CN104411296A - 含有鱼类眼球的粉碎物或提取物的化妆料、药学及食品组合物 - Google Patents

含有鱼类眼球的粉碎物或提取物的化妆料、药学及食品组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含鱼类眼球的粉碎物或提取物作为有效成分的化妆料组合物，是一种皮肤美白效果、皮肤弹性改善效果优异，皮肤保湿效果、细胞活化效果优异，皮肤再生及伤损伤功效卓越，且具备刺激缓解效果的多功能性化妆料组合物。另外，本发明涉及包含鱼类眼球粉碎物或提取物作为有效成分的用于预防及治疗关节炎的组合物。本发明的组合物诱导在肠相关淋巴组织中产生的免疫耐受，能够在无副作用的情况下，有效抑制特异性地发生的自我免疫反应及炎症，能够预防及治疗关节炎。另外，本发明涉及包含鱼类眼球提取物作为有效成分的用于治疗眼球干燥症的药剂学组合物。本发明使用鱼类眼球提取物，能够有效治疗角结膜上皮障碍症等眼球疾病，而不会出现以往的抗炎症性药物的反复投药所产生的副作用。

Description

含有鱼类眼球的粉碎物或提取物的化妆料、药学及食品组合物
技术领域
本发明涉及含有鱼类眼球的粉碎物或提取物的化妆料组合物，更具体地说，涉及含有鱼类眼球的粉碎物或提取物的多功能性化妆料组合物。
另外，本发明涉及包含鱼类眼球的粉碎物或提取物作为有效成分的用于预防或治疗关节炎的药剂学组合物及食品组合物。
另外、本发明涉及包含鱼类眼球提取物作为有效成分的用于治疗眼球干燥症的药剂学组合物。
背景技术
金枪鱼(Thunnus thynnus(Linnaeus))是属于鲈鱼目鲭鱼科的海鱼。在韩国江原道又被称为鲔鱼。在北大西洋栖息的金枪鱼，其最大生长到身长3m、体重560kg左右。金枪鱼体胖而接近纺锤形，身长偏高，嘴长而末端尖细，嘴巴大。身体背部为深蓝色，身体前侧中央和肚子侧为银灰色，并且显现有多个宽度窄而细的白色横条纹和圆形纹络。其小时候，窄而细的横条纹和圆形纹络模糊可见，但是随着成长而消失。小而圆的鱼鳞将整个身体覆盖。其样子和白鲭鱼很像，但是鱼鳍窄的金枪鱼。金枪鱼在海水面下方游行，偶尔会靠近海岸出现。在春天、夏天的时候向北移动，到了秋天会向南移动。金枪鱼主要以成群游动的小银鱼、秋刀鱼、青鱼等为食物，也吃虾类、贝类、章鱼类、水母等。产卵期在台湾附近为4～6月，在韩国东海为8月，主要产卵区域为韩国东海南部海域和台湾北部海域。金枪鱼含有丰富的蛋白质和氨基酸，而且作为不饱和脂肪酸的亚米茄-3-脂肪酸丰富，还含有大量的维生素和硒等微量元素，金枪鱼的眼睛也含有亚米茄-3-脂肪酸、蛋白质、水分等。
鲭鱼(Scomber japonicus)是鲈鱼目鲭鱼科的海鱼，背侧呈暗青色，腹侧呈银白色。体长且为纺锤形，稍微侧偏。眼睛大，油眼皮非常发达，瞳孔部位露出。两只眼睛之间扁平。上颚的末端位于瞳孔中央下面。背鳍分为2个且相隔较远，基底长度相近，但是高度是第1背鳍更高。胸鳍位于体侧的中央，较小。臀鳍位于与第2背鳍对称的位置。背鳍和臀鳍在后方分别有各5段鳍，尾柄非常短。尾鳍是非常发达的胯型。第1背鳍中的第2刺非常长。体背侧呈暗青色，从中央至腹侧呈银白色。体背侧分布有青黑色的水纹花样直至侧线。背鳍透明，但不均匀地分布有黑色素，所以显黑，胸鳍基底部白，但是基底部的上半部上边缘及后半部黑。腹鳍和臀鳍无色透明，尾鳍呈灰色，但是外侧边缘显黑。生长到最大体长达50cm，通常在30cm范围内。
