CN101163796A - 阳离子脂质及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含阳离子脂质的组合物，包含所述阳离子脂质的脂质体和核酸－脂质颗粒，以及使用这些组合物，脂质体，和核酸－脂质颗粒的方法。

Description

阳离子脂质及应用方法

对相关申请的交叉参考

本申请要求提交于2004年6月7日的美国临时专利申请号60/578,075，提交于2004年9月17日的60/610,746，和提交于2005年5月9日的60/679,427的权益，出于所有目的将其每个的全部内容特此并入作为参考。

发明背景

有效和安全的基因递送***是将在临床上有用的基因治疗所需要的。病毒载体是相对有效的基因递送***，但是遭遇到多种局限，诸如逆转成野生型的可能以及免疫应答问题。结果，非病毒基因递送***正在受到越来越多的关注(Worgall，et al.，Human Gene Therapy 8：37-44(1997)；Peeters，et al.，Human Gene Therapy 7：1693-1699(1996)；Yei，et al.，Gene Therapy1：192-200(1994)；Hope，et al.，Molecular Membrane Biology 15：1-14(1998))。质粒DNA-阳离子脂质体复合物是目前最常用的非病毒基因递送载体(Felgner，Scientific American 276：102-106(1997)；Chonn，et al.，CurrentOpinion in Biotechnology 6：698-708(1995))。然而，复合物较大，***很不确定，其不适于全身应用并可激发相当大的毒性副作用(Harrison，et al.，Biotechniques 19：816-823(1995)；Huang，et al.，Nature Biotechnology15：620-621(1997)；Templeton，et al.，Nature Biotechnology 15：647-652(1997)；Hofland，et al.，Pharmaceutical Research 14：742-749(1997))。

最近的工作已经显示质粒DNA可被包封在小的(～70nm直径)“稳定的质粒-脂质颗粒”(SPLP)中，其由包封在双层脂质载体中的单一质粒组成(Wheeler，et al.Gene Therapy 6：271-281(1999))。这些SPLPs典型地包含“融合性的(fusogenic)”脂质二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)，低水平的阳离子脂质，并在存在聚(乙二醇)(PEG)包衣时在水性介质中是稳定的。SPLP具有全身应用，因为在静脉内(i.v.)注射后，它们显示延长的循环生存期，由于在这些区域增加的血管通透性，它们优先聚集在远侧肿瘤位点，并可在这些肿瘤位点介导转基因表达。在i.v.注射包含萤光素酶标记基因的SPLP后，在肿瘤位点观察到的转基因表达的水平优于使用质粒DNA-阳离子脂质体复合物(lipoplexes)或裸DNA可获得的水平。尽管如此，对于一些应用中的理想治疗益处，可能需要提高水平的表达(见，例如，Monck，et al.，J.Drug Targ.7：439-452(2000))。

典型地，脂质体和SPLPs都包括阳离子脂质。通常，所述阳离子脂质具有2条烷基链，醚(氧)键，和胺头部基团诸如，例如DODAC和DODMA。典型地，烷基链包括不饱和的单一位点。不幸的是，仅具有不饱和单一位点的阳离子脂质可缺乏柔性。包含这些阳离子脂质的脂质体或SPLP可缺乏足够的膜流动性，因此影响将生物活性剂递送到细胞或患者中的功效。

脂质柔性在开发脂质体或SPLP药物递送***中是重要的。因此，理想的是开发更具有柔性的阳离子脂质，由此增加脂质体或SPLP的膜流动性。本发明满足了这个和其它的需要。

发明概述

本发明提供新的阳离子脂质，与常用的阳离子脂质(诸如DODAC和DODMA)相比，其具有增加的柔性。更具体地，已经令人惊讶地发现本发明的阳离子脂质通过增加脂质体或SPLP的膜流动性而提高了脂质体以及核酸-脂质颗粒(SPLPs)的性质，由此增加在脂质体和SPLP中递送生物活性剂的功效。具体而言，本发明提供具有下列结构的式I的化合物：

在上述式I的化合物中，R¹和R²独立地是H或C₁-C₃烷基。R³和R⁴在式I的化合物中进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基基团，并且R³和R⁴至少其中之一包括至少两个不饱和位点。R³和R⁴可以是相同的或不同的。如果是不同的，R³和R⁴可以在烷基链长度方面，在不饱和的位点方面，或在不饱和的位点的数目方面是不同的。R³和R⁴可以包括至少两个不饱和位点(例如R³和R⁴可以是，例如十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亚油基(linoleyl)、二十碳二烯基)。在优选的实施方案中，R³和R⁴都是亚油基。R³和R⁴可以包含至少三个不饱和位点(例如R³和R⁴可以是，例如，十二碳三烯基、十四碳三烯基，十六碳三烯基、亚麻基和二十碳三烯基)。

本发明还提供具有下列结构的式II的化合物：

在上述式II中，R¹和R²进行独立地选择并且是H或C₁-C₃烷基。R³和R⁴进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基基团，其中R³和R⁴至少一个包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R³和R⁴都是相同的，即R³和R⁴都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中，R³和R⁴是不同的，即R³是十四碳三烯基(C14)，且R⁴是亚油基(C18)。在优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即R³和R⁴都是相同的。在另一个优选的实施方案中，R³和R⁴都包含至少两个不饱和位点。在一些实施方案中，R³和R⁴独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R³和R⁴都是亚油基。在一些实施方案中，R³和R⁴包含至少三个不饱和位点并且独立地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基和二十碳三烯基。

在另一个方面，本发明提供脂质体，所述脂质体包含式I，式II或其组合的阳离子脂质。所述脂质体还可以包含PEG-脂质(例如，PEG-二酰基甘油，PEG-二烷氧基丙基，PEG-神经酰胺，PEG-磷脂酰乙醇胺或其混合物)。所述脂质体可以是空载的，或备选地，所述脂质体还可以包含一种或多种生物活性剂。适合的生物活性剂包括，但不限于，抗肿瘤药、抗生素、免疫调节剂，消炎药和作用在中枢神经***上的药剂。类似地，适合的生物活性剂包括，但不限于，肽、蛋白质和核酸(例如单或双链DNA，单链或双链RNA，包括siRNA)。

在另一个方面，本发明提供将生物活性剂递送到细胞的方法，所述方法包括使细胞与包含式I，式II或其组合的阳离子脂质的脂质体接触，其中所述生物活性剂被包封在脂质体中。类似地，在另一个方面，本发明提供将生物活性剂递送给患者的方法，所述方法包括向患者施用包含式I，式II或其组合的阳离子脂质的脂质体，其中所述生物活性剂被包封在脂质体中。

在另一个方面，本发明提供核酸-脂质颗粒，所述核酸-脂质颗粒包含：核酸；式I，式II，或其组合的阳离子脂质；非阳离子脂质；和PEG-脂质缀合物。

在另一个方面，本发明提供将核酸引入细胞的方法，所述方法包括使细胞与核酸-脂质颗粒接触，所述核酸脂质颗粒包含式I，式II，或其组合的阳离子脂质，非阳离子脂质，PEG-脂质缀合物，和核酸。

本发明的其它特征，目标和优势及其优选实施方案将通过下面的详细描述，实施例，权利要求和附图而变得显而易见。

附图简述

图1举例说明本发明的两个示范性阳离子脂质的结构：1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。

图2举例说明DLinDMA的合成路线。

图3举例说明DLenDMA的合成路线。

图4举例说明显示结合在SNALP中的阳离子脂质的表观pKa的数据。

图5举例说明显示³¹P-NMR分析的结果的数据，所述³¹P-NMR用于确定不饱和对相变温度的影响。

图6举例说明这样的数据，所述数据显示在体外转染稳定表达萤光素酶的Neuro2a细胞后，由SPLP(即，SNALP)使基因表达的沉默，所述SPLP包含DODAC，DODMA，或DLinDMA并包封抗萤光素酶siRNA序列。

图7举例说明显示体外SNALP介导的基因沉默的数据。

图8举例说明显示在静脉内递送包封编码萤光素酶的质粒的SPLP后48小时，在肿瘤中萤光素酶基因表达的数据。所述SPLP包括PEG-C-DMA缀合物和DODMA或DLinDMA其中任一。所述PEG部分具有2000或750的分子量。

图9举例说明显示在静脉内施用包封编码萤光素酶的质粒的SPLP后48小时，在携带Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠中萤光素酶基因表达的数据。所述SPLP包括各种比例的(即15％，10％，5％或2.5％)的PEG-C-DMA和DODMA或DLinDMA。

图10举例说明这样的数据，所述数据显示在单一静脉内施用包含不同比例(即2％，5％，10％，或15％)的PEG-C-DMA的³H-CHE-标记的SPLP或SNALP或空载小泡后，在雄性A/J小鼠的血浆中剩余的SPLP、SNALP或空载小泡的注射剂量的百分比。

图11举例说明这样的数据，所述数据显示在单一静脉内施用包含各种比例的PEG-C-DMA的³H-CHE-标记的制剂后48小时，在携带Neuro-2A肿瘤的雄性A/J小鼠中，SPLP，SNALP或空载小泡的生物分布。所述SNALP和空载小泡包括DLinDMA。所述SPLP包括DODMA。

图12举例说明这样的数据，所述数据显示在静脉内施用包含DLinDMA的SNALP后48小时，在A/J小鼠中的远端、稳定的Neuro2A-G肿瘤中萤光素酶表达的沉默。

图13举例说明这样的数据，所述数据显示在递送包含DLinDMA和包封抗-萤光素酶siRNA的SNALP制剂后，在Neuro2A-G细胞中萤光素酶表达的沉默。

图14举例说明这样的数据，所述数据显示在递送包含DLinDMA和包封抗-萤光素酶的siRNA的SNALP制剂后，在Neuro2A-G细胞中的萤光素酶表达的沉默。在缺乏或存在氯喹的情况下进行SNALP制剂的递送。

图15举例说明显示细胞吸收SNALP的数据。

发明详述

I.介绍

本发明提供新的阳离子脂质，与常用的阳离子脂质(诸如DODAC和DODMA)相比，其具有增加的柔性。当结合到脂质小泡(例如，脂质体，SPLP和SNALP)中时，本文所述的阳离子脂质赋予增加的融合性(fusogenicity)。

II.定义

术语“脂质”指一组有机化合物，其包括，但不限于脂肪酸的酯，并且特征是在水中不溶，但是在许多有机溶剂中是可溶的。通常将它们分成至少三类：(1)“简单的脂质”其包括脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”其包括磷脂和糖脂；(3)“衍生的脂质”诸如类固醇。

“脂质小泡”指可用于传递化合物的任何脂质组合物，其包括，但不限于，脂质体，其中水体积被两亲性脂双层所包封；或其中脂质包被包括大分子组分的内部，诸如包括干扰RNA序列的质粒，伴随减少的水性内部；或脂质团聚体或胶团，其中被包封的成分包含在相对混乱的脂质混合物中。

用于本文时，“包封的脂质”可指提供具有充分包封、部分包封或两者的化合物的脂质制剂。在一个优选的实施方案中，将所述核酸充分包封在脂质制剂中(例如形成SPLP，pSPLP，或其它SNALP)。

用于本文时，术语“SNALP”指稳定的核酸脂质颗粒，包括SPLP。SNALP代表包被减少的水性内部的脂质的小泡，所述内部包括核酸(例如，ssDNA，dsDNA，ssRNA，microRNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)，dsRNA，siRNA或质粒，包括自其中转录干扰RNA的质粒)。用于本文时，术语“SPLP”指包括被包封于脂质小泡中的核酸(例如，质粒)的核酸脂质颗粒。SNALPs和SPLPs典型地包含阳离子脂质，非阳离子脂质，和阻止所述颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALPs和SPLPs具有全身施用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后显示延长的循环寿命，在远端位点(例如，在身体上与施用位点分隔的位点上)聚集并且可以介导被转染的基因在这些远端位点的表达。SPLPs包括“pSPLP”，其包括如在WO 00/03683中提及的被包封的缩合剂-核酸复合物。

术语“形成小泡的脂质”倾向于包括任何具有疏水部分和极性头部基团的两亲性脂质并且其本身可以在水中自发形成双层小泡，示例为大多数磷脂。

术语“采用小泡的脂质”倾向于包括稳定与脂双层结合的任何两亲性脂质，以及其它的两亲性脂质，其疏水部分与内部，双层膜的疏水区域接触，并且其极性头部基团部分朝向外部，膜的极性表面。采用小泡的脂质包括这样的脂质，其能够独立地适宜于采用非层状的相，还能够在存在双层稳定组分时，采取双层结构。典型的实例是DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)。双层稳定组分包括，但不限于，抑制SNALPs聚集的缀合的脂质，聚酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质衍生物)、肽、蛋白质、去污剂、脂质衍生物、PEG-脂质衍生物诸如与二烷氧基丙基偶联的PEG、与二酰基甘油偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG，和与神经酰胺缀合的PEG(见，美国专利号5,885,613)。PEG可以直接与脂质缀合或可以通过接头部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG偶联于脂质的任何接头部分，包括，例如，包含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。

用于本文时，术语“包含非酯的接头部分”指不包含羧酸酯键(-OC(O)-)的接头部分。适合的包含非酯的接头部分包括，但不限于，酰氨基(-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(O)CCH₂CH₂C(O)-)，琥珀酰胺(-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-)，醚，二硫化物等，及其组合(诸如包含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在优选的实施方案中，将氨基甲酸酯接头用于将PEG偶联于脂质。

在其它的实施方案中，包含酯的接头部分用于将PEG偶联于脂质。适合的包含酯的接头部分包括，例如碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基(succinoyl)，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其组合。

术语“两亲性脂质”部分地指任何适合的材料，其中脂质材料的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。两亲性脂质通常是脂质小泡的主要成分。亲水性质来自极性或带电基团诸如碳水化合物，磷酸盐(酯)，羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团的存在。疏水性可以通过包含非极性基团来赋予，所述非极性基团包括，但不限于，长链饱和和不饱和脂族烃基团和由一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。两亲性化合物的实例包括，但不限于，磷脂、氨脂质和鞘脂类。磷脂的代表性实例包括，但不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。缺乏磷的其它化合物，诸如鞘磷脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸也在被称为两亲性脂质的组中。另外，上述的两亲性脂质可与其它脂质混和，所述脂质包括甘油三酯和固醇。

术语“中性脂质”指在选定的pH以未带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH下，这样的脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、神经鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。

术语“非阳离子脂质”指如上所述的任何中性脂质以及阴离子脂质。

术语“阴离子脂质”指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺，赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，和其它与中性脂质连接的阴离子修饰基团。

术语“阳离子脂质”指在选定的pH，诸如生理pH下携带净正电荷的许多脂质种类中的任何一种。这些脂质包括，但不限于，1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(″DLinDMA″)，1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(″DLenDMA″)，双十八烷基二甲铵(″DODMA″)，二硬脂酰二甲铵(″DSDMA″)，N，N-二油基-N，N-氯化二甲铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(″DOTMA″)；N，N-二硬脂酰-N，N-溴化二甲铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(″DOTAP″)；3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)和N-(1，2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(″DMRIE″)。例如，在低生理pH上具有阳性电荷的阳离子脂质包括，但不限于：DODAP，DODMA，和DMDMA。在某些情形中，阳离子脂质包括可质子化的叔胺头部基团、C18烷基链，在头部基团和烷基链之间的醚键，和0-3个双键。这些脂质包括，例如DSDMA，DLinDMA，DLenDMA，和DODMA。所述阳离子脂质可以包括醚键和pH可滴定的头部基团。这些脂质包括，例如DODMA。

术语“疏水脂质”指具有非极性基团的化合物，其包括，但不限于，长链饱和和不饱和脂族烃基团并且这些基团任选地被一个或多个芳香族、脂环族或杂环族基团所取代。合适的实例包括，但不限于，二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。

术语“融合性的”指脂质体，SNALP或其它药物递送***与细胞膜融合的能力。所述膜可以是质膜或围绕细胞器，例如内体、核等的膜。

术语“核酸”或“多核苷酸”指包含至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的以单或双链形式存在的聚合物。核酸包括包含已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，其是合成的，天然存在的，或非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。这些类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯(phosphorothioates)，氨基磷酸酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。除非具体限制，该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，具体的核酸序列还暗含地涵盖其保守性修饰的变体(例如，简并密码子替换)，等位基因，直向同源物，SNPs和互补序列以及明显指出的序列。具体地，可通过产生序列来获得简并密码子替换，在所述序列中一个或多个选定(或所有)的密码子的第三个位置由混和的碱基和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer et al.，NucleicAcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka etal.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol et al.(1992)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。“核苷酸”包含糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，碱基，和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团进行连接在一起。核苷酸包括化学修饰的核苷酸，如在例如WO 03/74654中所述。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷，和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括，但不限于取代新的反应基的修饰，所述反应基诸如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧酸盐(酯)和卤代烷。DNA 可以以反义、质粒DNA、质粒DNA的部分、预压缩的DNA、聚合酶链式反应(PCR)的产物、载体(P1，PAC，BAC，YAC，人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些基团的衍生物的形式存在。术语核酸与基因、质粒、cDNA、mRNA和干扰RNA分子(例如，合成的siRNA或表达自质粒的siRNA)交互使用。

III阳离子脂质

本发明提供新的阳离子脂质，与常用的阳离子脂质(诸如DODAC和DODMA)相比，其具有增加的柔性。更具体地，本发明提供具有下列结构的式I的新的阳离子脂质：

在上述式I中，R¹和R²独立地进行选择并且是H或C₁-C₃烷基。R³和R⁴独立地进行选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基基团，其中R³和R⁴至少其中之一包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R³和R⁴都是相同的，即R³和R⁴都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中，R³和R⁴是不同的，即R³是十四碳三烯基(C14)，且R⁴是亚油基(C18)。在优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即R³和R⁴都是相同的。在另一个优选的实施方案中，R³和R⁴都包含至少两个不饱和位点。在一些实施方案中，R³和R⁴独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R³和R⁴都是亚油基。在一些实施方案中，R³和R⁴包含至少三个不饱和位点并且独立地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基和二十碳三烯基。

