CN104419688B - 一种果糖基转移酶及其基因、其分泌型表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果糖基转移酶，所述果糖基转移酶由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成；还公开了编码该果糖基转移酶的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达载体，转化体，以及应用所述果糖基转移酶基因生产果糖基转移酶的方法，构建的工程菌摇瓶发酵酶活最高可达508U／ml，是原始菌株酶活的约41倍。本发明还涉及所述果糖基转移酶在制备蔗果低聚糖中的应用以及利用所述果糖基转移酶制备蔗果低聚糖的方法。

Description

一种果糖基转移酶及其基因、其分泌型表达载体和应用

技术领域

本发明涉及一种果糖基转移酶，其果糖基转移酶基因及其分泌型表达载体和应用，属于遗传工程领域。

背景技术

低聚果糖(FOS)又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，是指在果糖基转移酶的作用下，通过转移果糖基作用生成蔗果三糖，蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。蔗果低聚糖是一种非还原性糖，具有难消化性、不致龋齿、双岐杆菌增殖作用及水溶性食用纤维等独特的生理活性。

果糖基转移酶(fructosyltransferase，EC2.4.1.9)，属于糖苷酶32家族。果糖基转移酶广泛的存在于生物界，不同微生物来源的果糖基转移酶性质不同。微生物果糖基转移酶作用于蔗糖，进行分子内转移果糖基反应生成FOS。其中黑曲霉来源的果糖基转移酶是工业上主要用微生物来源的酶源。

随着分子生物学的发展，果糖基转移酶分子生物学始于上世纪九十年代，1995年，第1个果糖基转移酶的基因得到克隆。其后，不同物种的果糖基转移酶基因得到研究。其中对丝状真菌果糖基转移酶的研究较多，并对一些编码果糖基转移酶的基因进行了克隆。到目前为止文献报道不太多。

毕赤酵母表达***具有表达量高、生产成本低、产物可分泌到胞外和易于后续修饰等优点，利用毕赤酵母表达的蛋白已有上百种。毕赤酵母近年来已成为倍受青睐的外源蛋白表达***。

本研究室从黑曲霉中克隆得到黑曲霉果糖基转移酶基因(fts,全长基因)，构建了pET22b-cFTS，pET22b-cFTSW质粒并转化大肠杆菌BL21，并构建pGAPZA-cFTS，pGAPZαA-cFTSW质粒，线性化后电转化毕赤酵母菌株GSll5，得到阳性克隆摇瓶发酵48h，测定培养液上清果糖基转移酶(主要在胞外，少量在胞内)酶活力最高为508U／ml。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的果糖基转移酶基因，以得到高表达果糖基转移酶的工程菌株，例如毕赤酵母菌株，从而得到大量的果糖基转移酶。

本发明人在黑曲霉10(CGMCC3.316，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101))中克隆得到一种新型基因，其编码的蛋白具有果糖基转移酶活性。经测序鉴定该基因的基因组核苷酸序列为SEQ ID NO：1，cDNA序列为SEQ ID NO：3，编码氨基酸序列为SEQ ID NO：2的蛋白，该蛋白具有果糖基转移酶活性，为一种果糖基转移酶。本发明人进一步检索发现，该基因序列在GenBank中没有登记，属于一种新基因发现。在此基础上，本发明人进一步在大肠杆菌和酵母菌中表达该基因，对其进行功能验证，从而完成了本发明。

本发明人将编码上述果糖基转移酶的核苷酸序列克隆到表达载体中构建重组表达载体。其中所用的表达载体例如，但不限于，分泌型表达载体，包括，但不限于，pET-22b，pGAPZA或pGAPZαA，这些载体均可从试剂公司购买得到。

具体而言，本发明人将从黑曲霉10中克隆的编码果糖基转移酶的核苷酸序列按照常规分子克隆方法克隆到商购的pET-22b，pGAPZA或pGAPZαA载体中，构建了重组表达载体pET22b-cFTS，pET22b-cFTSW，pGAPZA-cFTS和pGAPZαA-cFTSW。其中pET22b-cFTS和pET22b-cFTSW用于在大肠杆菌中进行表达，pGAPZA-cFTS和pGAPZαA-cFTSW用于在酵母菌中进行表达。表达后可以获得具有果糖基转移酶活性的酶蛋白，将其称为果糖基转移酶。

在优选的实施方案中，提供一种制备果糖基转移酶的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)克隆或合成编码SEQ ID NO：2所示的蛋白的核苷酸序列，并将其克隆到适当的表达载体中，构建含有编码SEQ ID NO：2所示的蛋白的核苷酸序列的重组表达载体；