在韩国，鲭鱼科鱼类有2种，分别为鲭鱼和作为类似种的花腹鲭。花腹鲭在体侧的中央分布有圆形暗青色的花纹，能够用于区分，鲭鱼和花腹鲭的中间形态的个体变异，需要仔细研究。另一方面，在花腹鲭中，第一个背鳍的第3～4个刺最长，由此能够良好地与鲭鱼进行区分。栖息水深是0～300m。作为浮鱼性鱼种，栖息在表层或离表层300m以内的中层。当成长到3cm以上时，按照体态大小区分组群而生活。在北东太平洋，与其他鱼种们组群而移动。在韩国，分布于整个大洋的热带、温带海域等。在东中国海等中采集。产卵在水温15～20℃下进行，根据地域的不同而有些许差异。进行季节回游，在北半球栖息的物种在水温上升的夏季向北方移动，在冬天向南方移动而产卵。食物主要以桡足纲、甲壳类、鱼类、章鱼类等为主，与组群生活的其他鱼种进行食物竞争。鲭鱼含有丰富的作为亚米茄-3-脂肪酸的一种的DHA和EPA，并且含有大量的钙、铁粉、钾、维生素B2、维生素D等，蛋白质和氨基酸也丰富。
如上所述，金枪鱼或鲭鱼各种营养丰富，但是至今还没有将这种金枪鱼或鲭鱼、尤其金枪鱼或鲭鱼的眼睛(眼球)作为化妆料、药剂学或食品组合物的原料使用的例子。
另一方面，最近，以天然物为素材的化妆品因具备人体安全性、对皮肤的刺激少等理由而受到消费者青睐，随之，作为化妆品原料，对天然物进行了各种研究。
由此，获得了将鱼类作为化妆品原料的研究成果，与此相关的有，韩国公开专利第10-1999-0033721号(从鱼类提取水溶性COLLAGEN的方法及功能性COLLAGEN化妆品和COLLAGEN发酵饮料的制造方法)中公开了从鱼类皮、头部分、骨头、内脏等中提取分离出胶原蛋白的方法，在韩国登记专利第10-0760875号(用于黑色素生成抑制和皮肤美白的化妆品组合物)中公开了从鱼皮提取明胶的方法。在韩国登记专利第10-0986603号(从鱼类***或卵中分离出的DNA聚合物段片复合体及其制造方法)中公开了包含从鱼类***或卵分离出的DNA段片混合物的化妆料组合物。但是，至今还没有出现将鱼类的眼睛(眼球)作为化妆料原料的先例。
另一方面，关节炎是我国人口的5％都患有的慢性疾病，是由于关节骨液膜发生炎症而引发浮肿和疼痛的疾病。关节炎属于进行性疾病，会导致关节变形及障碍，如果不治疗，会继续恶化，而造成严重的后果。
诱发关节炎的直接原因尚不明确，但是为了治疗，通常使用包含可的松及其他肾上腺皮质激素等类固醇系、阿司匹林、吡罗昔康及吲哚美辛等非类固醇系抗炎症剂、氯醌剂及D-青霉胺等抗风湿剂、秋水仙碱(Colchicine)等通风抑制剂、以及环磷酰胺(cyclophosphamide)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤及左咪唑(levamisole)等免疫抑制剂的各种治疗剂。但是，这种化学性治疗剂未能显示出根本性的治疗效果，而且对于类固醇激素剂，因其副作用而使用受限。另外，作为缓解关节疼痛或消除炎症的药剂广泛使用的阿司匹林剂及保泰松等会给人的胃带来致命性影响，所以不能够持续服用治疗关节炎所需的量。
现有的这些化学疗法性药剂具有不能长期服用药剂的副作用、以及长期服用时抗炎症效果降低的缺点。当前使用比较普遍的是镇痛作用优异的吲哚美辛及扑热息痛和非类固醇性的各种消炎剂。
而且，希望开发出能够解决上述问题的同时对炎症性症状和疼痛显示出效果的关节炎治疗剂，由于关节炎治疗药剂需要长期服用，所以开发出副作用少的药剂也是非常重要的。另外，现有药剂中的一部分是通过静脉注射或腹腔注射来进行投药，在这种情况下，不仅操作麻烦，而且还存在过敏、休克及卫生上的问题，因此需要一种服用简便且安全的治疗剂。