本发明还提供具有下列结构的式II的新的阳离子脂质：

在上述式II中，R¹和R²进行独立地选择并且是H或C₁-C₃烷基。R³和R⁴进行独立地选择并且是具有约10-约20个碳原子的烷基基团；R³和R⁴至少一个包括至少两个不饱和位点。在一个实施方案中，R³和R⁴都是相同的，即R³和R⁴都是亚油基(C18)等。在另一个实施方案中，R³和R⁴是不同的，即R³是十四碳三烯基(C14)，且R⁴是亚油基(C18)。在优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即R³和R⁴都是相同的。在另一个优选的实施方案中，R³和R⁴都包含至少两个不饱和位点。在一些实施方案中，R³和R⁴独立地选自十二碳二烯基，十四碳二烯基，十六碳二烯基，亚油基和二十碳二烯基。在优选的实施方案中，R³和R⁴都是亚油基。在一些实施方案中，R³和R⁴包含至少三个不饱和位点并且独立地选自，例如十二碳三烯基，十四碳三烯基，十六碳三烯基，亚麻基和二十碳三烯基。

IV包含阳离子脂质的基于脂质的载体***

在一个实施方案中，本发明提供稳定的核酸-脂质颗粒(SPLPs或SNALPs)和其它的基于脂质的载体***(例如，脂质体，胶束，病毒体，脂质-核酸颗粒，核酸复合物及其混合物)，其包含本发明的阳离子脂质，即式I，式II，或其组合的阳离子脂质。本发明的脂质-核酸颗粒典型地包括核酸，式I或式II的阳离子脂质，非阳离子脂质和PEG-脂质缀合物。式I或式II的阳离子脂质典型地包含存在于所述颗粒中的从约2％到约60％，从约5％到约50％，从约10％到约45％，从约20％到约40％，或约30％的总脂质。所述非阳离子脂质典型地包含存在于所述颗粒中的约5％到约90％，从约10％到约85％，从约20％到约80％，从约30％到约70％，从约40％到约60％或约48％的总脂质。所述PEG-脂质缀合物典型地包含存在于所述颗粒中的从约1％到约20％，从约1.5％到约18％，从约4％到约15％，从约5％到约12％，或约2％的总脂质。本发明的核酸-脂质颗粒还可以包含胆固醇。如果存在，胆固醇典型地包含存在于所述颗粒中的约10％到约60％，约12％到约58％，从约20％到约55％，或约48％的总脂质。对于本领域技术人员将容易变得显而易见的是，例如，使用在本文所述的ERP测定，核酸-脂质颗粒的成分的比例可以变化。例如，对于全身递送，阳离子脂质可以包含存在于所述颗粒中的约5％到约15％的总脂质，而对于局部或区域性递送，所述阳离子脂质包含存在于所述颗粒中的约40％到约50％的总脂质。

本发明的核酸-脂质颗粒典型地具有约50nm到约150nm，更典型地约100nm到约130nm，最典型地约110nm到约115nm的平均直径并且是基本无毒的。此外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，核酸对于水溶液中核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂质颗粒及其制备的方法公开在美国专利号5,753,613；5,785,992；5,705,385；5,976,567；5,981,501；6,110,745；6,320,017和WO 96/40964。

A.阳离子脂质

可以将式I和II的阳离子脂质单独，或组合以一种或多种其它的阳离子脂质种类或非阳离子脂质种类来用在本发明中。

本文所述的式I和式II的阳离子脂质典型地在选定的pH，诸如生理pH上携带净正电荷。令人惊奇地发现，包含具有多个不饱和位点，例如至少两个或三个不饱和位点的烷基链的阳离子脂质在形成具有增加的膜流动性的脂质-核酸颗粒中是特别有用的。已经将也在本发明中是有用的许多阳离子脂质和相关类似物描述在同时待审的USSN 08/316,399；美国专利号5,208,036，5,264,618，5,279,833和5,283,185，和WO 96/10390中。

另外的适合的阳离子脂质包括，例如双十八烷基二甲铵(″DODMA″)，二硬脂酰二甲铵(″DSDMA″)，N，N-二油基-N，N-二甲铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(″DOTMA″)；N，N-二硬脂酰-N，N-溴化二甲铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-氯化三甲铵(″DOTAP″)；3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)和N-(1，2二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(″DMRIE″)。将在本发明中也有用的许多这些脂质和相关类似物，描述在美国专利号5,208,036，5,264,618，5,279,833，5,283,185，5,753,613和5,785,992中。

B.非阳离子脂质

用于本发明的非阳离子脂质可以是能够产生稳定复合体的多种中性不带电荷的，两性离子或阴离子脂质中的任一种。它们优选地是中性的，尽管它们可以备选地是带正电荷或带负电荷的。用在本发明中的非阳离子脂质的实例包括：磷脂-相关的物质，诸如卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂，磷脂酸，脑苷脂，二鲸蜡基磷酸酯，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二棕榈酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。非阳离子脂质或固醇诸如胆固醇可以存在。另外的不含磷的脂质是，例如，硬脂胺，十二烷胺，十六烷胺，乙酰基棕榈酸酯，甘油蓖麻醇酸酯，硬脂酸十六烷基酯，十四烷酸异丙酯，两性丙烯酸酯聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯，烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化脂肪酸酰胺，二(十八烷基)二甲基溴化铵等，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，和脑苷脂。其它的脂质诸如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺可以存在。非阳离子脂质还包括基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000和与磷脂或与神经酰胺(被称作PEG-Cer)缀合的聚乙二醇，如在同时待审的USSN08/316,429中所描述的。

在优选的实施方案中，非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱(例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱和二亚油酰磷脂酰胆碱)，二酰基磷脂酰乙醇胺(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺和棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺)，神经酰胺或鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是来自具有C₁₀-C₂₄碳链的脂肪酸的酰基基团。更优选地是酰基基团是月桂酰，肉豆蔻酰，棕榈酰，硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中，非阳离子脂质将是胆固醇，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺，或卵鞘磷脂(ESM)。

C.双层稳定组分

除了阳离子和非阳离子脂质之外，本发明的SPLPs包含双层稳定组分(BSC)诸如ATTA-脂质或PEG-脂质，诸如偶联于二烷氧基丙基的PEG(PEG-DAA)，如在例如WO 05/026372中所述，偶联于二酰基甘油的PEG(PEG-DAG)，如在例如美国专利公开号20030077829和2005008689中所述，偶联于磷脂酰乙醇胺(PE)的PEG(PEG-PE)，或缀合于神经酰胺的PEG，或其混合物(见，美国专利号5,885,613)。在一个优选的实施方案中，所述BSC是抑制SPLPs的聚集的缀合的脂质。适合的缀合的脂质包括，但不限于，PEG-脂质缀合物，ATTA-脂质缀合物，阳离子-聚合物-脂质缀合物(CPLs)或其混合物。在一个优选的实施方案中，所述SPLPs包含与CPL一起的PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物。

PEG是聚乙二醇，一种具有两个末端羟基基团的线性，乙烯PEG重复单元的水溶性聚合物。根据它们的分子量，将PEGs进行分类；例如，PEG 2000具有约2,000道尔顿的平均分子量，PEG5000具有约5,000道尔顿的平均分子量。PEGs是可从Sigma Chemical Co.和其它公司商购的并且包括例如下列各项：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)，单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)，单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)，单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH₂)，单甲氧基聚乙二醇-tresylate(MePEG-TRES)，和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。此外，单甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH₂COOH)，在制备PEG-脂质缀合物，包括PEG-DAA缀合物中特别有用。

在优选的实施方案中，所述PEG具有从约550道尔顿到约10,000道尔顿，更优选地约750道尔顿到约5,000道尔顿的平均分子量，更优选地，具有约1,000道尔顿到约5,000道尔顿的平均分子量，更优选地具有约1,500道尔顿到约3,000道尔顿的平均分子量，并且，甚至更优选地具有约2,000道尔顿或约750道尔顿的平均分子量。所述PEG可以任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基所取代。PEG可以直接缀合于所述脂质或可以通过接头部分连接于所述脂质。可以使用适合于将PEG偶联于脂质的任何接头部分，包括，例如包含非酯的接头部分和包含酯的接头部分。在优选的实施方案中，所述接头部分是包含非酯的接头部分。用于本文时，术语“包含非酯的接头部分”指不包含羧酸酯键(-OC(O)-)的接头部分。适合的包含非酯的接头部分包括，但不限于，酰氨基(-C(O)NH-)，氨基(-NR-)，羰基(-C(O)-)，氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)，脲(-NHC(O)NH-)，二硫化物(-S-S-)，醚(-O-)，琥珀酰(-(O)CCH₂CH₂C(O)-)，琥珀酰胺(-NHC(O)CH₂CH₂C(O)NH-)，醚，二硫化物等，及其组合(诸如包含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在优选的实施方案中，将氨基甲酸酯接头用于将PEG偶联于脂质。

在其它实施方案中，包含酯的接头部分用于将PEG偶联于脂质。适合的包含酯的接头部分包括，例如，碳酸酯(-OC(O)O-)，琥珀一酰基，磷酸酯(-O-(O)POH-O-)，磺酸酯，及其组合。

可以将磷脂酰乙醇胺与聚乙二醇缀合从而形成双层稳定组分，所述磷脂酰乙醇胺具有不同链长度和饱和程度的各种酰基链基团。这些磷脂酰乙醇胺是可商购的，或可以使用那些本领域技术人员已知的常规技术来分离或合成。包含具有在C₁₀-C₂₀范围内的碳链长度的饱和的或不饱和的脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的。还可以使用这样的磷脂酰乙醇胺，其具有单或双不饱和脂肪酸及饱和和不饱和脂肪酸的混合物。合适的磷脂酰乙醇胺包括，但不限于，如下：二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

术语“ATTA”或“聚酰胺”指，但不限于，在美国专利号6,320,017和6,586,559中公开的化合物。这些化合物包括具有下式的化合物：

其中：R是选自由氢、烷基和酰基组成的组中的成员；R¹是选自由氢和烷基组成的组中的成员；或任选地，R和R¹和它们所结合的氮原子形成叠氮基部分；R²是选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的芳基和氨基酸侧链的组的成员；R³是选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、氨基和NR⁴R⁵组成的组的成员，其中R⁴和R⁵独立地是氢或烷基；n是4-80；m是2-6；p是1-4；并且q是0或1。那些本领域技术人员将清楚的是其它聚酰胺可用在本发明的化合物中。

术语“二酰基甘油”指具有2-脂肪酰基链的化合物，其R¹和R²都独立地具有通过酯键与甘油的1-和2-位键合的2-30个碳原子。所述酰基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二酰基甘油具有如下的通式：

术语“二烷氧基丙基”指具有2-烷基链的化合物，其R¹和R²都独立地具有2-30个碳。烷基基团可以是饱和的或具有不同程度的不饱和。二烷氧基丙基具有如下的通式：

在一个优选实施方案中，PEG-脂质是具有下式的PEG-DAA缀合物：

在式VI中，R¹和R²被独立地选择并是具有约10-约22个碳原子的长链烷基基团。所述长链烷基基团可以是饱和的或是不饱和的。适合的烷基基团包括，但不限于，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在优选的实施方案中，R¹和R²是相同的，即R¹和R²都是肉豆蔻基(即二肉豆蔻基)，R¹和R²都是硬脂基(即，二硬脂基)等。

在上述式VI中，“R¹和R²”被独立地选择并是具有约10-约20个碳原子的烷基基团；PEG是聚乙二醇；且L是如上所述包含非酯的接头部分。适合的烷基基团包括，但不限于，月桂基(C12)，肉豆蔻基(C14)，棕榈基(C16)，硬脂基(C18)和二十碳烷基(C20)。在优选的实施方案中；R¹和R²是相同的，即它们都是肉豆蔻基(C14)或都是棕榈烷基(C16)或都是硬脂基(C18)等。在优选的实施方案中，所述烷基基团是饱和的。

在上述的式VI中，“PEG”是聚乙二醇，其具有在约550道尔顿到约10,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约750道尔顿到约5,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约1,000道尔顿到约5,000道尔顿范围内的平均分子量，更优选约1,500道尔顿到约3,000道尔顿范围内的平均分子量，并且甚至更优选约2,000道尔顿，或约750道尔顿的平均分子量。所述PEG可以任选地被烷基，烷氧基，酰基或芳基取代。在一个优选的实施方案中，末端羟基基团被甲氧基或甲基基团所取代。

在上述的式VI中，“L”是包含非酯的接头部分或包含酯的接头部分。在一个优选的实施方案中，L是包含非酯的接头部分。适合的包含非酯的接头包括，但不限于，酰氨基接头部分，氨基接头部分，羰基接头部分，氨基甲酸酯接头部分，脲接头部分，醚接头部分，二硫化物接头部分，琥珀酰胺基接头部分及其组合。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是氨基甲酸酯接头部分(即，PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是酰氨基接头部分(即，PEG-A-DAA缀合物)。在一个优选的实施方案中，包含非酯的接头部分是琥珀酰胺基接头部分(即，PEG-S-DAA缀合物)。

使用本领域那些技术人员已知的标准技术和试剂来合成PEG-DAA缀合物。将认识到所述PEG-DAA缀合物将包含各种酰胺，胺，醚，硫代(thio)，氨基甲酸酯和脲键。本领域那些技术人员将认识到用于形成这些键的方法和试剂是众所周知的并且是容易获得的。见，例如March，ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY(Wiley 1992)，Larock，COMPREHENSIVEORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989)；和Furniss，VOGEL′STEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ed.(Longman1989)。还将理解，存在的任何官能团在合成所述PEG-DAA缀合物中可能需要在不同位点上的保护和去保护。那些本领域技术人员将认识到这些技术是众所周知的。见，例如Green和Wuts，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991)。

在目前优选的实施方案中，所述PEG-DAA缀合物是二月桂基氧基丙基(C12)-PEG缀合物，二肉豆蔻基氧基丙基(C14)-PEG缀合物，二棕榈酰氧基丙基(C16)-PEG缀合物或二steryl氧基丙基(C18)-PEG缀合物。本领域那些技术人员将容易明白其它的二烷氧基丙基可以用在本发明的PEG-DAA缀合物中。

除了上述，本领域那些技术人员将容易清楚的是，可以用其它亲水性聚合物来取代PEG。可以用来取代PEG的适合的聚合物的实例包括，但不限于，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺，聚乳酸，聚羟基乙酸，和衍生化纤维素，诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

除了前述成分外，本发明的SNALPs和SPLPs还可以包括阳离子聚(乙二醇)(PEG)脂质，或CPLs，其已经被设计用于***脂双层中来赋予正电荷(见，Chen et al.，Bioconj.Chem.11：433-437(2000))。用在本发明中的适合的SPLPs和SPLP-CPLs，以及制备和使用SPLPs和SPLP-CPLs的方法公开于例如美国专利号6,852,334，和WO 00/62813中。用在本发明中的阳离子聚合物脂质(CPLs)有如下的结构特色：(1)将CPLs结合到脂双层中的脂质锚，诸如疏水脂质；(2)将脂质锚连接于阳离子头部基团的亲水间隔臂，诸如聚乙二醇；和(3)产生可质子化的阳离子头部基团的聚阳离子部分，诸如天然存在的氨基酸。

适合的CPL包括式VII的化合物：

A-W-Y(VII)

其中A，W和Y如下所述。

参考式VII，“A”是脂质部分诸如两亲性脂质，中性脂质或充当脂质锚的疏水性脂质。适合的脂质实例包括小泡-形成脂质或采用小泡的脂质并包括，但不限于二酰基甘油基、二烷基甘油基、N-N-二烷基氨基、1，2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1，2-二烷基-3-氨基丙烷。

“W”是聚合物或低聚物，诸如亲水性聚合物或低聚物。优选地，亲水性聚合物是生物相容的聚合物，其是非免疫原性的或具有低内在免疫原性。或者，如果与合适的佐剂一起使用，所述亲水聚合物可以是弱抗原性的。合适的非免疫原性聚合物包括，但不限于，PEG、聚酰胺、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物及其组合。在一个优选的实施方案中，所述聚合物具有约250至约7000道尔顿的分子量。

“Y”是聚阳离子部分。所述术语聚阳离子部分指在选定的pH，优选地生理pH上带正电荷、优选地带至少2个正电荷的化合物、衍生物或官能团。合适的聚阳离子部分包括碱性氨基酸和它们的衍生物诸如精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸；精胺；亚精胺；阳离子树状聚体；聚胺；聚胺糖；和氨基多糖。所述聚阳离子部分在结构上可以是线性的诸如线性四赖氨酸(tetralysine)、支链或树状聚体。聚阳离子部分在选定的pH值，具有介于约2-约15个之间的正电荷，优选地具有约2至约12之间的正电荷，并且更优选地具有介于约2至约8个之间的正电荷。选择使用的聚阳离子部分的类型可以通过理想的脂质体应用的类型来进行确定。

在聚阳离子部分上的电荷可以分布在整个脂质体部分周围或，它们可以是在脂质体部分的一个具体区域中电荷密度的不连续集中，例如电荷尖峰(spike)。如果电荷密度分布在脂质体上，电荷密度可以相等地分布或不相等地分布。聚阳离子部分的电荷分布的所有变化包含在本发明中。

脂质“A”和非免疫原性的聚合物“W”可以通过各种方法以及优选地通过共价连接进行连接。本领域那些技术人员已知的方法可以用于“A”和“W”的共价连接。合适的键合物(linkage)包括，但不限于，酰胺、胺、羧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、酯和腙键合物。本领域技术人员将清楚的是“A”和“W”必须具有互补的官能团从而完成所述键合。这样两个基团的反应将提供理想的键合，所述基团一个在脂质上并且另一个在聚合物上。例如，当所述脂质是二酰基甘油并且所述末端羟基被用例如NHS和DCC激活从而形成活性酯，接着与包含氨基基团的聚合物诸如与聚酰胺反应时(见，美国专利号6,320,017和6,586,559)，酰胺键将在两个基团之间形成。

