KOH 9eq 室温 48h 65.0％ 0.017
实施例2 DAP 己烷+水 KOH 9eq 40℃ 19h 64.0％ 0.009
实施例3 MPP 己烷 KOH 9eq 室温 23h 72.3％ 0.012
实施例4 DAP 甲基环己烷 KOH 9eq 40℃ 13h 68.0％ 0.024
实施例5 MDA 己烷 KOH 9eq 室温 5h 87.0％ 0.011
实施例6 DAP 己烷+水 KOH+TBAB 9eq 室温 11h 65.0％ 0.011
实施例7 DAP 己烷 KOH 18eq 室温 3h 59.2％ 0.027
[表3]
表3.反应后的异构体积分值
底物 溶剂 催化剂 当量 温度 时间 转化程度 异构体的平均积分值
比较例1 DAP 甲苯 NaH 6eq 110℃ 3h 59.0％ 0.073
比较例2 DAP 甲苯 KOH 6eq 110℃ 3h 51.1％ 0.142
比较例3 DAP 甲苯 KOH 18eq 室温 14.5h 28.9％ 0.079
比较例4 MDA 甲苯 KOH 9eq 室温 44h 39.5％ 0.042
具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物是3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(DAP)的情形对应于实施例1、2、4、6和7和比较例1、2和3。当对它们的异构体积分值进行比较时，实施例中的异构体积分值为0.009至0.027，而比较例中的积分值为0.073至0.142。因此，对于实施例来说，异构化能够被抑制，并且此外转化程度能够被提高。
同样地，在实施例3和5中，分别使用3-吗啉-1，2-丙二醇(MPP)和N-甲基二乙醇胺(MDA)代替DAP，并且发现异构体的积分值为0.012和0.011，因此，与3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(DAP)的情况相同，异构化被抑制。
根据使用MDA的情况之间的比较，比较例4的异构体的积分值为0.042，而对于实施例5来说，异构体的积分值为0.011，因此异构化能够被抑制，并且转化程度能够被提高。
已发现，对于在反应***中使用水和四丁基溴化铵(TBAB)的实施例6来说，与使用同样底物、溶剂和水的实施例2相比，反应时间可以减少。
尽管已经详细并参考特定实施方式对本发明进行了描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以在其中做出各种改变和修改而不背离其精神和范围。
本申请是基于2012年7月2日提交的日本专利申请(日本专利申请号2012-148754)，并将其所有内容通过参考并入本文。本文中引用的所有参考文献也整体并入。

Claims (6)

1.一种用于制造含有叔氨基的脂质的方法，该方法包括：
使(A)由下述式(I)所表示的化合物
R1-X...(I)
(式中，R1表示在分子中具有至少一个夹在相邻的两个顺式形式的双键之间的亚甲基并具有8至24的碳数的烃基，X表示释放基团)与(B)在分子中具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物，在具有5至10的碳数的饱和烃类溶剂中，在碱催化剂存在下进行反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述饱和烃类溶剂是己烷或甲基环己烷。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，R1是亚油烯基。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中，所述(B)项的在分子中具有叔氨基和羟基各至少一个的化合物选自由下式(II-1)所表示的化合物
[在式中，Z表示具有1至8的碳数的二价至八价烃基，其可以采取直链、支链或环状形状，k1满足1≤k1≤7，k2满足1≤k2≤3，并满足2≤k1+k2≤8，并且Y是由下列结构所表示的官能团之一，
(R2和R3独立地表示具有1至8的碳数的直链、支链或环状烃基，并且W表示O或NR4(R4表示具有1至3的碳数的烷基))]，以及由下式(II-2)所表示的化合物
(在式中，m表示1至4，R5表示具有1至4的碳数的直链或支链烷基或-(CH2)n-OH(n表示1至4))。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中，X是甲磺酸酯基(-OSO2CH3)。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中，所述碱催化剂是氢氧化钾。
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