至今为止，用于治疗关节炎的大部分的保健食品是以软骨构成成分为主原料。在韩国专利公开第2001-0018321号中公开了一种用于风湿病关节炎患者的保健食品组合物，在韩国专利公开第2005-0078080号中公开了一种用于治疗关节炎的制药物性组合物及其制造方法，在韩国专利申请第10-2003-00433119号中公开了一种用于治疗退化性关节炎的保健辅助食品组合物，该组合物包含葡萄糖胺40-50％、黏多糖蛋白质30％、维生素C、牛膝、木瓜、杜冲及鲨鱼软骨提取物粉末。但是，至今为止，还没有关于在关节炎的预防或治疗中使用鱼类眼球粉碎物或提取物的具体报告。
鉴于此，本发明人确认到鱼类眼球粉碎物或提取物能够减少由胶原蛋白引起的动物模型中的发红及浮肿，能够减少已被确认为是造成关节炎的原因的细胞因子分子的血中数值，从而能够有效地用于关节炎的预防或治疗，由此完成了本发明。
另一方面，在长时间读书、使用电脑、驾驶、看电视等长时间使用眼睛的话，会造成眼皮的眨眼频率减少，用眼泪来掩盖眼睛的眨眼的减少是导致眼科疾病的原因。
随着高龄人口的增加、便携式终端性能的改善和通信技术的发达及文化产业的成长，导致现代人的眼睛除了睡觉时间之外不能休息而负担过重，所以眼科相关疾病存在持续增长的趋势。
眼球干燥症，狭义上说是结膜干燥症、低落泪、干性角结膜炎等的疾病，但广义上讲，其含义非常广泛，表示结膜异常干燥的全部症状。像这样，眼球干燥症的概念非常广泛，其原因也很复杂，在大多数情况下，并不明确，所以不能说是单一疾病，应该是包括称之为眼球干燥综合症的疾病的眼球表面的疾病。
当前，对于眼球干燥，与角结膜炎性障碍无关地，由眼泪的量及质的非正常状态来定义。根据上述定义，眼球干燥的范围包括低落泪、眼泪缺乏症、眼球干燥症、舍格伦综合征、干性角结膜炎、史-约综合征、眼睛类天疱疮、眼睑缘炎、眼睑关闭不全症、视神经麻痹等等疾病。
在构成眼睛的组织中，眼角膜和结膜作为露出于外部的上皮组织，容易受到外部因素而受伤。在诸多治愈由外部因素引起的局部部位的损伤的方法，在相应的损伤部位上作用药物，以防止由炎症引起组织的2次损伤和加快组织再生速度。炎症的原因包括病原性微生物感染和引起炎症的物质的化学性浸入、各种过敏、过敏性自我免疫疾病及物理性伤等。
在患上眼球干燥的情况下，油性层、水性层及黏液层中的任意一个眼泪不足，引起角结膜炎性障碍。尤其，眼泪在黏液层不足的情况下，眼角膜损伤严重，不仅会引发由眼角膜上皮细胞损伤引起的眼角膜上皮侵袭、眼角膜上皮障碍，还容易引发眼角膜溃疡(例如、眼角膜基质层的溃疡)及感染性眼疾病。在某种情况下，还需要眼角膜移植。
除此之外，在使用软式隐形眼镜时，会造成眼球干燥。软式隐形眼镜虽然有含水性，但是难以在隐形眼镜表面分布足够厚度的水层，所以地质层的分散变差，隐形眼镜的漏液蒸发进行有可能成为眼角膜上皮障碍的原因。
至今为止，在眼球干燥症治疗方面，还没有出现使用了鱼类眼球提取物的具体报告。鉴于此，本发明人确认到鱼类眼球提取物能够减少眼球的水分蒸发，对眼角膜上皮细胞障碍的治疗有效，从而明确了能够用于眼球干燥症的治疗，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能够适用于皮肤化妆料且对人体无害而安全性优异的鱼类眼睛的粉碎物或提取物。