在某些情形中，聚阳离子部分可以具有连接的配体诸如靶向配体或络合钙的鳌合部分。优选地，在所述配体连接后，所述阳离子部分维持正电荷。在某些情形中，连接的配体具有正电荷。合适的配体包括，但不限于，具有反应官能团的化合物或装置并包括脂质，两亲性脂质，载体化合物，生物亲和性化合物，生物材料，生物聚合物，生物医用装置，在分析上可检测的化合物，治疗上有活性的化合物，酶，肽，蛋白质，抗体，免疫刺激物，放射性标记，荧光，生物素，药物，半抗原，DNA，RNA，多糖，脂质体，病毒体，胶束，免疫球蛋白，官能团，其它靶向部分或毒素。

D目标产物

除了上述组分之外，本发明的SPLPs和SNALPs包括核酸(例如，单链或双链DNA，单链或双链RNA，RNAi，siRNA等)。适合的核酸包括，但不限于，质粒，反义寡核苷酸，核酶以及其它的聚-和寡-核苷酸。在优选的实施方案中，所述核酸编码产物，例如目标治疗性产物。可以将本发明的SPLP′s和SNLPs用于递送核酸到细胞(例如哺乳动物的细胞)从而，例如表达核酸或使由细胞表达的靶序列沉默。

目标产物可以用于商业目的，包括用于作为药物或诊断的治疗性目的。治疗性产物的实例包括，蛋白质，核酸，反义核酸，核酶，tRNA，snRNA，siRNA，抗原，VIII因子，和凋亡蛋白(Zhuang et al.(1995)Cancer Res.55(3)：486-489)。适合种类的基因产物包括，但不限于，细胞毒性/***基因，免疫调节剂，细胞受体配体，肿瘤抑制物，和抗血管发生的基因。选择的特定基因将取决于所意欲的目的或治疗。这些目标基因的实例在下面和贯穿整个说明书进行描述。

在一些实施方案中，所述核酸是使目标基因沉默的siRNA分子。这些核酸可以单独施用，或组合以常用药剂的施用进行施用，所述常用药剂用于治疗与目标基因相关的疾病或病症。在其它的实施方案中，所述核酸编码在患有特定疾病或病症(例如病原体感染或肿瘤疾病)的受试者中表达或过量表达的多肽并且可以方便地用于产生针对由所述基因表达的多肽的免疫应答。这些核酸可以单独施用或组合以常用药剂的施用进行施用，所述常用药剂用于治疗所述疾病或病症。在其它的实施方案中，所述核酸编码在患有特定疾病或病症(例如代谢性疾病或病症)的受试者中表达不足或不表达的多肽，并且其可以方便地用于表达多肽并且可以单独施用或组合以常用药剂的施用进行施用，所述常用药剂用于治疗所述疾病或病症。

1.目标基因

目标基因包括，但不限于，与病毒感染和存活相关的基因，与代谢疾病和病症(例如，肝疾病和病症)相关的基因，与肿瘤发生和细胞转化相关的基因，生血管基因，免疫调节剂基因诸如与炎症和自身免疫应答相关的那些，配体受体基因和与神经变性病症相关的基因。

a)与病毒感染和存活相关的基因

与病毒感染和存活相关的基因包括通过病毒表达从而结合，进入并在细胞中复制的那些。与慢性病毒疾病相关的病毒序列是特别感兴趣的。特别感兴趣的病毒序列包括肝炎病毒的序列(Hamasaki，et al.，FEBS Lett.543：51(2003)；Yokota，et al，EMBO Rep.4：602(2003)；Schlomai，et al.，Hepatology 37：764(2003)；Wilson，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：2783(2003)；Kapadia，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：2014(2003)；和FIELDSVIROLOGY(Knipe et al.eds.2001))，人免疫缺陷病毒(HIV)(Banerjea，etal.，Mol Ther.8：62(2003)；Song，et al.，J.Virol.77：7174(2003)；StephensonJAMA 289：1494(2003)；Qin，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.100：183(2003))，疱疹病毒(Jia，et al.，J.Virol.77：3301(2003))，和人***状瘤病毒(HPV)(Hall，etal.J.Virol.77：6066(2003)；Jiang，etal.，Oncogene 21：6041(2002))。可以被沉默的示例性肝炎病毒核酸序列包括，但不限于：涉及转录和翻译的核酸序列(例如，En1，En2，X，P)，编码结构蛋白质的核酸序列(例如，包括C和C相关的蛋白质的核心蛋白；包括S，M，和/或L蛋白质的衣壳和包膜蛋白质，或其片段)(见，例如，FIELDS VIROLOGY，2001，同上)。可以被沉默的示范性丙型肝炎核酸序列包括但不限于：丝氨酸蛋白酶(例如，NS3/NS4)，解旋酶(例如，NS3)，聚合酶(例如，NS5B)和包膜蛋白(例如，E1，E2，和p7)。甲型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC 001489中提及；乙型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC 003977中提及；丙型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC 004102中提及；丁型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC 001653中提及；戊型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC 001434中提及；并且G型肝炎核酸序列在例如Genbank登记号NC 001710中提及。

b)与代谢疾病和病症相关的基因

与代谢疾病和病症(例如，其中肝被靶向的病症和肝疾病以及病症)相关的基因包括，例如，在例如血脂异常(例如，肝X受体(例如，LXRα和LXRβGenback登记号NM 007121))，类法尼醇X受体(FXR)(Genbank登记号NM 005123)，固醇调节元件结合蛋白质(SREBP)，位点-1蛋白酶(S1P)，3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶-A还原酶(HMG辅酶-A还原酶)，载脂蛋白(ApoB)，和载脂蛋白(ApoE))和糖尿病(例如，葡糖-6-磷酸)中表达的基因(见，例如，Forman et al.，Cell 81：687(1995)；Seol et al.，Mol.Endocrinol.9：72(1995)，Zavacki et al.，PNAS USA 94：7909(1997)；Sakai，et al.，Cell85：1037-1046(1996)；Duncan，et al.，J.Biol.Chem.272：12778-12785(1997)；Willy，et al.，Genes Dev.9(9)：1033-45(1995)；Lehmann，et al.，J.Biol.Chem.272(6)：3137-3140(1997)；Janowski，et al.，Nature 383：728-731(1996)；Peet，etal.，Cell 93：693-704(1998))。本领域技术人员将理解与代谢疾病和病症(例如其中肝被靶向的疾病和病症以及肝疾病和病症)相关的基因包括在肝本身中表达的基因以及在其它器官和组织中表达的基因。

c)与肿瘤发生相关的基因

与肿瘤发生和细胞转化相关的基因序列的实例包括易位序列诸如MLL融合基因，BCR-ABL(Wilda，et al.，Oncogene，21：5716(2002)；Scherr，etal，Blood 101：1566)，TEL-AML1，EWS-FLI1，TLS-FUS，PAX3-FKHR，BCL-2，AML1-ETO和AML1-MTG8(Heidenreich，et al.，Blood101：3157(2003))；过度表达的序列诸如多药物抗性基因(Nieth，et al.，FEBSLett.545：144(2003)；Wu，et al，Cancer Res.63：1515(2003))，细胞周期蛋白(Li，et al.，Cancer Res.63：3593(2003)；Zou，et al.，Genes Dev.16：2923(2002))，β-联蛋白(Verma，et al.，Clin Cancer Res.9：1291(2003))，端粒末端转移酶基因(Kosciolek，et al.，Mol Cancer Ther.2：209(2003))，c-MYC，N-MYC，BCL-2，ERBB 1和ERBB2(Nagy，et al.Exp.Cell Res.285：39(2003))；和突变序列诸如RAS(综述于Tuschl和Borkhardt，Mol.Interventions，2：158(2002))。例如，使编码DNA修复酶的序列沉默与化疗剂的施用结合使用(Collis，et al.，Cancer Res.63：1550(2003))。编码与肿瘤迁移相关的蛋白质的基因也是目标靶序列，所述蛋白质，例如是整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白水解酶。前述实例并不是排外的。可以将有利于或促进肿瘤发生或细胞转化，肿瘤生长或肿瘤迁移的任何完整或部分基因序列包括进来作为目标基因序列。

d)生血管/抗生血管基因

生血管基因能够促进新血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)(Reich，et al.，Mol.Vis.9：210(2003))或VEGFr是特别感兴趣的。靶向VEGFr的siRNA序列在例如GB 2396864；美国专利公开号20040142895；和CA2456444中提出。

抗生血管基因能够抑制新血管形成。这些基因特别用于治疗其中血管发生在所述疾病的病理发展中具有作用的那些癌症。抗生血管基因的实例包括，但不限于，内皮抑制素(见，例如美国专利号6,174,861)，制管张素(见，例如美国专利号5,639,725)，和VEGF-R2(见，例如Decaussin et al.(1999)J.Pathol.188(4)：369-737)。

e)免疫调节剂基因

免疫调节剂基因是调节一个或多个免疫应答的基因。免疫调节剂基因的实例包括细胞因子诸如生长因子(例如，TGF-α.，TGF.-β，EGF，FGF，IGF，NGF，PDGF，CGF，GM-CSF，SCF，等)，白细胞介素(例如，IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-15，IL-20，etc等)，干扰素(例如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，等)，TNF(例如，TNF-α)，和Flt-3配体。Fas和Fas配体基因也是目标免疫调节剂靶序列(Song，et al.，Nat.Med.9：347(2003))。在生血和淋巴样细胞中的编码次级信号分子的基因也包括在本发明中，例如，Tec家族激酶，诸如Bruton’s酪氨酸蛋白激酶(Btk)(Heinonen，et al.，FEBS Lett.527：274(2002))。

f)细胞受体配体

细胞受体配体包括这样的配体，其能够结合细胞表面受体(例如，胰岛素受体，EPO受体，G-蛋白偶联受体，具有酪氨酸激酶活性的受体，细胞因子受体，生长因子受体等)从而调节(例如，抑制，激活等)涉及受体的生理途径(例如，葡萄糖水平调节，血液细胞发展，有丝***发生等)。细胞受体配体的实例包括细胞因子，生长因子，白细胞介素，干扰素，红细胞生成素(EPO)，胰岛素，胰高血糖素，G-蛋白偶联受体配体等)。编码三核苷酸重复(例如，CAG重复)的延伸的模板在神经变形疾病中使病原序列沉默中发现用途，所述疾病由三核苷酸重复的延伸所导致，诸如脊髓延髓肌肉萎缩和亨廷顿舞蹈病(Caplen，et al.，Hum.Mol.Genet.11：175(2002))。

g)肿瘤抑制基因

肿瘤抑制基因是能够抑制细胞，特别是肿瘤细胞的生长的基因。因此，将这些基因递送到肿瘤细胞中在癌症的治疗中是有用的。肿瘤抑制基因包括，但不限于，p53(Lamb et al.，Mol.Cell.Biol.6：1379-1385(1986)，Ewen etal.，Science 255：85-87(1992)，Ewen et al.(1991)Cell 66：1155-1164，和Hu etal.，EMBO J.9：1147-1155(1990))，RB1(Toguchida et al.(1993)Genomics17：535-543)，WT1(Hastie，N.D.，Curr.Opin.Genet.Dev.3：408-413(1993))，NF1(Trofatter et al.，Cell 72：791-800(1993)，Cawthon et al.，Cell 62：193-201(1990))，VHL(Latif et al.，Science 260：1317-1320(1993))，APC(Gorden et al.，Cell 66：589-600(1991))，DAP激酶(见，例如，Diess et al.(1995)GenesDev.9：15-30)，p16(见，例如，Marx(1994)Science 264(5167)：1846)，ARF(见，例如，Quelle et al.(1995)Cell 83(6)：993-1000)，神经纤维瘤蛋白(见，例如，Huynh et al.(1992)Neurosci.Lett.143(1-2)：233-236)，和PTEN(见，例如，Li et al.(1997)Science 275(5308)：1943-1947)。

h)细胞毒性/***基因

细胞毒性/***基因是在细胞周期中能够直接或间接杀死细胞，导致调亡，或抑制细胞的那些基因。这些基因包括，但不限于，免疫毒素基因，单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因，胞嘧啶脱氨酶基因，黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因，p53基因，嘌呤核苷磷酸化酶基因，羟酸酯酶基因，脱氧胞苷激酶基因，硝基还原酶基因，胸苷磷酸化酶基因，和细胞色素P450 2B1基因。

在基因疗法中，已知为基因递送酶前药疗法(″GDEPT″)的技术或，备选地，“***基因/前药”***，试剂诸如无环鸟苷和鸟嘌呤(对于胸苷激酶)，环磷酰胺(cyclophosphoamide)(对于细胞色素P450 2B1)，5-氟胞苷(对于胞嘧啶脱氨酶)典型地与表达盒组合(例如，同时地或非同时地，例如顺序地)进行全身施用从而获得所需的细胞毒性或抑制细胞效应(见，例如，Moolten，F.L.，Cancer Res.，46：5276-5281(1986))，所述表达盒编码本发明的***基因组成。关于GDEPT***的综述，见，Moolten，F.L.，The InternetBook of Gene Therapy，Cancer Therapeutics，Chapter 11(Sobol，R.E.，Scanlon，NJ(Eds)Appelton & Lange(1995))。在该方法中，异源基因在表达盒中被递送到细胞中，所述表达盒包含RNAP启动子，所述异源基因编码促进细胞较不敏感的第一化合物(即，“前药”)代谢为细胞更敏感的第二化合物的酶。所述前药与基因一起或在基因传递之后被递送到细胞中。所述酶将前药处理为第二化合物并据此响应。由Moolten提出的适合的***是单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因和前药鸟嘌呤。最近Zerrouqui，et al.，Can.Gen.Therapy，3(6)：385-392(1996)；Sugaya，et al.，Hum.Gen.Ther.，7：223-230(1996)和Aoki，et al.，Hum.Gen.Ther.，8：1105-1113(1997)使用阳离子-脂质核酸团聚体进行局部递送(即，直接肿瘤内注射)，或区域性递送(即，腹膜内)TK基因到小鼠肿瘤中来应用了该方法。已经提出了使用应用病毒载体的GDEPT***的人临床试验(见，Hum.Gene Ther.，8：597-613(1997)，和Hum.Gene Ther.，7：255-267(1996))并且其正在进行。

任何***基因/前药组合可以按照本发明进行使用。适合用于本发明的数种***基因/前药组合在Sikora，K.OECD Documents中，Gene DeliverySystems，59-71页(1996)被引用，其包括，但不限于下列各项：

***基因产物	更少活性的前药	被活化的药物
			单纯疱疹病毒类型1胸苷激酶(HSV-TK)	鸟嘌呤(GCV)，无环鸟苷，溴代乙烯基-脱氧尿苷，或其它底物	磷酸化的dGTP类似物
胞嘧啶脱氨酶(CD)	5-氟胞嘧啶	5-氟尿嘧啶
			黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(XGPRT)	6-硫代黄嘌呤(6TX)	6-硫鸟苷单磷酸酯
嘌呤核苷磷酸化酶	MeP-dr	6-甲基嘌呤
			细胞色素P4502B1	环磷酰胺	[细胞毒性代谢物]
Linamarase	苦杏仁苷	氰化物
			硝基还原酶	CB 1954	硝基苯甲脒
β-内酰胺酶	PD	PD芥子
			β-葡糖醛酸酶	adria-glu	阿霉素
羧肽酶	MTX-丙氨酸	MTX
			葡萄糖氧化酶	葡萄糖	过氧化物
青霉素酰胺酶	adria-PA	阿霉素
			超氧化物歧化酶	XRT	DNA损伤剂
核酶	RNA	裂解产物

如果被异源基因产物代谢为细胞更敏感的化合物，可以使用任何前药。优选地，细胞对于代谢物的敏感性至少是对于前药敏感性的10倍。

可以有用于本发明的GDEPT***的修饰，包括，例如，使用修饰的TK酶构建物，其中TK基因已经被突变从而导致前药更快地转变为药物(见例如，Black，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，93：3525-3529(1996))。或者，TK基因可以在二顺反子构建物中与增加其效果的另一个基因一起进行递送。例如，为了增加还被称作“邻近效应”的“旁观者效应”(其中在被转染的细胞附近中的细胞也被杀死)，TK基因可以与缝隙连接蛋白，诸如连接蛋白43的基因一起进行递送。连接蛋白容许TK酶的毒性产物从一个细胞扩散到另一个细胞。TK/连接蛋白43构建物具有CMV启动子，所述CMV启动子通过内部核糖体进入序列和编码连接蛋白43的核酸与TK基因可操作地进行连接。

2.siRNA

在一些实施方案中，所述核酸是siRNA。所述siRNA可以用于使目标基因的翻译(即，表达)下调或沉默。可以使用本领域已知的任何方式来鉴定适合的siRNA序列。典型地，描述在Elbashir，et al.，Nature 411：494-498(2001)和Elbashir，et al.，EMBO J 20：6877-6888(2001)中的方法与在Reynolds et al.，Nature Biotech.22(3)：326-330(2004)中提及的随机设计规则进行组合。

典型地，在来自目标靶基因的转录物的AUG起始密码子的3′的约50到约100个核苷酸中的序列进行关于二核苷酸序列(例如，AA，CC，GG，或UU)的扫描(见，例如Elbashir，et al.，EMBO J 20：6877-6888(2001))。将紧接所述二核苷酸序列3′的核苷酸鉴定为潜在的siRNA目标序列。典型地，将紧接二核苷酸序列3′的19，21，23，25，27，29，31，33，35或更多的核苷酸鉴定为潜在的siRNA目标位点。在一些实施方案中，所述二核苷酸序列是AA序列，并且将紧接AA二核苷酸的3′的19个核苷酸鉴定为潜在的siRNA目标位点。典型地，siRNA目标位点沿目标基因的长度以不同的位点间隔。为了进一步增加siRNA序列的沉默功效，还可以对潜在的siRNA靶位点进行分析以鉴定不包含与其它编码序列同源的区域的位点。例如，约21个碱基对的适合的siRNA目标位点将不具有与其它编码序列同源的超过16-17个连续碱基对。如果所述siRNA序列将自RNA Pol III启动子表达，选择缺乏超过4个连续A′s或T′s的siRNA靶序列。