(2)将步骤(1)得到的重组表达载体转入适当的宿主细胞中，进行培养，表达SEQID NO：2所示的蛋白。

本领域技术人员应该理解，上述方法还包括纯化步骤，纯化得到较高纯度的果糖基转移酶。

本领域技术人员应该理解，选择分泌型载体来构建表达本发明的果糖基转移酶的重组表达载体，目的是使目标蛋白分泌到培养物上清中，而不是形成包涵体，从而得到的培养物上清液本身就具有理想的果糖基转移酶活性，并且可以经过简单的纯化步骤即可得到具有果糖基转移酶活性的目标蛋白，而不要经过变性纯化和复性的复杂过程。

本领域技术人员应该理解，当提及本发明的“果糖基转移酶”时，该术语除了包括由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白之外，还包括由SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸取代、缺失或***而得到的具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同或相似的果糖基转移酶活性的蛋白。

因此，本发明提供下述：

1.一种果糖基转移酶，其为：

(1)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白；或

(2)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸取代、缺失或***而得到的具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同或相似的果糖基转移酶活性的蛋白。

2.编码第1项所述的果糖基转移酶的多核苷酸序列。

3.根据第2项所述的多核苷酸序列，其为如下(1)或(2)所示：

(1)SEQ ID NO：1或3或4所示的核苷酸序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

4.含有第2或3项所述的编码果糖基转移酶的多核苷酸序列的重组表达载体。

5.根据第4项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型载体。

6.根据第4项所述的表达载体，其中所用的表达载体选自pET-22b，pGAPZA或pGAPZαA。

7.含有第2项所述的编码果糖基转移酶的多核苷酸序列或第4项所述的重组表达载体的重组宿主细胞。

8.根据第7项所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞为转基因细胞系或基因工程菌，例如，重组的大肠杆菌或毕赤酵母。

9.第2项所述的编码果糖基转移酶的多核苷酸序列，第4项所述的重组表达载体或第7或8项所述的重组宿主细胞在果糖基转移酶制剂生产中的应用。

10.一种制备第1项所述的果糖基转移酶的方法，所述方法包括下述步骤：培养第7或8项所述的重组宿主细胞，得到第1项所述的果糖基转移酶。

11.第1项所述的果糖基转移酶在制备蔗果低聚糖中的应用，所述应用包括：以蔗糖为底物，在反应体系中加入第1项所述的果糖基转移酶或第7或8项所述的重组宿主细胞的培养物上清液，酶反应后得到蔗果低聚糖，所述蔗果低聚糖包括蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。

12.一种制备蔗果低聚糖的方法，所述方法包括：以蔗糖为底物，在反应体系中加入第1项所述的果糖基转移酶或第7或8项所述的重组宿主细胞的培养物上清液，酶反应后得到蔗果低聚糖，所述蔗果低聚糖包括蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖及其混合物。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示(A)重组表达载体pET22b-cFTS的物理图谱；(B)重组表达载体pET22b-cFTSW的物理图谱；

图2显示(A)重组表达载体pGAPZA-cFTS的物理图谱；(B)重组表达载体pGAPZαA-cFTSW的物理图谱；

图3显示转糖基产物的HPLC图谱(G，葡萄糖；S，蔗糖；GF2，蔗果三糖；GF3，蔗果四糖)。

序列说明

SEQ ID NO：1 果糖基转移酶基因组DNA序列，其由1941个碱基组成，该序列中含有1个内含子，为5’端的第1767位到1820位

SEQ ID NO：2 果糖基转移酶推导的氨基酸序列，由628个氨基酸残基组成，自氮端第1—15位氨基酸残基是N端信号肽序列

SEQ ID NO：3 果糖基转移酶的cDNA碱基序列，具有N端信号肽序列，由1887个碱基组成，简称cFTS

SEQ ID NO：4 cFTSW序列，即去掉了15个氨基酸的N端信号肽序列且不包含最后的终止密码子的核苷酸序列

SEQ ID NO：5 果糖基转移酶的N端信号肽序列

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

以下通过实施例来进一步阐述本发明，所描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，除非另有说明，本发明的实施例将采用本领域技术人员的能力范围之内的分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左到右书写。基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

具体步骤如下：

(1)克隆果糖基转移酶基因；

(2)构建含有果糖基转移酶基因的表达载体；

(3)表达载体转化受体菌；

所述表达载体为分泌型载体，优选为pET-22b(购自Novagen)，pGAPZA或pGAPZαA(这两种载体购自Invitrogen)。

所述受体菌为大肠杆菌(E.coli BL21)或毕赤酵母。

(4)培养转化的受体菌，得到果糖基转移酶。

果糖基转移酶酶活测定方法：

参照王立梅等(2006，食品与生物技术学报25(2))取适当稀释的粗酶液0.5ml与25％的蔗糖溶液(在0.1M pH5.0磷酸-柠檬酸盐缓冲液中配制)2ml混合均匀，45℃下酶解1小时，100℃煮沸15分钟终止酶解反应。果糖基转移酶活通过测定酶解过程中所释放出的葡萄糖(G)和还原糖(R)的含量，按照下式计算酶解过程中所产生的果糖量(F)和被转移的果糖(Fc)量。