另外，本发明的目的在于，利用鱼类眼球的粉碎物或提取物，提供一种皮肤美白效果、皮肤保湿效果、皮肤弹性改善效果非常优异的化妆料组合物。
另外，本发明的目的在于，利用鱼类眼球的粉碎物或提取物，提供一种细胞活化效果优异、皮肤再生及伤治愈功效优异、刺激缓解效果也非常显著的化妆料组合物。
另外，本发明的目的在于，提供一种包含鱼类眼球粉碎物或提取物的用于预防或治疗关节炎的药物性组合物及功能性食品。
另外，本发明的目的在于，提供一种包含鱼类眼球提取物的用于治疗眼球干燥症的药剂学组合物。
本说明书中使用的术语“鱼类”是指在水中生活的具有鳃的脊椎动物，上述鱼类是选自由例如、魟鱼、鳕鱼、鲭鱼、坚鳞鲈、胡瓜鱼、三文鱼、玉筋鱼、金线鱼、安康鱼、大白鲨、鲂鱼、明太鱼、东方鲈、鲤鱼、鲫鱼、青鱼、枪鱼、真鲷、金枪鱼、鲻鱼、马鲛鱼、鲇鱼、银鱼、秋刀鱼、翻车鱼、黑鲷、带鱼、桂鱼、欧洲鲈鱼(bass)、泥鳅、鲇鱼、乌鱼、叫姑鱼、东方黄鲂鮄、剑鱼、暗纹东方鲀、黄鳍金枪鱼、灰鲭鲨、黄花鱼、河豚、鲽鱼、鼠鱼、鲥鱼、黑鮶鱼、沙丁鱼、竹荚鱼、斑鳍光鳃鱼、远东多线鱼、马头鱼、鳗鱼、鲳鱼、及黄姑鱼构成的组中的一个以上的鱼类。优选在本发明中使用的鱼类是金枪鱼或鲭鱼。
而且，本说明书的“眼球”是收集视觉信息，将该视觉信息转换为电化学信息，通过称为视神经的通道，传达给大脑的器官。如下所示，鱼类的眼球的结构如下：最外侧为巩膜(在水晶体前侧作为眼角膜存在)，巩膜内侧为脉络膜，脉络膜内侧为视网膜，在视网膜前面部分具有水晶体和虹彩，水晶体的前侧为水样液，后侧被玻璃状液填满，除此之外，还包括镰刀形突起(起到与人的毛样体类似的作用)、肌肉、色素层等。
[鱼类的眼球结构]
而且，在本说明书中的术语“粉碎物”是表示将本发明的鱼类眼球粉碎的产物。具体地说，从鱼类的头部分摘除眼球，将附在眼球的巩膜部分上的肌肉组织分离，准备好干净地分离的眼球之后，使存在于眼球内部的水晶体等眼球的下部器官或构成该器官的物质露出到外部，使用本领域通常使用的搅拌器或均化器进行粉碎。此时，优选均匀地处理到人体内部容易吸收的1μm-5mm大小。另外，本发明的鱼类眼球粉碎物也可以是采用上述方式将鱼类的眼球均匀地粉碎之后进行过滤后得到的过滤液。
为了实现上述目的，本发明的第1实施方式，提供一种化妆料组合物，其特征在于，包含鱼类眼球的粉碎物或提取物作为有效成分。
下面详细说明本发明的鱼类眼球的粉碎物或提取物及包含它的化妆料组合物。
本发明的特征在于，作为化妆料组合物的有效成分，使用鱼类的眼睛、即眼球。像这样，本发明采用未能被有效利用而作为废弃物扔掉的金枪鱼或鲭鱼的眼球，所以不仅能够活用废弃资源，还能够防止2次环境污染。
在此，鱼类的眼球优选金枪鱼或鲭鱼中的1种以上的鱼类的眼睛(眼球)，更优选将新鲜的金枪鱼或鲭鱼速冷之后，与肉质分离获得后冷冻的鱼类眼睛(眼球)。
在本发明中，包含上述鱼类眼球的粉碎物作为有效成分，在此，获得鱼类眼球的粉碎物的方法没有特别限定，能够使用本发明所属的技术领域中通常使用的方法。例如，粉碎机、例如搅拌器或均化器将上述冷冻的鱼类眼球粉碎后使用，优选均匀地处理到人体内部容易吸收的1μm-5㎜大小。
另外，本发明包含上述鱼类眼球的提取物作为有效成分，在此获得鱼类眼球的提取物的方法没有特别限定，能够使用本发明所属的技术领域中通常使用的各种提取方法。将例如、精制水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷、己烷中的一种单独作为溶剂或将其中的2种以上混合后的溶剂作为提取溶剂使用，进行提取。