一旦已经鉴定了潜在的siRNA目标位点，可以设计互补于siRNA目标位点的siRNA序列。为了提高它们的沉默功效，还可以通过随机设计算法对所述siRNA序列进行分析以鉴定具有下列特征的一个或多个的序列：(1)约25％到约60％G/C的G/C含量；(2)在有义链的位点15-19的至少3个A/Us；(3)没有内部重复序列；(4)在有义链的位点19的A；(5)在有义链的位点3的A；(6)在有义链的位点10的U；(7)在有义链的位点19没有G/C；和(8)在有义链的位点13上没有G。siRNA设计工具可以见于，例如http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNA，所述siRNA设计工具结合赋予这些特征的每个适合的值的算法并用于选择siRNA。

在一些实施方案中，一旦已经鉴定了潜在的siRNA序列，对所述序列进行免疫刺激基序(例如，富GU的基序)的存在与否的分析，如在例如同时待审的提交于2004年7月2日的美国临时专利申请号60/585301；提交于2004年7月19日的60/589363；提交于2004年11月12日的60/627326和提交于2005年3月25日的60/665297中所述。一旦被鉴定，可以对免疫刺激siRNA分子进行修饰以增加或减少它们的免疫刺激特性并可以对非免疫刺激分子进行修饰从而使它们具有免疫刺激特性。

3.产生siRNA

siRNA可以以数种形式进行提供，包括，例如作为一个或多个分离的小干扰RNA(siRNA)双链体，更长的双链RNA(dsRNA)或作为转录自DNA质粒中的转录盒的siRNA或dsRNA。还可以对siRNA进行化学合成。优选地，合成的或转录的siRNA具有约1-4个核苷酸的3′突出端，优选地约2-3个核苷酸的3′突出端，和5′磷酸末端。所述siRNA序列可以具有突出端(例如，如在(Elbashir，et al.，Genes Dev.15：188(2001)；Nyknen，et al.，Cell107：309(2001)中描述的3′或5′突出端)或可以无突出端(即，具有平端)。

RNA群可以用于提供长的前体RNAs，或与可用于制备siRNA的选定靶序列具有基本或完全同一性的长前体RNAs。所述RNAs可以按照本领域技术人员中众所周知的方法来从细胞或组织中分离，合成，和/或克隆。RNA可以是混和的群(获自细胞或组织，转录自cDNA，扣除的(subtrated)，选择的等)，或可以代表单一靶序列。RNA可以是天然存在的(例如，分离自组织或细胞样品)，在体外合成的(例如，使用T7或SP6聚合酶和PCR产物或克隆的cDNA)；或以化学方法合成。

为了形成长的dsRNA，对于合成RNAs，互补体还可以在体外转录并杂交以形成ds RNA。如果使用天然存在的RNA群，例如通过转录相应于RNA群的cDNAs，或通过使用RNA聚合酶，还提供了RNA互补体(例如，形成dsRNA，其通过大肠杆菌(E.coli)RNAse III或切酶进行消化)。接着，前体RNAs进行杂交从而形成双链RNAs进行消化。dsRNAs可以直接施用于受试者或可以在施用前进行体外消化。

或者，可以将编码一个或多个siRNA模板的一个或多个DNA质粒用于提供siRNA。例如，基于小核RNAU6或人RNase P RNA H1的天然存在转录单位，可以从质粒中的DNA模板将siRNA转录为自动折叠为具有发夹环的双链体的序列，所述质粒具有RNA聚合酶III转录单位(见，Brummelkamp，et al.，Science 296：550(2002)；Donzé，et al，Nucleic Acids Res.30：e46(2002)；Paddison，et al.，Genes Dev.16：948(2002)；Yu，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.99：6047(2002)；Lee，et al.，Nat.Biotech.20：500(2002)；Miyagishi，et al.，Nat.Biotech.20：497(2002)；Paul，et al.，Nat.Biotech.20：505(2002)；和Sui，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.99：5515(2002))。典型地，转录单位或盒将包含RNA转录启动子序列，诸如H1-RNA或U6启动子和终止序列，所述启动子可操作地与转录所需siRNA序列的模板连接，所述终止序列包括2-3个尿苷残基和聚胸苷(T5)序列(多腺苷酸化信号)(Brummelkamp，Science，同上)。选定的启动子可以提供组成型或可诱导型转录。将组合物和DNA-指导的RNA干扰分子的转录的方法详细描述于美国专利号6,573,099。将转录单位结合到质粒或DNA载体中，干扰RNA转录自所述质粒或DNA载体。将适合于体内递送遗传物质用于治疗目的的质粒详细描述于美国专利号5,962,428和5,910,488中。选定的质粒可以提供靶细胞的瞬时或稳定的递送。本领域那些技术人员将清楚的是起初被设计用于表达所需基因序列的质粒可以被进行修饰从而包含转录siRNA的转录单位盒。

分离RNA，合成RNA，杂交核酸，制备和筛选cDNA文库以及进行PCR的方法是本领域众所周知的(见，例如.，Gubler & Hoffman，Gene25：263-269(1983)；Sambrook et al.，同上；Ausubel et al.，同上)，PCR方法也是这样(见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))。表达文库也是本领域技术人员众所周知的。公开用在本发明中的一般方法的另外的基本书籍包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。

对适合的质粒进行工程改造从而使其以可表达的形式包含模板序列，所述序列编码目标基因产物的部分长度的序列或完整长度的序列。模板序列还可以用于提供分离的或合成的siRNA和dsRNA。一般而言，理想的是使目标基因产物的转录和翻译下调或沉默。

V.制备核酸-脂质颗粒

本发明提供制备血清稳定性核酸脂质颗粒的方法，其中质粒或其它核酸被包封在脂双层中并且被保护免于降解。由本发明的方法制备的颗粒典型地具有约50nm到约150nm的大小，更典型地具有约100nm到约130nm的大小，最典型地具有约110nm到约115nm的大小。所述颗粒可以通过本领域已知的任何方法来形成，所述方法包括，但不限于：连续混合方法，去污剂透析方法，或改进的反相方法，其在混和所述成分的过程中使用有机溶剂来提供单相。

在优选的实施方案中，所述阳离子脂质是式I和式II的脂质或其组合。在其它优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，DOPC，DPPE，DMPE，16:0单甲基磷脂酰乙醇胺，16:0二甲基磷脂酰乙醇胺，18:1反式磷脂酰乙醇胺，18:0 18:1磷脂酰乙醇胺(SOPE)，16:0 18:1磷脂酰乙醇胺，DSPE，基于聚乙二醇的聚合物(例如，PEG 2000，PEG 5000，PEG-修饰的二酰基甘油，或PEG-修饰的二烷氧基丙基)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，或其组合。在其它优选的实施方案中，所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二***或其组合。

在特别优选的实施方案中，所述核酸是质粒；所述阳离子脂质是式I或II的脂质或其组合；所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，PEG-DAAs，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，或其组合(例如，DSPC和PEG-DAAs)；并且所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二***或其组合。

在特别优选的实施方案中，本发明提供通过持续的混合方法来产生核酸-脂质颗粒，所述持续混和方法，例如这样的过程，所述过程包括在第一储存器中提供包含核酸诸如siRNA或质粒的水溶液，和在第二储存器中提供有机脂质溶液，并将所述水溶液与有机脂质溶液混和从而使所述有机脂质溶液与水溶液混和从而基本上瞬间产生包封核酸(例如，siRNA)的脂质体。用于进行该过程的方法和装置详细描述在美国专利公开号.20040142025中。

将脂质和缓冲溶液持续引入混和环境，诸如混和室中的操作导致了用缓冲液对脂质溶液的持续稀释，由此在混和后基本瞬时地产生脂质体。用于本文时，短语“用缓冲液持续稀释脂质溶液”(和变化)通常指用足够完成小泡形成的力量在水合作用过程中充分迅速地稀释所述脂质溶液。通过将包含核酸的水溶液和有机脂质溶液进行混和，在存在缓冲溶液(即，水溶液)时，有机脂质溶液经历持续逐步的稀释从而产生核酸-脂质颗粒。

使用持续混和方法形成的血清稳定性核酸-脂质颗粒典型地具有约50nm到约150nm的大小，更典型地具有约100nm到约130nm的大小，最典型地具有约110nm到115nm的大小。由此形成的颗粒没有聚集并且任选地进行大小排列以获得均一的颗粒大小。

在一些实施方案中，使用去污剂透析来形成所述颗粒。不倾向于被任何具体形成机制所束缚，质粒或其它核酸(例如siRNA)与阳离子脂质的去污剂溶液接触从而形成被包被的核酸复合体。这些被包被的核酸可以聚集并沉淀。然而，去污剂的存在减少了这种聚集并且使被包被的核酸与过量脂质(典型地，非阳离子脂质)反应从而形成颗粒，在所述颗粒中，质粒或其它核酸被包封在脂双层中。因此，本发明提供用于制备血清稳定性核酸-脂质颗粒的方法，其包括：

(a)在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质结合从而形成被包被的核酸-脂质复合体；

(b)使非阳离子脂质与被包被的核酸-脂质复合体接触从而形成包括质粒-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液；和

(c)透析步骤(b)中的去污剂溶液从而提供血清稳定性核酸-脂质颗粒的溶液，其中所述核酸被包封在脂双层中，所述颗粒是血清稳定性的并具有约50-约150nm之间的大小。

通过在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质结合来形成被包被的核酸-脂质复合体的起始溶液。

在这些实施方案中，所述去污剂溶液优选地是具有临界胶束浓度为15-300mM，更优选地为20-50mM的中性去污剂的水溶液。合适的去污剂的实例包括，例如，N，N’-((辛酰基亚氨基)-二-(1，3-亚丙基))-二-(D-葡糖酰胺(gluconamide))(BIGCHAP)；BRIJ 35；脱氧-BIGCHAP；十二烷基聚(乙二醇)醚；吐温20；吐温40；吐温60；吐温80；吐温85；Mega 8；Mega9；Zwittergent3-08；Zwittergent3-10；Triton X-405；己基-，庚基-，辛基-和壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷；和庚基硫代吡喃葡萄糖苷；其中辛基β-D-吡喃葡萄糖苷和吐温20是最优选的。去污剂在去污剂溶液中的浓度典型地是约100mM-约2M，优选地是约200mM-约1.5M。

将阳离子脂质和核酸典型地进行结合从而产生约1∶1-约20∶1比率，优选地约1∶1-约12∶1比率，以及更优选地约2∶1-约6∶1比率的电荷比率(+/-)。另外，在溶液中的核酸总浓度将典型地是约25μg/mL-约1mg/mL，优选地是约25μg/mL-约200μg/mL，并且更优选地是约50μg/mL-约100μg/mL。在一段时间内，在去污剂溶液中使核酸与阳离子脂质的结合典型地保持在室温，所述时间足够被包被的复合体形成。或者，核酸和阳离子脂质可以在去污剂溶液中结合并被加热到达到约37℃的温度。对于对温度特别敏感的核酸，被包被的复合体可以在更低的温度形成，所述温度典型地低至约4℃。

在一个优选的实施方案中，在形成核酸-脂质颗粒中的核酸与脂质的比率(质量/质量比率)的范围在约0.01-约0.08之间。起始物质的比率也在这个范围内，因为纯化步骤典型地将未被包封的核酸以及空脂质体去除。在另一个优选的实施方案中，所述核酸-脂质颗粒制剂使用每10mg总脂质约400μg核酸，或约0.01至约0.08，更优选地约0.04的核酸与脂质比率，所述比率对应于每50μg核酸，1.25mg的总脂质。

接着，使被包被的核酸-脂质复合体的去污剂溶液与非阳离子脂质接触从而提供核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液。有效用在该步骤中的非阳离子脂质包括，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，心磷脂和脑苷脂。在优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺或鞘磷脂。在这些脂质中的酰基基团优选地是衍生自具有C₁₀-C₂₄碳链的脂肪酸的酰基基团。更优选地，所述酰基基团是月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰或油酰。在特别优选的实施方案中，所述非阳离子脂质将是1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇，或其混合物。在最优选的实施方案中，所述核酸-脂质颗粒将是在体内具有提高特性的融合颗粒，所述非阳离子脂质将是DSPC或DOPE。此外，本发明的核酸-脂质颗粒还可包含胆固醇。在其它优选的实施方案中，所述非阳离子脂质还将包含基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000，和与二酰基甘油、神经酰胺、或磷脂缀合的聚乙二醇，如在美国专利号5,820,873和美国专利公开号20030077829中所述。在其它的优选实施方案中，所述非阳离子脂质还将包含基于聚乙二醇的聚合物诸如PEG 2000，PEG 5000，和与二烷氧基丙基缀合的聚乙二醇。

用于本发明方法的非阳离子脂质的量典型地是对于50μg的核酸，约2-约20mg的总脂质。优选地，总脂质的量是每50μg的核酸约5-约10mg。

在形成核酸-脂质复合体和非阳离子脂质的去污剂溶液后，优选地通过透析来去除去污剂。去污剂的去除导致围绕核酸的脂质双层的形成，从而提供血清稳定性的核酸-脂质颗粒，所述颗粒具有约50nm-约150nm的大小，更典型地具有约100nm到约130nm的大小，最典型地具有约110nm到115nm的大小。由此形成的颗粒不聚集并且任选地以大小排列以获得均一颗粒大小。

可以通过任一可获得的方法来对血清稳定性的核酸-脂质颗粒进行大小排列以获得按粒度分级的脂质体。可以进行按粒度分级从而获得理想的大小范围并且相对较窄的颗粒大小分布。

可获得一些技术从而对所述颗粒进行按大小排列到理想的大小。用于脂质体并等同地可应用于本发明颗粒的一个大小排列的方法描述于美国专利号4,737,323。通过水浴或探针超声波处理对颗粒混悬液进行超声波处理来产生逐渐的颗粒大小减少为少于约50nm的大小的颗粒。匀浆法是依赖于剪切力将更大的颗粒断裂为更小的颗粒的另一个方法。在一个典型的匀浆方法中，通过标准的乳状液匀浆器使颗粒再循环直到观察到典型地在约60和80nm之间的选定颗粒大小。在两种方法中，颗粒大小分布可以通过常规激光束颗粒大小辨别，或QELS来进行监测。

通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜来挤压颗粒也是将颗粒大小减少到相对充分定义的大小分布的有效方法。典型地，通过膜来将混悬液循环一次或数次直到获得理想的颗粒大小分布。可以通过连续更小孔的膜来挤压所述颗粒从而获得大小的逐渐减少。

在另一组实施方案中，本发明提供制备血清稳定性核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：

(a)在有机溶剂中制备包括阳离子脂质和非阳离子脂质的混合物；

(b)使核酸的水溶液与步骤(a)中的所述混合物接触从而提供清晰的单相；和

(c)移去所述有机溶剂来提供核酸-脂质颗粒的混悬液，其中所述核酸被包封在脂双层中，所述颗粒在血清中是稳定的并且具有约50-150nm的大小。

用于该组实施方案中的核酸(或质粒)，阳离子脂质和非阳离子脂质如对于上述去污剂透析方法所描述的。

对于有机溶剂的选择将典型地包括对溶剂极性和所述溶剂可在颗粒形成的后期被去除的容易性的考虑。也可被用作增溶剂的有机溶剂以足以提供核酸和脂质的清晰单相混合物的量存在。合适的溶剂包括，但不限于，氯仿、二氯甲烷、二***、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇或其它脂族醇诸如丙醇、异丙醇、丁醇、叔-丁醇、异丁醇、戊醇和己醇。两种或更多溶剂的组合也可用在本发明中。

通过将核酸的第一溶液，其典型地是水溶液和脂质的第二有机溶液混和在一起来完成核酸与阳离子和非阳离子脂质的有机溶液接触。本领域技术人员将理解可以通过许多方法，例如通过机械方式诸如通过使用涡旋混和器来使该混和发生。

在核酸已经与脂质的有机溶液接触后，去除所述有机溶剂，因此形成血清稳定性核酸-脂质颗粒的水性混悬液。用于去除有机溶剂的方法将典型地包括在减压下蒸发或将惰性气体(例如，氮或氩气)的气流鼓风吹过所述混合物。

由此形成的血清稳定性核酸-脂质颗粒将典型地大小在约50nm和150nm之间，更典型地在约100nm到约130nm之间，最典型地在约110nm到约115nm之间。为了获得进一步的颗粒中大小减少或大小的均一性，可以按照如上所述进行按大小排列。

在其它的实施方案中，所述方法将还包括添加非脂质聚阳离子，其可用于利用本发明的组合物实现向细胞的递送。合适的非脂质聚阳离子的实例包括，但不限于，海地美溴铵(hexadimethrine bromide)(在商标名POLYBRENE下，从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA购得)或其它heaxadimethrine的盐。其它合适的聚阳离子包括，例如，聚-L-鸟氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚-D-赖氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亚胺的盐。

在某些实施方案中，可以在单相***(例如，Bligh和Dyer单相或水性和有机溶剂的类似混合物)或两相***中进行核酸-脂质颗粒的形成，伴以合适的混和。

当在单相***中进行复合体的形成时，阳离子脂质和核酸每个都溶解在大量(a volume of)的单相混和物中。两种溶液的组合提供单一混合物，复合体形成在所述混合物中。或者，所述复合体可以在两相混合物中形成，在所述两相混合物中，阳离子脂质与核酸(其出现在水相中)结合，并将其“推”到有机相中。