F=R—G

Fc=G—F=2G-R

在相同条件下，以加入失活酶液的蔗糖溶液作为对照。在上述条件下，以每分钟转移1μmol果糖所需的酶量为一个果糖转移酶活力单位。

材料和试剂：

所用限制性内切酶，PCR试剂购自NEB公司；RNA提取及反转录试剂盒购自Promega公司；T4DNA连接酶，DNA Marker等购于宝生物公司；pEASY-B载体，大肠杆菌感受态细胞DH5α，BL21，PCR纯化试剂盒购自全式金，引物购于华大基因，DNA及质粒提取试剂盒购于天根生物；电转移购自Bio-Rad公司；YPD、以及YPD-Zeocin均按照Invitrogen公司操作手册配制；其他试剂均为国内外购买的分析纯试剂。

实施例1：黑曲霉果糖基转移酶基因的克隆

提取黑曲霉10(CGMCC3.316，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101))基因组DNA。设计引物进行PCR反应，得到黑曲霉果糖基转移酶全基因编码序列(FTS)，其中所用的引物序列如下：

sense primer：

5′-TAGGCGGATCCCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3′

anti-sense primer：

5′-AGGGCGGA ATTCTTA AGACTGACGATCCGGC-3′

提取黑曲霉10总RNA，并反转录成cDNA。设计引物进行PCR反应，得到黑曲霉果糖基转移酶cDNA编码序列(cFTS，为SEQ ID NO：3)，所用的引物序列如下同果糖基转移酶DNA引物序列。

pET22b-cFTS载体的构建

所用的引物序列同果糖基转移酶DNA序列引物。

用BamH I和EcoR I双酶切扩增的果糖基转移酶cDNA序列(SEQ ID NO：3)与pET22b(购自Novagen)。经酶切的目的片段与载体pET22b用T4DNA连接酶连接过夜，热激法转化大肠感受态细胞，挑选阳性菌株提取质粒即得到重组质粒pET22b-cFTS。

实施例2：pET22b-cFTSW载体的构建

引物序列如下：

cffs-p11：

5’-CTCGGAATTCAGCCTCTCCTTCCATGCAGAC-3’

cffs-p2w：

5’-TAGCGGCCGCAGACTGACGATCCGGCCAAG-3’

将利用上述引物扩增得到的果糖基转移酶核苷酸序列命名为cFTSW，其序列见SEQID NO：4。

cFTSW(SEQ ID NO：4)与cFTS(SEQ ID NO：3)的区别如下：

cFTS是包含本身信号肽(蛋白氨基酸序列的前十五个氨基酸)的cDNA序列，由1887个碱基组成；cFTSW是不包含自身信号肽的cDNA序列，由1839个碱基(不包含最后的终止子)组成。

用EcoR I和Not I双酶切扩增的cFTSW序列(SEQ ID NO：4)与载体pET22b(购自Novagen)。经酶切的目的片段与载体pET22b用T4DNA连接酶连接过夜，热激法转化大肠感受态细胞，挑选阳性菌株提取质粒即得到重组质粒pET22b-cFTSW。

实施例3：pGAPZA-cFTS载体的构建

引物序列如下：

ffs-p1：

5′-CTCGGAATTCATGAAGCTTCAAACGGCTTC-3′

cffs-p2：

5′-TAGCGGCCGCTTAAGACTGACGATCCGGC-3′

高保真Tag酶扩增果糖基转移酶cDNA序列(SEQ ID NO：3)，同时扩培含有pGAPZA质粒(购自Invitrogen)大肠杆菌菌株并提取pGAPZA质粒。EcoR I和Not I双酶切扩增的果糖基转移酶cDNA序列(SEQ ID NO：3)与载体pGAPZA，T4DNA连接酶过夜连接经酶切的目的片段与载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性菌株提取质粒即得到重组质粒pGAPZA—cFTS。