在另一个实施方案中，本发明提供制备核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：

(a)使核酸与包括非阳离子脂质和去污剂的溶液接触以形成核酸-脂质混合物；

(b)使阳离子脂质与核酸-脂质混合物接触从而中和核酸的负电荷的部分并形成核酸和脂质的中和电荷的混合物；和

(c)使去污剂从电荷被中和的混合物中去除从而提供核酸-脂质颗粒，其中所述核酸被保护免于降解。

在一组实施方案中，非阳离子脂质和去污剂的溶液是水溶液。通过将核酸的第一溶液与脂质和去污剂的第二溶液混和在一起来典型地完成核酸与非阳离子脂质和去污剂的溶液接触。本领域技术人员将理解通过许多方法，例如通过机械方式诸如通过使用涡旋混合器该混和可以发生。优选地，所述核酸溶液还是去污剂溶液。用在本发明方法中的非阳离子脂质的量典型地基于所用的阳离子脂质的量进行确定，并典型地是阳离子脂质的量的约0.2-5倍，优选地是所用的阳离子脂质的量的约0.5-约2倍。

在一些实施方案中，如在例如美国专利申请号09/744,103中所述对核酸进行预压缩。

将因此形成的核酸-脂质混合物与阳离子脂质接触从而中和负电荷部分，所述负电荷部分与存在的核酸(或其它聚阴离子物质)关联。所用的阳离子脂质的量将典型地足以中和所述核酸的至少50％的负电荷。优选地，所述负电荷将至少有70％被中和，更优选地有至少90％被中和。有效用在本发明中的阳离子脂质包括，例如DLinDMA和DLenDMA。这些脂质和相关的类似物已经在提交于2004年6月7日的美国临时专利申请号60/578,075；提交于2004年9月17日的60/610,746；和提交于2005年5月9日的60/679,427中有所描述。

可以通过许多技术的任一个，优选地通过将阳离子脂质的溶液和包含所述核酸-脂质混合物的溶液混合在一起，来完成阳离子脂质与核酸-脂质混合物的接触。在将两种溶液混和(或以任一个其它方式接触)后，与核酸关联的负电荷部分被中和。但是，核酸仍旧保持在未压缩的状态并获得亲水特性。

在阳离子脂质已经与核酸-脂质混合物接触后，将去污剂(或去污剂和有机溶剂的组合)去除，因此形成所述核酸-脂质颗粒。用于去除去污剂的方法将典型地包括透析。当有机溶剂存在时，通过在减压下蒸发或通过将惰性气体(例如，氮气或氩气)的气流鼓风吹过混合物来典型地成功去除它。

由此形成的颗粒将典型地从约50nm到数微米，更典型地从约50nm到约150nm，甚至更典型地从约100nm到约130nm，最典型地从约110nm到约115nm来按大小排列。为了进一步获得在所述颗粒中大小减少或大小的均一性，可以将所述核酸-脂质颗粒进行超声波处理、过滤或进行其它用在脂质体制剂中并且是本领域技术人员所熟知的大小排列技术。

在其它实施方案中，该方法将还包括添加非脂质聚阳离子，其可用于利用本发明的组合物实现细胞的脂质转染。合适的非脂质聚阳离子的实例包括，海地美溴铵(在商标名POLYBRENE下，从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA购得)或其它heaxadimethrine的盐。其它合适的聚阳离子包括，例如，聚-L-鸟氨酸，聚-L-精氨酸，聚-L-赖氨酸，聚-D-赖氨酸，聚烯丙胺和聚乙烯亚胺的盐。这些盐的添加优选地在颗粒已经形成后进行。

在另一方面，本发明提供制备核酸-脂质颗粒的方法，所述方法包括：

(a)在溶液中使一定量的阳离子脂质与核酸接触；所述溶液包括约15-35％的水和约65-85％的有机溶剂并且阳离子脂质的量足以产生从约0.85-约2.0的+/-电荷比率，从而提供疏水核酸-脂质复合体；

(b)在溶液中使疏水性的核酸-脂质复合体与非阳离子脂质接触从而提供核酸-脂质混合物；和

(c)从核酸-脂质混合物中去除有机溶剂从而提供核酸-脂质颗粒，其中核酸被保护免于降解。

有效用在本发明该方面中的所述核酸、非阳离子脂质、阳离子脂质和有机溶剂与对于上面使用去污剂的方法所述的那些相同。在一组实施方案中，步骤(a)的溶液是单相的。在另一组实施方案中，步骤(a)的溶液是两相的。

在优选的实施方案中，所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，DOPC，基于聚乙二醇的聚合物(例如，PEG 2000，PEG 5000，PEG-修饰的二酰基甘油，或PEG-修饰的二烷氧基丙基)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，DPPE，DMPE，16:0单甲基磷脂酰乙醇胺，16:0二甲基磷脂酰乙醇胺，18:1反式磷脂酰乙醇胺，18:0 18:1磷脂酰乙醇胺(SOPE)，16:0 18:1磷脂酰乙醇胺，DSPE，胆固醇，或其组合。在其它优选的实施方案中，所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二***或其组合。

在一个实施方案中，所述核酸是自其中转录干扰RNA的质粒；所述阳离子脂质是DLindMA，DLenDMA，DODAC，DDAB，DOTMA，DOSPA， DMRIE，DOGS或其组合；所述非阳离子脂质是ESM，DOPE，DAG-PEGs，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，DPPE，DMPE，16:0单甲基磷脂酰乙醇胺，16:0二甲基磷脂酰乙醇胺，18:1反式磷脂酰乙醇胺，18:0 18:1磷脂酰乙醇胺(SOPE)，16:0 18:1磷脂酰乙醇胺DSPE，胆固醇，或其组合(例如，DSPC和PEG-DAA)；并且所述有机溶剂是甲醇，氯仿，二氯甲烷，乙醇，二***或其组合。

如上，优选地通过机械方式诸如通过使用涡旋混和器将核酸的第一溶液，和脂质的第二溶液混和在一起，来典型地完成所述核酸与阳离子脂质的接触。得到的混合物包含如上所述的复合体。接着，通过添加非阳离子脂质和去除有机溶剂来将这些复合体转化成颗粒。非阳离子脂质的添加通过简单将非阳离子脂质的溶液添加到包含所述复合体的溶液中典型地完成。还可以使用反向添加。可以通过本领域那些技术人员已知的方法和也如上所述来完成有机溶剂的随后的去除。

使用在本发明该方面中的非阳离子脂质的量典型地是用于提供电荷被中和的核酸-脂质复合体的阳离子脂质的量(基于摩尔基础)的约0.2-约15倍。优选地，所述量是所用的阳离子脂质的量的约0.5-约9倍。

在另一方面中，本发明提供核酸-脂质颗粒，其通过如上所述的方法进行制备。在这些实施方案中，所述核酸-脂质颗粒是净电荷中性的或携带总电荷，所述总电荷给所述颗粒提供更大的基因脂转染活性。优选地，颗粒的核酸组分是干扰不需要蛋白质的产生的核酸。在一个优选的实施方案中，核酸包含干扰RNA，并且非阳离子脂质是卵鞘磷脂并且所述阳离子脂质是DLinDMA或DLenDMA。在优选的实施方案中，所述核酸包含干扰RNA，所述非阳离子脂质是DSPC和胆固醇的混合物，并且所述阳离子脂质是DLinDMA或DLenDMA。在其它优选的实施方案中，所述非阳离子脂质还可包括胆固醇。

在本文讨论了制备SNALP-CPLs(包含CPL的SNALPs)的多种通用方法。两种通用技术包括“***后”技术，即将CPL***，例如预形成的SNALP中，和“标准”技术，其中在例如，SNALP形成步骤中，CPL被包括在脂质混合物中。所述***后技术导致这样的SNALPs，所述SNALPs主要在SNALP双层膜的外面中具有CPLs，而标准技术提供这样的SNALPs，其在内面和外面都具有CPLs。所述方法尤其有用于由磷脂制成的小泡(其可以包含胆固醇)，并且还有用于包含PEG-脂质(诸如PEG-DAAs和PEG-DAGs)的小泡。制备SNALP-CPL的方法在例如美国专利号5,705,385，6,586,410，5,981,501 6,534,484；6,852,334；美国专利公开号20020072121以及WO00/62813中进行教导。

A.核酸-脂质颗粒的施用

本发明的核酸-脂质颗粒可以单独或与生理可接受的载体(诸如生理盐水或磷酸盐缓冲液)混合施用，所述生理可接受的载体按照施用路径和标准的药用实践来选择。一般地，生理盐水将被应用作为药用载体。其它合适的载体包括，例如水，缓冲的水，0.4％的盐水，0.3％的甘氨酸等，包括增加稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白，脂蛋白，球蛋白等。

药用载体通常是在颗粒形成后被添加的。因此，在颗粒形成后，所述颗粒可以被稀释到药用载体诸如生理盐水中。

在药用制剂中颗粒的浓度可以在广泛范围内变化，即从少于约0.05重量％，通常在或至少约2-5重量％到多至10-30重量％，并将按照选定的特定施用方式主要通过流体体积、粘度等进行选择。例如，可以将浓度增加以降低与治疗相关的流体负荷。这可以在患有与动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压病的患者中是特别理想的。或者，由刺激性脂质组成的颗粒可以被稀释到低浓度从而在施用位点减少炎症。

如上所述，在一些实施方案中，本发明的核酸-脂质颗粒包含PEG-DAA缀合物。包括其它组分通常是理想的，所述其它组分以与PEG-DAA缀合物相似的方式作用，并作用于阻止颗粒聚集和提供增加循环生存期限以及增加核酸-脂质颗粒到靶组织的传递的方式。这些组分包括，但不限于，PEG-脂质缀合物，诸如到颗粒中的PEG-二酰基甘油，PEG-神经酰胺或PEG-磷脂(诸如PEG-PE)，神经节苷脂G_M1-修饰的脂质或ATTA-脂质。典型地，颗粒中成分的浓度将是约1-20％并且更优选地从约3-10％。

本发明的药物组合物可以通过常规，众所周知的灭菌技术进行灭菌。可以对水溶液进行包装以进行使用或在无菌条件下进行过滤并冷冻干燥，在施用前将所述冷冻干燥的制剂与无菌水溶液组合。所述组合物可以如合适的生理条件所要求包含药用辅助物质，所述辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂，张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。另外，所述颗粒混悬液可以包括脂质-保护性试剂，其在储存时，保护脂质免于自由基和脂质-过氧化损伤。亲脂性自由基猝灭剂，诸如α生育酚和水溶性铁特异性螯合剂，诸如铁草铵是合适的。

在它们应用的另一个实例中，脂质-核酸颗粒可以被结合到广泛的局部剂型中，所述剂型包括，但不限于，凝胶，油，乳剂等。例如，包含核酸-脂质颗粒的混悬液可以被配制并且被作为局部乳膏，糊，软膏，凝胶，洗剂等进行施用。

一旦形成，本发明的血清稳定性核酸-脂质颗粒用于将核酸引入细胞中。因此，本发明还提供将核酸(例如，质粒或和siRNA)引入细胞的方法。所述方法通过首先如上所述形成颗粒，接着使颗粒与细胞接触一段时间来在体外或在体内进行，所述时间足以使核酸向细胞的递送发生。

本发明的核酸-脂质颗粒可以被吸附于几乎任何与它们混和或接触的细胞类型。一旦被吸附，所述颗粒可以被所述细胞的部分所胞吞，与细胞膜交换脂质，或与细胞融合。颗粒的核酸部分的转移或结合可以通过这些途径的任何一种发生。具体而言，当发生融合时，颗粒的膜被整合到细胞膜中并且所述颗粒的内容物与细胞内流体组合。

使用本发明的ERP测定，可以对SPLP或其它的基于脂质的载体***的转染效率进行优化。更具体地，ERP测定的目的是基于它们对内体膜的结合/吸收或与其的融合/不稳定化的相对影响来区分SPLPs的各种阳离子脂质和辅助脂质成分的作用。该测定可从数量上确定SPLP或其它基于脂质的载体***的每个组分怎样实现转染效率，由此使SPLPs或其它的基于脂质的载体***优化。如上解释，内体释放参数，或备选地，ERP被定义为：

受体基因表达/细胞

SPLP吸收/细胞

将容易对于本领域那些技术人员而言是显而易见的是可以使用任何报道基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白等)。此外，可以用任何可检测的标记来标记脂质成分(或，备选地，SPLP或基于脂质的制剂的任何组分)，提供抑制或对吸收到细胞中的干扰。使用本发明的ERP测定，本领域技术人员可以评价各种脂质成分(例如，阳离子脂质，非阳离子脂质，PEG-脂质衍生物，PEG-DAA缀合物，ATTA-脂质衍生物，钙，CPLs，胆固醇，等)对细胞吸收和转染效率的影响，由此优化SPLP或其它基于脂质的载体***。通过比较各种SPLPs的每种或其它基于脂质的制剂的ERPs，可以容易地确定优化的***，例如，在细胞中具有最大的吸收，以及最大的转染效率的SPLP或其它基于脂质的制剂。

进行本发明的ERP测定的合适的标记包括，但不限于，光谱标记，诸如荧光染料(例如，荧光素和衍生物，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)和OregonGreen^υ；若丹明和衍生物，诸如德克萨斯红，四若丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate)(TRITC)，等，洋地黄毒苷，生物素，藻红蛋白，AMCA，CyDyes^υ等；放射性标记，诸如³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C，³²P，³³P，等；酶诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等；光谱比色标记诸如胶态金或有色玻璃或塑料珠，诸如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳等。使用本领域众所周知的方法，可以将标记直接或间接与SNALP，SPLP或其它的基于脂质的载体***的组分进行偶联。如上指出，可以使用广泛种类的标记，其中取决于所需的敏感性，与SNALP的组分缀合的容易性，稳定性需求和可获得的使用仪器和处理方案来选择标记。

VI.包含阳离子脂质的脂质体

除了上述的SNALP制剂之外，本发明的阳离子脂质(即，式I或式II的阳离子脂质)可以用在空脂质体或包含一种或多种生物活性剂的脂质体的制剂中。

A.脂质体制剂

可以用于制备脂质体的多种方法描述在，例如Szoka，et al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467(1980)，美国专利号4,186,183，4,217,344，4,235,871，4,261,975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028，4,946,787，WO91/17424，Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta，443：629-634(1976)；Fraley，et al.，PNAS.USA，76：3348-3352(1979)；Hope，et al.，Biochim.Biophys.Acta，812：55-65(1985)；Mayer，et al.，Biochim.Biophys.Acta，858：161-168(1986)；Williams，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：242-246(1988)，the text Liposomes，Marc J.Ostro，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1983，Chapter 1，和Hope，et al.，Chem.Phys.Lip.，40：89(1986)中。适合的方法包括，但不限于，超声波，挤压，高压/匀浆，微观流体化(microfluidization)，去污剂透析，小脂质体小泡的钙诱导的融合，和醚-灌输方法，这些方法都是本领域众所周知的。

一种方法产生多层的非均质大小的小泡。在该方法中，小泡-形成脂质被溶解在适合的有机溶剂或溶剂***中并且在真空下或惰性气体下被干燥从而形成薄的脂质薄膜。如果需要，所述薄膜可以被再次溶解在适合的溶剂中，诸如叔丁醇，并接着被冷冻干燥从而形成更均一的脂质混合物，其以更容易水合的粉末样形式存在。该薄膜被覆盖以水性缓冲溶液并且容许水合，典型地在15-60分钟的时期内，伴随搅拌。得到的多层小泡的大小分布可以通过在更剧烈的搅拌条件下使脂质水合或通过添加增溶去污剂，诸如脱氧胆盐(酯)来向更小的尺寸进行转变。

可以通过超声波或挤压法来制备单层的小泡。通常用尖端(tip)超声波仪，诸如Branson尖端(tip)超声波仪在冰浴中来进行超声处理。典型地，将所述混悬液进行强烈的超声处理循环。挤压可以在生物膜挤压机诸如Lipex Biomembrane Extruder上进行。在挤压滤器中的限定的孔大小可以产生具体大小的单层的脂质体小泡。通过不对称陶瓷滤器，诸如商购自Norton Company，Worcester MA的Ceraflow Microfilter进行的挤压也可以形成脂质体。还可以通过将磷脂溶解在乙醇中并接着将脂质注射到缓冲液中，导致脂质同时形成单层小泡来制备单层小泡。此外，磷脂可以溶解在去污剂，例如胆酸酯(盐)，Triton X，或正烷基葡糖苷中。将所述药物添加到被溶解的脂质-去污剂胶束中后，通过许多可能的方法中的任一种来去除去污剂，所述方法包括，透析，凝胶过滤，亲和层析法，离心和超滤。

在制备脂质体后，在配制过程中没有经过大小筛分的脂质体可以被按照大小排列从而获得理想的大小范围和相对较窄的脂质体大小分布。约0.2-0.4微米的大小范围使脂质体混悬液通过常规滤器以过滤方法进行灭菌。如果所述脂质体已经被按大小筛分到约0.2-0.4微米，过滤灭菌方法可以在高通量基础上进行。

可以获得数种将脂质体筛分到所需大小的技术。一种筛分方法描述在美国专利号4,737,323中。通过水浴或探测器超声处理来对脂质体混悬液进行超声处理将大小逐渐减少到少于约0.05微米大小的小单层小泡。匀浆法是依赖于剪切力将大脂质体断裂为更小脂质体的另一种方法。在典型的匀浆方法中，通过标准的乳状液匀浆器将多层小泡进行再循环直到观察到选定的脂质体大小，典型地介于约0.1和0.5微米之间。通过准电子光散射(QELS)来确定脂质体小泡的大小，如在Bloomfield，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，10：421-450(1981)中所描述的。通过超声处理形成的脂质体，可以减少平均的脂质体直径。不连续的超声处理循环可以与QELS评价交替进行从而指导有效的脂质体合成。

通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜来挤压脂质体也是将脂质体大小减少到相对充分限定的大小分布的有效方法。典型地，所述混悬液通过膜循环一次或多次直到获得所需的脂质体大小分布。所述脂质体可以通过连续地更小孔的膜进行挤压从而获得脂质体大小的逐渐减少。对于在本发明中的使用，具有约0.05微米到约0.40微米范围内大小的脂质体是优选的。在特别优选的实施方案中，脂质体介于约0.05和约0.2微米之间。

在优选的实施方案中，使用本领域那些技术人员已知的常规方法来制备空的脂质体。

B.将脂质体用作递送载体

本发明的药物递送组合物(例如，脂质体，胶束，脂质-核酸颗粒，病毒体等)对于治疗剂或生物活性剂的全身或局部递送是有用的，并且在诊断分析中也是有用的。

下列讨论通常关于脂质体；然而，对于本领域那些技术人员而言将容易变得显而易见的是这种相同的讨论对于本发明的其它药物递送***(例如，胶束，病毒体，脂质复合体，脂质-核酸颗粒等，使用本文所述的式I或II的阳离子脂质，它们都可以被有利地形成)是可以充分应用的。

对于治疗剂或生物活性剂的递送，包含阳离子脂质的脂质体组合物可以加载以治疗剂并被施用于需要治疗的受试者。使用本发明的组合物和方法进行施用的治疗剂可以是被选择用于待治疗的疾病的适合治疗的多种药物的任一种。通常，药物将是抗肿瘤药，诸如长春新碱(以及其它的长春花属生物碱)，多柔比星，米托蒽醌，喜树碱，顺铂，博来霉素，环磷酰胺，甲氨蝶呤，链佐星等。尤其优选的抗肿瘤药包括，例如，放线菌素D，长春新碱，长春花碱，胱氨酸***糖苷，蒽环霉素，烷化剂，铂化合物，抗代谢药，和核苷类似物，诸如甲氨蝶呤和嘌呤和嘧啶类似物。使用本发明的化合物和方法来将抗感染药递送到具体组织中也可以是理想的。本发明的组合物还可以用于选择性地递送其它药物，包括，但不限于，局部***，例如，地布卡因和氯丙嗪；β-肾上腺素阻断药，例如，***，噻吗洛尔和拉贝洛尔；抗高血压药，例如可乐定和肼屈嗪；抗抑郁药，例如，丙米嗪，阿米替林和多塞平；anti-conversants，例如，苯妥英；抗组胺药，例如苯海拉明，chlorphenirimine和异丙嗪；抗生素/抗菌剂，例如，庆大霉素，环丙沙星，和头孢西丁；抗真菌剂，例如，咪康唑，特康唑，益康唑，异康唑，butaconazole，克霉唑，伊曲康唑，制霉菌素，naftifine和两性霉素B；杀寄生虫药，激素，激素拮抗剂，免疫调节剂，神经递质拮抗剂，抗青光眼药，维生素，麻醉剂和显象剂。

如上提及，阳离子脂质可以用在治疗基因或寡核苷酸的递送中，其意欲在细胞中诱导或阻断一些蛋白质的产生。核酸是带负电荷的并且可以与带正电荷的本体结合从而形成SPLP，其适合于制剂和如上所述的核酸的细胞递送。

本发明的阳离子脂质的另一个临床应用是作为佐剂用于对动物和人的免疫。出于免疫目的，可以将蛋白质抗原，诸如白喉类毒素，霍乱毒素，寄生抗原，病毒抗原，免疫球蛋白，酶和组织相容性抗原结合到包含本发明的阳离子脂质的脂质体中或附着于其上。

包含本发明的阳离子脂质的脂质体作为疫苗的载体也是特别有用的，其将靶向适合的淋巴器官以刺激免疫应答。

包含本发明的阳离子脂质的脂质体还可以被用作载体，其将免疫抑制剂或免疫刺激剂选择性地递送到目标细胞。例如，使用本发明的脂质体，可以将用于抑制巨噬细胞活性的糖皮质激素和激活巨噬细胞的淋巴因子进行递送。

可以将包含本发明的阳离子脂质和包含靶分子的脂质体用于选择性调节许多生物活性。例如，结合具体抗原的脂质体可以用于刺激展示特异性结合抗原的表面抗体的B细胞增殖，因此诱导特异于所述抗原的免疫应答。作为另一个实例，在它们的表面上结合生长因子或淋巴因子的脂质体可以定向于刺激表达对于这些因子的适合受体的细胞。使用该方法，可以将刺激骨髓细胞的增殖作为治疗方案的部分(例如，癌症的治疗)。

可以将包含本发明的阳离子脂质的脂质体用于递送任何产品(例如，包括核酸的治疗剂，诊断用药，标记或其它化合物)到细胞或组织，包括哺乳动物中的细胞或组织中。

在某些实施方案中，理想的是使用特异于细胞类型或组织的靶向部分来靶向本发明的脂质体。使用多种靶向部分，诸如配体，细胞表面受体，糖蛋白，维生素(例如核黄素)和单克隆抗体靶向脂质体在以前已经进行了描述(见，例如，美国专利号4,957,773和4,603,044)。所述靶向部分可以包括完整的蛋白或其片段。

靶向机制通常需要靶向试剂以这样的方式定位在脂质体的表面上，从而使靶向部分能够与所述靶，例如，细胞表面受体相互作用。在一个实施方案中，所述脂质体被设计为将连接体部分在脂质体形成的时候结合到膜中。所述连接体部分必须具有被牢固包埋和锚定在膜中的亲脂性部分。其必须还具有在脂质体的水性表面上的可通过化学方法获得的亲水性部分。对所述亲水性部分进行选择从而在化学上适合于靶向试剂，从而使所述部分和试剂形成稳定的化学键。因此，连接体部分通常延伸出脂质体的表面，并且被进行构造以正确定位靶向试剂。在某些情形中，可能的是将靶向试剂直接连接于连接体部分，但是在许多情形中，其更适合于使用第三分子来充当“分子桥”。所述桥连接连接体部分和离开脂质体表面的靶向试剂，由此使靶向试剂可自由地获得与细胞靶的相互作用。

可以使用偶联靶向试剂的标准方法。例如，可以使用磷脂酰乙醇胺，其可以被激活从而连接靶向试剂，或使用衍生化的亲脂性化合物，诸如脂质-衍生的博来霉素。使用，例如，结合蛋白质A的脂质体可以构建抗体-靶向的脂质体(见，Renneisen，et al.，J.Bio.Chem.，265：16337-16342(1990)I：和Leonetti，et al.，PNAS.USA，87：2448-2451(1990))。靶向部分的实例还可以包括，特异于细胞组分的其它蛋白质，包括与赘生物或肿瘤相关的抗原。可以通过共价键来将用作靶向部分的蛋白质连接于脂质体。见，Heath，Covalent Attachment of Proteins to Liposomes，149 Methods in Enzymology111-119(Academic Press，Inc.1987)。其它靶向方法包括生物素-抗生物素蛋白***。

在某些情形中，脂质体的诊断靶向可以随后用于治疗被靶向的细胞或组织。例如，当毒素与被靶向的脂质体偶联时，所述毒素可以接着有效破坏被靶向的细胞，诸如肿瘤细胞。

C.将脂质体用作诊断用药

可以用标志物对使用本发明的阳离子脂质制备的药物递送组合物，例如脂质体进行标记，所述标志物将促进各种疾病状态的诊断成像，所述疾病包括肿瘤，发炎的关节，病变等。典型地，尽管还可以使用荧光标记，这些标记将是放射性标志物。使用γ-辐射放射性同位素是特别有利的，因为它们可以容易地在井式闪烁计数器中进行计数，在计数前不需要组织匀浆并且可以用γ照相机成像。

典型地使用γ-或正子辐射的放射性同位素，诸如作为γ-辐射的⁹⁹Tc，²⁴Na，⁵¹Cr，⁵⁹Fe，⁶⁷Ga，⁸⁶Rb，¹¹¹In，¹²⁵I，和¹⁹⁵Pt；诸如作为正子辐射的⁶⁸Ga，⁸²Rb，²²Na，⁷⁵Br，¹²²I和¹⁸F。出于体内诊断的目的，还可以用顺磁同位素来标记脂质体，如通过使用磁共振成像(MRI)或电子自旋共振(ESR)来进行。见，例如，美国专利号4,728,575。

D.脂质体的加载

将常规药物加载到脂质体中的方法包括，例如，包封技术，加载到双层和跨膜电势加载方法。

在一个包封技术中，药物和脂质体组分溶解在有机溶剂中，其中所有的种类是可混合的并且被浓缩以干燥薄膜。接着，将缓冲液加入干燥的薄膜中并且形成药物被结合到小泡的壁中的脂质体。备选地，将所述药物置于缓冲液中并且加入仅有脂质成分的干燥的薄膜中。以这种方式，药物将被包封在脂质体的水性内部。用在形成脂质体中的缓冲液可以是任何生物相容性的缓冲溶液，例如等渗盐水，磷酸盐缓冲液，或其它低离子强度的缓冲液。通常，药物将以从约0.01ng/mL到约50mg/mL的量存在。接着将得到的脂质体如上所述任选地进行按大小排列，所述脂质体具有结合在水性内部或在膜中的药物。

跨膜电势加载方法已经详细描述在美国专利号4,885,172，5,059,421，和5,171,578中。简而言之，跨膜电势加载方法可以用于基本上任何常规药物，所述药物当溶解在适合的水性介质中时，可以以带电状态存在。优选地，所述药物将是相对亲脂性的从而将分配到脂质体膜中。跨膜电势穿过脂质体或蛋白质-脂质体复和体的双层产生，并且所述药物借助于跨膜电势被加载到脂质体中。跨膜电势通过穿过膜产生对于一个或多个带电种类(例如，Na⁺，K⁺和/或H⁺)的浓度梯度来产生。该浓度梯度通过产生具有不同的内部和外部介质的脂质体来产生并且具有相关的质子梯度。药物累积可以接着以通过Henderson-Hasselbach方程预期的方式发生。

可以按照标准技术来将本发明的脂质体组合物施用于受试者。优选地，脂质体组合物的药物组合物经肠胃外，即腹膜内地，静脉内地，皮下地或肌内地进行施用。更优选地，所述药物组合物通过推注注射来静脉内地进行施用。用在本发明中的适合的制剂见于Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.(1985)。可以将药物组合物用于，例如诊断多种疾病，或治疗多种疾病状态(诸如炎症，感染(病毒性和细菌性感染)，赘生物，癌症等)。

优选地，将药物组合物进行静脉内施用。因此，本发明提供用于静脉内施用的组合物，其包括脂质体悬浮在可接受的载体，优选地水性载体中的溶液。可以使用多种水性载体，例如，水，缓冲的水，0.9％的等渗盐水，等。这些组合物可以通过常规，众所周知的灭菌技术进行灭菌，或可以过滤除菌。可以将得到的水溶液原样包装或进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的制剂在施用前与灭菌的水溶液进行组合。根据大致生理条件所要求，所述组合物可以包含药用辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂，张力调节剂，湿润剂等，例如，乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，脱水山梨醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯等。

根据选定的施用的具体模式，在药物制剂中的脂质体组合物的浓度可以在广泛范围内变化，即，从少于约0.05重量％，通常在或至少约2-5重量％到多至10到30重量％并将主要根据流体体积，粘度等进行选择。对于诊断，施用的组合物的量将取决于所用的具体标记(即，放射性标记，荧光标记，等)，被诊断的疾病状态和临床医师的判断，但是将通常在每公斤体重约1和约5mg之间。

实施例

本发明将通过下列实施例的方式更详细地进行描述。下列实施例是出于举例说明的目的进行提供，并且不意欲以任何方式限制本发明。那些本领域技术人员将容易地认识到可以被改变或修改从而产生基本上相同的结果的多种非关键参数。

实施例1：材料和方法

材料：DPPS，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)。TNS获自Sigma-Aldrich Canada(Oakville，ON)。RiboGreen获自Molecular Probes(Eugene，OR)。甲磺酸烷基酯购自Nu-Chek Prep，Inc.(Elysian，MN，USA)。siRNA(抗萤光素酶和错配的对照)购自Dharmacon(Lafayette，CO，USA)。所述抗萤光素酶有义序列是5′-G.A.U.U.A.U.G.U.C.C.G.G.U.U.A.U.G.U.A.U.U-3′。所述抗萤光素酶反义序列是5′-U.A.C.A.U.A.A.C.C.G.G.A.C.A.U.A.A.U.C.U.U-3′。所有其它的化学品购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON，Canada)。

DSDMA和DODMA的合成：使用各个烷基溴化物，用衍生自DOTMA前体的方法来合成DSDMA和DODMA(Felgner et al，PNASUSA，84，7413-7417(1987))。将3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(714mg，6mmol)和95％氢化钠(NaH，1.26g，50mmol)在苯(30mL)中，在氩气下搅拌30分钟。将适合的(油基或硬脂基)烷基溴化物(5.0g，15mmol)加入，并在氩气下回流所述反应物达18小时。接着，在冰浴上冷却所述反应混合物，同时通过缓慢加入乙醇进行猝灭。在用另外的150mL苯进行稀释后，用蒸馏水(2×150mL)和盐水(150mL)来洗涤所述混合物，如果必要，使用乙醇(～20mL)来协助相分离。通过硫酸镁来干燥所述有机相并将其进行蒸发。在硅胶(Kiesel Gel 60)柱上来纯化所述粗制产物，并用包含0-5％的甲醇的氯仿来进行洗脱。通过薄层层析(TLC)(硅胶，氯仿/甲醇9∶1v/v，用钼酸盐进行观察)来分析柱级分，并将包含纯化产物(R_f＝0.5)的级分合并，进行浓缩。通过在活性炭(1g)的乙醇(75mL)的混悬液中于60℃搅拌30分钟来对所述产物进行脱色。将所述炭通过Celite过滤来去除，并将乙醇溶液浓缩来典型地产生2.4g(65％)的纯的产物。¹H-NMR(DSDMA)：δ_H3.65-3.32(m，7H，OCH，3x OCH₂)，2.45-2.31(m，2H，NCH₂)，2.27(s，6H，2xNCH₃)，1.61-1.45(m，4H，OCH₂ CH ₂ )，1.40-1.17(m，60H，H_硬脂基)，0.86(t，6H，CH₂CH ₃ ).¹H-NMR(DODMA)：δ_H 5.4-5.27(m，4H，2x CH＝CH)，3.65-3.35(m，7H，OCH，3x OCH₂)，2.47-2.33(m，2H，NCH₂)，2.28(s，6H，2x NCH₃)，2.06-1.94(m，8H，4xCH ₂ CH＝CH)，1.61-1.50(m，4H，OCH₂CH ₂ )，1.38-1.20(m，48H，H_油基)，0.88(t，6H，CH₂CH ₃ )。

DLinDMA和DLenDMA的合成：所述DLinDMA和DLenDMA的合成类似于DSDMA和DODMA，但是使用甲磺酸烷基酯取代烷基溴化物。一般合成方法与DSDMA和DODMA的合成方法相同，以相同摩尔比率用甲磺酸烷基酯来取代溴化物。略去活性炭脱色步骤，因为这里的产物包含共轭的双键并且预期活性炭吸附包含这些特征的化合物。产率典型地是2.0g(55％)。¹H-NMR(DLinDMA)：δ_H 5.43-5.27(m，8H，4xCH＝CH)，3.65-3.35(m，7H，OCH，3xOCH₂)，2.77(t，4H，CH₂CH ₂ CH＝)，2.47-2.33(m，2H，NCH₂)，2.28(s，6H，2x NCH₃)，2.05(q，8H，4xCH₂CH ₂ CH＝)，1.62-1.50(m，4H，OCH₂CH ₂ )，1.40-1.22(m，32H，H_亚油基)，0.89(t，6H，CH₂CH ₃ ).¹H-NMR(DLenDMA)：δ_H 5.44-5.27(m，8H，4x CH＝CH)，3.62-3.48(m，7H，OCH，3x OCH₂)，2.80(t，4H，＝CHCH ₂ CH＝)，2.43-2.32(m，2H，NCH₂)，2.26(s，6H，2xNCH₃)，2.12-1.99(m，8H，4xCH_2/3CH ₂ CH＝)，1.61-1.51(m，4H，OCH₂CH ₂ )，1.40-1.22(m，20H，H_亚麻基)，0.98(t，6H，CH₂CH ₃ )。

PEG₂₀₀₀-C-DMA的合成：如下合成PEG-C-DMA。简而言之，通过首先用肉豆蔻酰溴来烷化3-烯丙氧基丙烷-1，2-二醇的羟基基团来制备C₁₄脂质锚。随后，通过钯催化来去除烯丙基基团，得到C₁₄羟基脂质。通过甲酰化作用和氨基化作用来将羟基基团转化为伯胺，以产生1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺，所述脂质锚。通过用过量的氯甲酸三氯甲酯来处理单甲氧基聚(乙二醇)(平均分子量2000)来形成氯甲酸酯以实现与PEG的缀合。添加C₁₄胺脂质锚并过夜搅拌来产生PEG₂₀₀₀-C-DMA，其在本文被称为PEG-C-DMA。

SNALP制备：通过乙醇稀释方法，使用自发小泡形成来制备脂质组成为DSPC∶Chol：PEG-C-DMA∶阳离子脂质(20∶48∶2∶30摩尔百分比)的SNALP[Jeffs et al.，Pharm.Res.In Press(2005)]。使用交叉流超滤药筒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)来针对100mL的PBS(20倍洗涤体积)对所述样品进行渗滤，并将其通过Acrodisc 0.2μm Posidyne滤器(Pall Corp.，Ann Arbor，MI)进行过滤除菌。使用RiboGreen测定和siRNA标准曲线来确定最终样品的siRNA浓度。使用Malvern InstrumentsZetasizer 3000HSA(Malvern，UK)来确定颗粒大小和多分散性。使用RiboGreen测定法，在存在和不存在Triton X-100的情况下比较荧光来确定核酸包封。使用具有λ_ex＝500nm，λ_em＝525nm的Varian Eclipse分光荧光计(Varian Inc)来测量RiboGreen荧光。