实施例4：pGAPZαA—cFTSW载体的构建

所用的引物如下：

cffs-pl：

5′-CTCGGAATTCGCCTCTCCTTCCATGCAGAC-3′

cffs-p2w：

5′-TAGCGGCCGCAGACTGACGATCCGGCCAAG-3′

高保真Tag酶扩增不含自身信号肽序列的果糖基转移酶cDNA序列(cFTSW，SEQ IDNO：4)，同时扩培含有pGAPZαA质粒(购自Invitrogen)的大肠杆菌菌株并提质粒。EcoR I和Not I双酶切扩增的cFTSW序列与pGAPZαA，T4DNA连接酶过夜连接经酶切的目的片段与载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性菌株提取质粒即得到重组质粒pGAPZA-cFTSW。

实施例5：pET22b-cFTS、pET22b-cFTSW重组子转化

重组的阳性菌株扩培后提取质粒，热激转化大肠杆菌BL21表达菌株。

实施例6：pGAPZA-cFTS、pGAPZαA-cFTSW重组子转化

重组的阳性菌株扩培后提取质粒，用BspH I单酶切为线性质粒，总量为5—10ug进行电转，转入毕赤酵母GSll5感受态细胞(毕赤酵母GSll5购自Invitrogen，其感受态细胞按照常规方法制备)。电转仪设置为电压1500v，电容25uF，电阻200Ω。

实施例7：重组子的筛选及分子验证

热激转化大肠杆菌BL21后加入400ul LB培养基，37℃复苏后涂布氨苄浓度为100ug／ml的LB平板。以长出的单菌落为模板，以基因特异引物进行PCR反应，得到相应大小条带即确定为阳性菌株。

电转化毕赤酵母GS115后加入1ml山梨醇溶液，30℃复苏后涂布Zeocin浓度为100ug／ml的YPD平板，长出的单菌落接种YPD液体培养基培养，取上清液测定果糖基转移酶活性，抗生素Zeocin筛选的阳性毕赤酵母菌落的培养上清液均检测到果糖基转移酶活性，由于各菌株表达果糖基转移酶的能力有差别，可以选取果糖基转移酶活性高的工程菌株用于进一步的研究。

实施例8：pET22b-cFTS、pET22b-cFTSW重组子阳性菌株摇瓶发酵

挑取阳性菌株单菌落，5ml试管培养过夜。取1ml到50ml LB三角瓶中，37℃，250rpm，摇菌2.5-3h，置于冰上5分钟，(菌体溶度为OD6000.6-0.8)加入10mM IPTG50-100ul诱导，25℃，震荡培养。每隔一段时间取样测酶活(即，取培养物上清测酶活)，24小时后酶活力达到1.68U／ml。

实施例9：pGAPZA-cFTS、pGAPZαA-cFTSW重组子阳性菌株摇瓶发酵

参考Invitrogen公司操作手册，挑取阳性菌株单菌落接种至5ml YPD培养基中，28℃，250rpm摇床培养过夜，按1-4％的比例转接到50ml YPD培养基三角瓶中，相同条件培养，每隔12小时，取样测酶活(即，取培养物上清测酶活)，培养48小时后，胞外酶活达到最高，为508U／ml。

实施例10：酵母工程菌产果糖基转移酶的酶解产物分析

以25％蔗糖为底物，果糖基转移酶含量为8单位每克蔗糖，pH5.0，45℃下反应，每隔一段时间(例如，反应后20分钟，2小时，12小时，24小时)取适量反应混合物进行产物分析。HPLC分析表明，产物中首先出现的蔗果三糖(GF2)，蔗果四糖(GF3)，最后是蔗果五糖。反应液中果寡糖最高占总质量的58％。图3显示转糖基产物的HPLC图谱，图谱数据与反应液中果寡糖最高占总质量的58％相一致，该HPLC图谱中没有显示蔗果五糖，反应延长可出现蔗果五糖。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (10)

1.一种果糖基转移酶，其为由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白。

2.编码权利要求1所述的果糖基转移酶的多核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸序列，其为SEQ ID NO：1或3或4所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的编码果糖基转移酶的多核苷酸序列的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为分泌型载体。

6.根据权利要求4所述的表达载体，其中所用的表达载体选自pET-22b，pGAPZA或pGAPZαA。

7.含有权利要求2所述的编码果糖基转移酶的多核苷酸序列或权利要求4所述的重组表达载体的重组工程菌细胞。

8.根据权利要求7所述的重组工程菌细胞，其为重组的大肠杆菌或毕赤酵母。

9.权利要求2所述的编码果糖基转移酶的多核苷酸序列，权利要求4所述的重组表达载体或权利要求7或8所述的重组工程菌细胞在果糖基转移酶制剂生产中的应用。

10.一种制备权利要求1所述的果糖基转移酶的方法，所述方法包括下述步骤：培养权利要求7或8所述的重组工程菌细胞，得到权利要求1所述的果糖基转移酶。