TNS测定法：将20μM的SNALP脂质和6μM的TNS在荧光比色杯中混合于pH在4.5-9.5变化的2mL的20mM磷酸钠，25mM柠檬酸盐，20mM的乙酸铵和150mM的NaCl中。使用设置为λ_ex＝322nm，λ_em＝431nm的Varian Eclipse分光荧光计(Varian Inc)，在每个pH上来测量荧光。接着，在不同的pH，将每种***的荧光标准化为在pH 4.5处的值。pK_a值是其中50％存在的分子带电的点。通过假设最少的荧光代表0电荷，而最多的荧光代表100％的电荷，可以通过测量在最少和最多电荷的值之间的恰好一半的点的pH来估计pKa。

³¹P核磁共振光谱学：制备以1∶1的摩尔比率包含DPPS和阳离子脂质的多层小泡(MLV)。通过干燥来自氯仿溶液的脂质，将其转移到10mm的NMR管中，并在1.5mL的10mM柠檬酸钠，pH 4中水合来完成此。获得对应于1000扫描的自由感应衰减(FIDs)，其具有脉冲间的间隔为1s的3.0μs，60o脉冲，谱宽为25000Hz。将门控双水平质子去偶合用于确保用最少的样品加热进行的足够的去偶合。在傅里叶变换之前，将对应于50Hz的谱线加宽的指数倍增应用于FIDs。使用Bruker B-VT1000可变温度装置来调节样品温度(+/-1℃)。化学位移参考作为外标准的85％的磷酸。

体外转染：将细胞培养在包含10％胎牛血清(FBS)(CanSera)和0.25mg/mL G418(Invitrogen)的MEM(Invitrogen)中。将Neuro2A-G细胞(Neuro2A细胞被稳定地转染以表达萤光素酶[R.E.Kingston.in CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2，pp.9.1.4-9.1.9，John Wiley & Sons，Inc.(1997)])以4×10⁴细胞/孔的浓度接种于24孔板中，并将其培养过夜。以0.0625-1.0μg/mL的核酸的剂量用SNALP来处理细胞(AntiLuc活性或Mismatch对照)并将其在37℃和5％CO₂温育48小时。接着，用PBS来洗涤细胞并用包含0.1％Triton X-100的200μL的250mM磷酸钠来进行裂解。使用萤光素酶试剂(Promega)和标准的萤光素酶蛋白质(Roche)来测定每个孔的萤光素酶活性。使用Berthold MicroLumatPlus LB96V板发光计来测量每个的发光。接着，使用Micro BCA测定试剂盒(Pierce)来对于蛋白质的量将得到的萤光素酶活性进行标准化。接着，对于每个***确定相对于对照的萤光素酶下降。

细胞吸收：制备SNALP，其结合不可交换的氚标记的脂质胆甾烯基十六烷醚(3H-CHE)(11.1μCi/mol总脂质)[Bally et al.，in LiposomeTechnology，Vol.III，pp.27-41，CRC Press(1993)]。将Neuro2A细胞(ATCC，VA，USA)以1.6×105细胞/孔接种在12孔板的基本培养基中。次日，去除培养基并用包含放射性标记的0.5μg/mL核酸的SNALP的培养基进行取代。24小时后，去除培养基和未结合的SNALP，将贴壁细胞用PBS轻柔洗涤4次，接着用600μL的裂解缓冲液(具有0.1％Triton X-100的250mM磷酸盐)进行裂解。将得到的细胞裂解物(500μL))加入包含5mL Picofluor 40(Perkin Elmer)的玻璃闪烁瓶中，并使用Beckman LS6500闪烁计数器(Beckman Instruments)来测定³H-CHE。使用Micro BCA测定法(Pierce)来测定细胞裂解物的蛋白质含量。将吸收表示为应用到细胞的活性的总量/mg细胞蛋白质的百分比。

包含Cy3-标记的siRNA的SNALP的吸收：如前所述来配制SNALP，但是使用用荧光团Cy3(Cy3-siRNA是Sirna Therapeutics Inc，Boulder，CO的赠品)标记的siRNA。如所述来确定包封，siRNA浓度和颗粒大小。

对于吸收研究，将8×10⁴Neuro2A-G细胞过夜培养在4孔室载玻片(BDFalcon，Mississauga，ON)的包含0.25mg/mL G418的MEM中。将包含Cy3-siRNA的DSDMA，DODMA，DLinDMA，和DLenDMA SNALP，以及裸Cy3-siRNA和未标记的DSDMA SNALP以0.5μg/mL的siRNA置于细胞上。在用转染的培养基温育4小时后，用PBS洗涤细胞，接着用包含G418的MEM进行洗涤，并最终用PBS再一次洗涤。接着，将所述细胞于室温，固定在4％的低聚甲醛的PBS溶液中达10分钟。用PBS洗涤所述细胞，并用在PBS中的300nM DAPI(Molecular Probes，Eugene，OR)来染色5分钟。用PBS洗涤所述细胞，应用封固剂(mounting media)ProLongGold Antifade试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)并加上盖玻片。使用荧光能力有所改进的Olympus BX60显微镜来观察细胞。使用罗丹明立方形装置(Microgen Optics，Redding，CA)来观察在细胞中的Cy3荧光，并使用DAPI立方形装置(Carsen Group，Markham，ON)来观察DAPI荧光。使用Olympus DP70照相***来捕获数字图片。当检查Cy3荧光时，以1/4秒的曝光时间拍摄细胞的图片，当检查DAPI荧光时，以1/80秒的曝光时间来拍摄细胞的图片。

实施例2：血清稳定性的测定

按照上述指出的技术配制的脂质/核酸颗粒可以通过各种方法来进行血清稳定性的测定。

例如，在典型的DNase 1消化中，将被包封在目标颗粒中的1μgDNA在100μl总体积的5mM HEPES，150mM NaCl，10.0mM MgCl₂pH7.4中进行温育。用100或10U的DNase I(Gibco-BRL)来处理被Dnase处理的样品。可以将1.0％的Triton X-100加入对照实验中以确保脂质制剂不直接使所述酶失活。将样品在37℃温育30分钟，然后通过加入500μL的DNAZOL，随后加入1.0mL的乙醇来分离DNA。将样品在台式离心机中以15,000rpm离心30分钟。倾去上清液并用80％的乙醇洗涤得到的DNA沉淀两次并进行干燥。将该DNA重悬于30μL的TE缓冲液中。将20μL的该样品上载到1.0％的琼脂糖凝胶中并在TAE缓冲液中进行电泳。

在典型的血清测定中，将游离的，被包封的，或被包封的+0.5％TritonX100形式的50μgDNA等分到1.5mL Eppendorf管中。向所述管中加入45μl的正常鼠或人血清，dH2O(使终体积为50μL)。用石蜡膜密封所述管并在37℃进行温育。将没有用核酸酶(标准)消化的游离的，被包封的，或被包封的+0.5％Triton X100的样品在Eppendorf管中在液氮中冷冻并贮存于-20℃。在各个时间点取出等分试样，将其加入包含蛋白酶K(133μg/mL)的GDP缓冲液中，立即在液氮中冷冻以停止反应。一旦收集了所有的时间点，在水浴中以55℃温育所述样品从而激活蛋白酶K来使任何残余的核酸外切酶变性。将被蛋白酶K消化的样品施加到聚丙烯酰胺凝胶中以评价核酸外切酶降解的水平。

上述揭示的颗粒通过甚至在存在100U DNase 1时，显示这些处理的结果是少于5％和优选地不可检测的量的DNA降解(部分或总的)，来证明血清稳定性。其有利地与游离DNA，和质粒/脂质复合体(诸如DOTMA或DODAC:DOPE复合体)比较，所述游离DNA被彻底降解，其中DNA在这些处理后被基本降解(即，大于20％，通常80％)

实施例3：1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚 麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)的合成

将3-(二甲基氨基)-1，2-丙二醇(714mg，6mmol)和95％氢化钠(NaH，1.26g，50mmol)在苯(30mL)中，在氩气下搅拌30分钟。将甲磺酸亚油酯(5.0g，15mmol)加入，并在氮气下回流所述反应物达3小时。接着，在冰浴上冷却所述反应混合物，同时通过缓慢加入乙醇进行猝灭。在用另外的150mL苯进行稀释后，用蒸馏水(2×150mL)和盐水(150mL)来洗涤所述混合物。通过硫酸镁来干燥所述有机相并将其进行蒸发以得到粗制产物。在硅胶(Kiesel Gel 60)柱上来纯化所述粗制产物，并用0-5％甲醇的氯仿溶液来进行洗脱。通过薄层层析(TLC)(硅胶，氯仿/甲醇9∶1v/v，用钼酸盐浸渍(dip)进行观察)来分析柱级分，并将包含纯化产物(R_f＝0.5)的级分合并，进行浓缩。

用第二柱来实现DLinDMA的脱色和进一步的纯化，这次用20-50％的在己烷中的乙酸乙酯来洗脱。通过TLC(硅胶，乙酸乙酯/己烷1∶1v/v，用钼酸盐来观察)来分析柱的级分，并将包含纯化产物的级分(R_f＝0.4)进行合并和浓缩。本文所述的方法典型地产生2.2g(60％)的纯化产物。

对于DLenDMA的合成，用甲磺酸亚麻酯来取代甲磺酸亚油酯，并如上所述来进行剩余的合成，脱色和纯化反应。

实施例4：不饱和脂质的制剂特点是均一和可再现

该实施例提出本文所述的SNALP制剂的物理特征。如所述来制备包含各种阳离子脂质的SNALP并评估包封的RNA和颗粒大小(下面表1)。形成制剂的三种不饱和阳离子脂质大致是相同的大小(132-140nm)。所有制剂的多分散性都很低，显示窄的颗粒大小分布。在最终颗粒中的RNA包封是全部的84-85％。使用饱和的脂质DSDMA来将siRNA包封在SNALP中的尝试得到具有67％包封的稍大些颗粒(180nm)的形成。

使用RiboGreen荧光测定法来测量相对于存在的总核酸的被包封的核酸的量，来确定百分比包封。使用Malvern Zetasizer来测量颗粒直径和多分散性。值是3次独立实验的平均值，误差是标准偏差。

阳离子脂质	％包封	直径(nm)	多分散性
				DSDMA	67±3	182±11	0.15±0.03
DODMA	84±1	137±4	0.12±0.01
				DLinDMA	84±3	140±6	0.11±0.02
DLenDMA	85±1	132±7	0.13±0.03

实施例5：饱和影响阳离子脂质的pKa

如上面实施例1所述来确定阳离子脂质的表观pK_a。我们确定脂质pK_a使用2-(p-甲苯氨基)萘-6-磺酸，膜电势的带负电荷的指示物(Bailey和Cullis，Biochemistry 3312573-80(1994))。TNS通过静电吸引到带正电荷的膜上。随后对于脂质膜的吸附导致TNS的瞬时(immediate)环境变得更具亲脂性，去除了水分子，否则所述水分子使TNS荧光猝灭。由于TNS更容易被带正电荷的膜所吸附，TNS荧光是正的膜表面电荷的指示物。通过在存在TNS的情况下改变局部pH来确定每种SNALP制剂的表面pK_a值。在图5中，可以观察到包含不饱和脂质的制剂具有相似的pK_a值(6.7-7.0)，显示所述颗粒在生理pH是电荷中性的，但是在内体pH上带正电荷。然而，饱和的脂质DSDMA，产生具有约7.6的更高的pK_a的颗粒。预期包含DSDMA的SNALP颗粒在生理pH上带电。

在图5中显示的结果证实脂质pK_a与分别显示7.6，7.0，6.7，和6.7的pK_a的DSDMA，DODMA，DLinDMA，和DLenDMA的饱和程度相关。

实施例6：

双层到六边形相变温度随烷基链饱和增加

使用³¹P-NMR来研究关于相变温度的饱和显著性。其他人已经使用该技术检查了在阴离子磷脂/阳离子脂质混合物中的脂质多晶现象，由在磷脂中的磷酸基团的存在所促进(Epand et al.，Chem.Phys.Lipids 5775-80(1991))；Felgner et al.，PNAS USA 847413-7417(1987))。NMR示踪的形状根据脂质的排列而变化。双层结构产生具有低场肩(field shoulder)的高场峰值。然而，在相变温度(Tc)上，脂质采用融合的H_II相，由具有出现在低场侧的峰值的反向模式所指示。³¹P-NMR研究在前面显示了在某些温度(相变温度，Tc)上，脂质可以采用融合的H_II相[Epand et al.，Chem.Phys.Lipids5775-80(1991)；Felgner et al.，PNAS USA.847413-7417(1987)]。双层(Lα相)转变为H_II相所需的更高的温度指示更少的融合的双层。通过确定转化发生的温度，可以确定脂质形成H_II相的相对容易性，它们的“融合性”。

使用以1∶1摩尔比率存在的阴离子脂质DPPS和每种阳离子脂质来制备MLV。在不同的温度上测量MLV的³¹P-NNM光谱。包含饱和的脂质DSDMA的MLV甚至在高达50℃的温度上没有显示采用H_II相的可测量的迹象。然而，包含DODMA(每条烷基链1个双键)的MLV显示介于30和35℃之间的相变温度。第二双键的存在(DLinDMA)进一步减少了T_c到介于20和25℃之间，同时第三双键的结合(DLenDMA)具有极少的进一步的效果。如在图6A中所见，对于DSDMA/DPPS***，双层模式发生在30到50℃的温度(具有低场肩的高场峰值)。

因此，DSDMA显示具有组合阴离子脂质形成H_II相的非常低的能力。具有单个双键的阳离子脂质DODMA，具有介于30和35℃之间的相变温度(图6B)。DLinDMA(2个双键)和DLenDMA(3个双键)***显示在某种程度上类似的介于20和25℃之间的转变温度(图6C和6D)。应该注意的是，在示踪6C和6D中观察到的中心，各向同性的峰值不表示相变温度，而来自也存在于制剂中的小的磷脂小泡。从高场峰值/低场肩(双层相，更低的温度)到低场峰值/高场肩(反向六边形相，更高的温度)的谱线形状不对称中的转变是相变的指示。这特别显示在示踪6B(DODMA)中。基于这些结果，我们推测包含所述阳离子脂质的SNALPs的融合性将以下列顺序增加：DSDMA＜＜DODMA＜DLinDMA≈DLenDMA，并且假设SNALPs关于核酸递送的有效性将显示类似的等级(DSDMA＜＜DODMA＜DLinDMA≈DLenDMA)。

实施例7：在递送包封在包含阳离子脂质的SPLP中的siRNA后的基因表 达的沉默

该实施例描述了在用SNALP体外转染Neuro2A细胞后，比较核酸的表达的实验，所述SNALP包括：(1)DODAC，DODMA，或DLinDMA；(2)PEG-C-DMA；和(3)针对包封在SNALP中的萤光素酶的siRNA双链体(即，这样的siRNA，其包含下列序列：GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU并靶向互补于：GATTATGTCCGGTTATGTATT的DNA序列)。用在CMV启动子控制下编码萤光素酶的质粒(PLO55)来稳定转染Neuro2A细胞。接着，用SNALP转染稳定转染的细胞，所述SNALP包含15，20，25，30，35，或40％的DODAC，DODMA，或DLinDMA；2％PEG-C-DMA，和针对包封在SNALP中的萤光素酶的siRNA双链体。在用SNALP转染后48小时测量萤光素酶蛋白质的表达。与包含DODAC或DODMA的SNALP比较，包含30％DLinDMA的SNALP在减少Neuro2A细胞的萤光素酶表达中更加有效。这些结果显示在图6中。

如在图6中所显示，使用递送直接针对萤光素酶基因的siRNA的SNALP进行的萤光素酶基因沉默实验的结果支持³¹P-NMR数据。用包含四种阳离子脂质(即，DSDMA.DODMA，DLinDMA，和DLenDMA)的每种的SNALP来处理细胞。48小时后，通过NMR显示弱融合性的包含DSDMA的SNALP对于萤光素酶基因表达没有影响。与此相反，更易受H_II相形成影响的不饱和的脂质制剂，导致萤光素酶基因的显著的沉默。此外，沉默的程度对应于每种阳离子脂质形成融合的H_II相的倾向。DLinDMA，具有最低表观相变温度的最具融合性的脂质，当结合在SNALP中时，产生最大的击倒，其中萤光素酶表达仅是未处理对照的21％。随后是DLenDMA制剂(32％)和DODMA(54％)。如所观察到的在击倒效率和阳离子脂质的H_II相形成能力之间的紧密的相关性提示两种参数是关联的。

实施例8：包含不饱和的阳离子脂质的SNALP显示增加的基因沉默活性

评估了包含四种阳离子脂质(即，DSDMA，DODMA，DLinDMA，和DLenDMA)的每种的SNALP在稳定转染的Neuro2A细胞中影响基因沉默的能力。用包含抗-萤光素酶的siRNA的SNALP来处理被稳定转染以表达萤光素酶的Neuro2A细胞达48小时。通过比较在这些细胞中残余的萤光素酶活性和在用包含错配的siRNA的对照SNALP处理的细胞中残余的萤光素酶活性来评估基因沉默的效率。

如假设，发现击倒效率对应于脂质形成融合性的反向六边形相的能力。包含饱和的脂质DSDMA的制剂证实没有活性。如在脂质烷基链中的不饱和增加，RNA干扰的能力也增加，其中DLinDMA颗粒在基因表达中产生80％的击倒。³¹P-NMR确定DLinDMA在所述系列中具有最低的相变温度并因此，是最具融合性的脂质。包含DLenDMA，最不饱和的脂质的颗粒，与包含DLinDMA的那些相比，有效性稍低。通过t检验发现所有的结果具有显著性(在0.5μg/mL的siRNA浓度上P＜0.05，在1.0μg/mL的siRNA浓度上，P＜0.01)。误差条表示标准偏差，n＝3。将结果显示在图7中。

实施例9：各种SPLP制剂对器官的体内转染

该实施例描述了这样的实验，所述实验证实可以使用包含15％DLinDMA的SPLP来体内转染器官。将包封质粒的SPLP施用于具有Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠，所述质粒在CMV启动子的控制下编码萤光素酶。所述SPLP具有下列制剂：

	样品描述
		A	SPLP-PEG2000-C-DMA(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG2000-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)
B	SPLP-PEG2000DlinDMA(CHOL∶DSPC∶DlinDMA∶PEG2000-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)
		C	SPLP-PEG750-C-DMA/DODMA(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG750-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)
D	SPLP-PEG750-C-DMA/DLinDMA(CHOL∶DSPC∶DlinDMA∶PEG750-C-DMA 55∶20∶15∶10mol％)0.41mg/ml
		E	SPLP-High PEG750-C-DMA(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG750-C-DMA 50∶20∶15∶15mol％)
F	SPLP-High PEG750-C-DMA(CHOL∶DSPC∶DlinDMA∶PEG750-C-DMA 50∶20∶15∶15mol％)
		G	SPLP-DODAC(CHOL∶DSPC∶DODMA∶PEG2000-C-DMA∶DODAC 45∶20∶15∶10∶10mol％)0.35mg/ml

在SPLP静脉内施用后48小时，在肝、肺、脾、心脏和肿瘤中评估萤光素酶基因表达。将所述结果显示于图8中。

实施例10：用另外的SPLP制剂体内转染肿瘤

该实施例描述了这样的实验，其显示了用SPLP对器官进行体内转染，所述SPLP包含DLinDMA或DODMA和不同比例(15％，10％，5％，或2.5％)的PEG-C-DMA。将包封编码萤光素酶的质粒的SPLP施用于具有Neuro2A肿瘤的雄性A/J小鼠中。所述SPLP具有下列制剂：

	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DXDMA
		A	20∶50∶15∶15(DODMA)
B	20∶55∶10∶15(DODMA)
		C	20∶60∶5∶15(DODMA)
D	20∶62.5∶2.5∶15(DODMA)
		E	20∶55∶10∶15(DLinDMA)
F	20∶60∶5∶15(DLinDMA)
		G	20∶62.5∶2.5∶15(DLinDMA)

在静脉内施用SPLP后48小时，在肿瘤中评估萤光素酶基因表达。将结果显示于图9中。

实施例11：包含PEG-C-DMA的脂质小泡的血液清除率

该实施例描述了这样的实验，进行所述实验来评估包含不同百分比的PEG-C-DMA的脂质小泡的血液清除率。将单一静脉内剂量的³H-CHE-标记的SPLP，SNALP，或空载小泡施用于雄性A/J小鼠。SPLP包含阳离子脂质DODMA，SNALP包含阳离子脂质DLinDMA。所述脂质小泡具有下列制剂：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶阳离子脂质)
			A	空的小泡	20∶48∶2∶30
B	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30
			C	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶55∶5∶20
D	SPLP(15mol％PEG-C-DMA)	20∶50∶15∶15
			E	SPLP(10mol％PEG-C-DMA)	20∶55∶10∶15
F	SPLP(5mol％PEG-C-DMA)	20∶60∶5∶15

在³H-CHE-标记的SPLP，SNALP，或空的小泡施用后1，2，4和24小时后，确定在小鼠的血浆中残余的脂质小泡的注射剂量的百分比。将所述结果显示于图10中。

实施例12：包含PEG-C-DMA的脂质小泡的生物分布

该实施例描述了这样的实验，进行所述实验来评估包含不同百分比的PEG-C-DMA的脂质小泡的生物分布。将单一静脉内剂量的³H-CHE-标记的SPLP，SNALP，或空的小泡施用于具有Neuro 2A肿瘤的雄性A/J小鼠。SPLP包含阳离子脂质DODMA，SNALP包含阳离子脂质DLinDMA。所述脂质小泡具有下列制剂：

组		Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶阳离子脂质)
			A	空的小泡	20∶48∶2∶30
B	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30
			C	SNALP(DlinDMA，PEG-C-DMA)	20∶55∶5∶20
D	SPLP(15mol％PEG-C-DMA)	20∶50∶15∶15
			E	SPLP(10mol％PEG-C-DMA)	20∶55∶10∶15
F	SPLP(5mol％PEG-C-DMA)	20∶60∶5∶15

在³H-CHE-标记的小泡施用后48小时，在小鼠的肝、脾、肺和肿瘤中评估脂质小泡的注射剂量的百分比。将所述结果显示于图11中。

实施例13：在远端肿瘤中使基因表达沉默

该实施例描述了这样的实验，所示实验显示在施用SNALP后，在远端肿瘤中的基因沉默，所述SNALP包括DLinDMA并包封抗-萤光素酶siRNA序列。

用质粒稳定转染Neuro 2A细胞来产生Neuro 2A-G细胞，所述质粒在CMV启动子(pLO55)的控制下编码萤光素酶。用Neuro2A-G细胞来接种雄性A/J小鼠。将包封抗-萤光素酶siRNA序列(即，siRNA包含下列序列：GAUUAUGUCCGGUUAUGUAUU并靶向互补于GATTATGTCCGGTTATGTATT的DNA序列)的SNALP静脉内施用于具有Neuro2A-G肿瘤的A/J小鼠。所述SNALP制剂如下：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DMA∶DLinDMA)
			A	抗萤光素酶SNALP	20∶48∶2∶30
B	对照(反向序列)SNALP	20∶48∶2∶30
			C	抗萤光素酶SNALP	20∶55∶5∶20
D	对照(反向序列)SNALP	20∶55∶5∶20
			E	抗萤光素酶SNALP	20∶55∶10∶15
F	对照(反向序列)SNALP	20∶55∶10∶15

在施用SNALP后48小时来测量萤光素酶基因表达，所述SNALP包含DLinDMA并包封抗-萤光素酶siRNA序列。将结果显示在图12中。

实施例14：在Neuro2A-G肿瘤细胞中的体外基因表达的沉默

该实施例描述了这样的实验，所述实验显示在接触如上面实施例3中所述的SNALP后，在哺乳动物细胞中的基因沉默，所述SNALP包括DLinDMA并且包封抗萤光素酶siRNA序列。用如上面的实施例3中所述的编码萤光素酶的质粒稳定转染Neuro 2A细胞以产生Neuro 2A-G细胞。所述Neuro 2A-G细胞与SNALP制剂接触达24或48小时。所述SNALP制剂包含PEG-C-DLA(C₁₂)或PEG-C-DMA(C₁₄)并且如下：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DAA∶DLinDMA)
			A	SNALP(PEG-C-DLA)	20∶48∶2∶30
B	SNALP(PEG-C-DLA)	20∶45∶5∶30
			C	SNALP(PEG-C-DLA)	20∶40∶10∶30
D	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30

在用包封抗-萤光素酶的siRNA序列的SNALP接触Neuro 2A-G细胞后24或48小时，测量萤光素酶基因表达。将结果显示于图13中。

实施例15：在Neuro2A-G肿瘤细胞中的体外基因表达的沉默

该实施例描述了这样的实验，所述实验显示在接触如上面实施例3中所述的SNALP后，在哺乳动物细胞中的基因沉默，所述SNALP包括DLinDMA并且包封抗萤光素酶siRNA序列。用如上面的实施例3中所述的编码萤光素酶的质粒稳定转染Neuro 2A细胞以产生Neuro 2A-G细胞。在存在和不存在氯喹的情况下，Neuro 2A-G细胞接触SNALP制剂达48小时。所述SNALP制剂包含不同百分比的PEG-C-DMA(C₁₄)和DODMA或DLinDMA。所述制剂如下：

组	处理	Mol％(DSPC∶Chol∶PEG-C-DAA∶DLinDMA)
			A	PBS	-
B	裸siRNA	-
			C	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶40∶10∶30
D	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶46∶4∶30
			E	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶48∶2∶30
F	SNALP(PEG-C-DMA)	20∶49∶1∶30

在用包封抗-萤光素酶的siRNA序列的SNALP接触Neuro 2A-G细胞后，测量萤光素酶基因表达达48小时。将结果显示于图14中。

实施例16：对于基因沉默效率，SNALP吸收不是比率限制因素(rate limiting)

用结合³H-标记的CHE的SNALP来测量细胞对制剂吸收的程度[Ballyet al.，inLiposome Technology，Vol.III，pp.27-41，CRC Press(1993)]。用包含3H-标记的CHE的SNALP来处理Neuro2A细胞达24小时。在测定³H-CHE前，洗涤所述细胞以去除未结合的SNALP。将吸收表示为应用到细胞的总活性的百分比。显示细胞的吸收随阳离子脂质饱和的增加而增加。误差条表示标准偏差，n＝3。将结果显示于图15中。

在将细胞暴露于SNALP制剂24小时后，漂洗细胞，将其进行裂解，并测定³H-CHE吸收(图15)。每个个体制剂的吸收独立于SNALP的浓度，其中DSDMA颗粒显示最大程度的吸收。观察到SNALP的吸收随饱和的减少而减少，所述DLenDMA制剂似乎特别在该方面是有限的。基于基因沉默的结果，发现其中DSDMA制剂的有效性是最低的，这些结果与我们的预期相反。它们提示细胞吸收没有限制SNALP的基因沉默能力，而是由与内体膜的融合事件介导的内体逃避在SNALP介导的核酸递送中具有重要作用。通过t-检验的分析发现所有的结果具有显著性(P＜0.05)，除了在0.10，0.50和1.00μg/mL浓度上的在DODMA和DLinDMA之间的差异。

使用荧光标记的SNALP进一步检查了吸收过程。用包含Cy3-标记的siRNA的制剂对Neuro2A-G细胞进行处理达4小时。在洗涤和固定后，用荧光标志物DAPI对细胞核进行了染色(蓝色)，以更精确地确定荧光标记的siRNA的定位(图6)。与³H-CHE吸收实验的结果一致，可以观察到DSDMA制剂在递送siRNA到细胞中去明显是最有效的。Cy3荧光(红色)在用包含DSDMA的SNALP处理的细胞中是最强的。此外，与放射性标记的吸收研究一致，如阳离子脂质的饱和程度增加，Cy3标记的siRNA的细胞吸收增加。此外，对于DLenDMA制剂，Cy3荧光非常微弱，显示弱吸收。用裸Cy3-标记的siRNA或未标记的SNALP处理阴性对照揭示没有细胞与Cy3荧光相关。

将用荧光团Cy3标记的SNALP应用到细胞并将其温育达4小时。在洗涤和固定后，如通过Cy3荧光所测量，荧光显微镜显示siRNA吸收与阳离子脂质饱和相关。用荧光团DAPI对细胞核进行染色。将未标记的SNALP和裸Cy3-siRNA用作阴性对照。

通过结合放射性标记的标志物研究SNALP吸收的效率进一步产生令人感兴趣的观察结果(图5)。可能预期的是，SNALP吸收将与阳离子脂质成分的pK_a相关；带更多正电荷的颗粒对于带负电荷的细胞表面具有更大的亲和性，随后具有更大的吸收。这种假设没有被该研究的结果所支持。具有最高pK_a(～7.6)的包含DSDMA的制剂明显最容易被吸收，随后是DODMA和DLinDMA制剂。令人好奇的是，当考虑到这些颗粒的pK_a是相同的，与DLinDMA制剂的吸收比较时，DLenDMA制剂的吸收是有限的。这显示是这些脂质的另一种特点，而不是pK_a，影响细胞吸收。这种发现不可能与颗粒稳定性的差异相关，因为时间进程研究证实DLenDMA制剂吸收的比率在24小时阶段中是不变的，提示所述制剂在组织培养基中是保持完整的。

这些结果提示，当使用包封的siRNA时，胞吞作用在体外基因沉默中不是比率限制因素。事实上，在细胞吸收中的差异似乎对制剂有效性具有显著更少的影响。DLinDMA和DLenDMA制剂，尽管在它们抑制基因表达的能力上相似，在它们被细胞吸收的程度上是非常不同的。相反地，DSDMA制剂几乎对于影响RNA干扰没有能力，但是明显非常容易地被细胞吸收。数据显示一旦siRNA已经被细胞内在化，对基因沉默的效率具有最大影响的事件发生。

简言之，我们已经合成了具有增加的饱和程度的阳离子脂质的同源系列物。我们显示，当用于包封和递送siRNA时，阳离子脂质饱和的程度影响脂质pKa，融合性，细胞吸收和基因沉默能力。明显地，更具融合性的阳离子脂质是RNAi的更有效的介质，尽管它们在介导细胞的内在化作用时，效率减少。这突出了核酸有效负载的内体释放的相对重要性。该知识可以用于提高其它脂质核酸递送***的功效，并且应该在设计对于小分子药物的递送***中被考虑到。

要理解的是上述描述意欲举例说明而不是限制性的。在阅读上述描述后，许多实施方案将对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。因此，本发明的范围应该不是参考上述描述来确定，而是应该参考后附的权利要求连同被授予这些权利要求的等价物的充分范围来确定。出于所有的目的，将所有的文章和参考文献，包括专利申请，专利和PCT出版物的内容和Genbank登记号并入本文作为参考。

Claims (44)

1.一种具有下列结构的式I的化合物：

其中：R¹和R²独立地选自由下列各项组成的组：H和C₁-C₃烷基；和R³和R⁴独立地选自由具有约10到约20个碳原子的烷基组成的组，其中R³和R⁴的至少一个包含至少两个不饱和位点。

2.按照权利要求1的化合物，其中R³和R⁴是相同的。

3.按照权利要求1的化合物，其中R³和R⁴都包含至少两个不饱和位点。

4.按照权利要求3的化合物，其中R³和R⁴独立地选自由下列各项组成的组：十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亚油基和二十碳二烯基。

5.按照权利要求3的化合物，其中R³和R⁴都是亚油基。

6.按照权利要求1的化合物，其中R³和R⁴都包含至少三个不饱和位点。

7.按照权利要求6的化合物，其中R³和R⁴独立地选自由下列各项组成的组：十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、亚麻基和二十碳三烯基。

8.一种脂质体，所述脂质体包含具有下列结构的式I的阳离子脂质：

其中：R¹和R²独立地选自由下列各项组成的组：H和C₁-C₃烷基；和

R³和R⁴独立地选自由具有约10到约20个碳原子的烷基组成的组，其中R³和R⁴的至少一个包含至少两个不饱和位点。

9.按照权利要求8的脂质体，其还包含非阳离子脂质。

10.按照权利要求9的脂质体，其中所述非阳离子脂质是选自由下列各项组成的组的成员：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，胆固醇及其混合物。

11.按照权利要求8的脂质体，其还包含PEG-脂质。

12.按照权利要求10的脂质体，其中所述PEG-脂质选自由下列各项组成的组：聚乙二醇-二酰基甘油(PEG-DAG)缀合物，聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物，PEG-神经酰胺，PEG-PE及其混合物。

13.按照权利要求8的脂质体，其还包含生物活性剂。

14.按照权利要求13的脂质体，其中所述生物活性剂是选自由下列各项组成的组的成员：抗肿瘤药、抗生素、免疫调节剂、消炎药和作用在中枢神经***上的药剂、多肽和核酸。

15.一种将生物活性剂递送到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求8的脂质体接触，其中所述生物活性剂被包封在所述脂质体中。

16.权利要求15的方法，其中所述在哺乳动物中。

17.一种核酸-脂质颗粒，其包括：

(a)核酸；

(b)式I的并具有下列结构的阳离子脂质：

其中：

R¹和R²独立地选自由下列各项组成的组：H和C₁-C₃烷基；和

R³和R⁴独立地选自由具有约10到约20个碳原子的烷基组成的组，其中R³和R⁴的至少一个包含至少两个不饱和位点。

(c)非阳离子脂质；和

(d)PEG-脂质缀合物。

18.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质选自由下列各项组成的组：：1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。

19.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质是DLinDMA。

20.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质是选自由下列各项组成的组的成员：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，卵磷脂酰胆碱(EPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)，16-O-单甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，胆固醇及其混合物。

21.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质是DSPC。

22.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述PEG-脂质是选自由下列各项组成的组的成员：聚乙二醇-二酰基甘油(PEG-DAG)缀合物，聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物，PEG-神经酰胺，PEG-PE及其混合物。

23.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述PEG-脂质是PEG-DAA缀合物。

24.按照权利要求23的核酸-脂质颗粒，其中所述PEG-DAA缀合物是PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)。

25.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其还包含固醇。

26.按照权利要求25的核酸-脂质颗粒，其中所述固醇是胆固醇。

27.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述核酸是选自由下列各项组成的组的成员：DNA，RNA，siRNA，质粒，反义寡核苷酸，核酶。

28.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述核酸编码目标治疗性产品。

29.按照权利要求28的核酸-脂质颗粒，其中所述目标治疗性产物是选自由下列各项组成的组的成员：多肽和小的干扰RNA(siRNA)。

30.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中在所述核酸-脂质颗粒中的核酸在所述颗粒于37℃暴露于核酸酶达20分钟后，基本上未被降解。

31.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述核酸被充分包封在所述核酸-脂质颗粒中。

32.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约2％到约60％。

33.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约5％到约45％。

34.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约15％到约40％。

35.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约30％。

36.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约40％到约50％。

37.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约5％到约90％。

38.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的约20％到约85％。

39.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述PEG-脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的1％到约20％。

40.按照权利要求17的核酸-脂质颗粒，其中所述PEG-脂质构成在所述颗粒中存在的总脂质的4％到约15％。

41.按照权利要求25的核酸-脂质颗粒，其中所述固醇构成在所述颗粒中存在的总脂质的约10％到约60％。

42.按照权利要求25的核酸-脂质颗粒，其中所述固醇构成在所述颗粒中存在的总脂质的约20到约45％。

43.一种药物组合物，其包括按照权利要求17的核酸-脂质颗粒和药用载体。

44.一种将核酸引入细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与核酸-脂质颗粒接触，所述核酸-脂质颗粒包括：

(a)式I的并具有下列结构的阳离子脂质：

其中：

R¹和R²独立地选自由下列各项组成的组：H和C₁-C₃烷基；和

R³和R⁴独立地选自由具有约10到约20个碳原子的烷基组成的组，其中R³和R⁴的至少一个包含至少两个不饱和位点。

(b)非阳离子脂质；

(c)PEG-脂质缀合物；和

(d)核酸。

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