另外，本发明的鱼类眼球的提取物不仅包括采用上述的提取溶剂提取的提取物，还包括采用其他方法提取的提取物。例如、采用超高压提取法进行提取；利用具备预定分子量截止值的限外过滤膜进行的分离；各种色谱法，基于为了根据例如大小、电荷、疏水性或亲和性进行分离而制作的色谱图进行的分离等，通过附加地实施的各种精制方法而获得的分划，也属于本发明的鱼类眼球的提取物。
本发明在利用超高压提取法来对鱼类的眼球进行超高压提取的情况下，优选在压力100～3000MPa、温度40～90℃下处理5～60分钟，更优选在压力500～1000MPa、温度40～60℃下处理10～30分钟。另外，进行超高压提取时，pH不限定于特定pH，但是优选将超高压机内容物的pH降低到1～6进行处理。另外，本发明优选将采用上述方式进行了超高压处理的金枪鱼或鲭鱼的眼球提取物利用选自精制水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷、己烷及它们混合物的提取溶剂进行回流提取之后冷浸，将过滤得到的过滤液转送到浓缩槽，在50℃以下进行加压浓缩及冻结干燥。本发明中使用选自精制水、乙醇、丁二醇、丙二醇的1种以上的溶剂，使得最终产物中加压浓缩物及冻结干燥物的含量为0.001～70.0重量百分比，由此制造提取物。
另外，本发明的鱼类眼球的提取物包括：将上述提取物的一部分或全部浓缩而得到的浓缩物；或者，再次将该浓缩物干燥而制造的提取精华物；以及提取物中含有的主要发挥效果的化学物质本身。
采用上述方式获得的本发明的鱼类眼球的粉碎物或提取物，黑色素生成抑制效果、抗胶原酶/明胶酶活性效果、紫外线照射后的MMP-1表达抑制效果、由紫外线照射引起的细胞毒性缓解效果、皮肤保湿效果、皮肤弹性效果、刺激缓解效果、伤治愈效果非常显著，能够作为综合性地显示出皮肤美白、皮肤弹性强化或皮肤保湿效果的多功能性化妆料组合物使用。
在本发明的化妆料组合物中，优选相对于组合物总重量，上述鱼类眼球的粉碎物或提取物的含量为0.0001～90重量百分比，在添加量小于0.0001重量百分比的情况下，难以期待其效果，在添加量大于90重量百分比的情况下，也不能看到功效有更明显的提高。
另外，本发明的化妆料组合物中除了上述鱼类眼球的粉碎物或提取物之外，在不损害作为本发明的目的的主要效果的范围内，还可以含有能够对主要效果产生提升效果的其他成分。还可以包含例如抗老化成分、皱纹改善成分、美白成分、保湿成分及抗菌成分等。
另外，本发明的化妆料组合物还可以含有在化妆品领域中通常使用的辅助剂，例如亲水性或亲油性胶凝剂、亲水性或亲油性活性剂、保存剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、遮蔽剂、颜料、吸取剂、染料等。这些多种辅助剂的量是本发明所属领域通常使用的量，例如，相对于组合物总重量，为0.0001-30重量百分比。另外，在任何情况下，都以辅助剂及其比例不能给基于本发明的化妆料组合物的优异性质造成坏影响为前提。
另外，本发明的化妆料组合物的剂型不限于特定的种类，作为例子，可以举出从由化妆水、凝胶、水溶性液体、霜、精华液、水包油(O/W)型及油包水(W/O)型组成的基础化妆料剂型、以及由水包油型及油包水型隔离霜、粉底、遮瑕膏、口红、唇膏、粉饼、散粉、眼影、腮红及眉笔组成的彩妆化妆料剂型中选择的任意一种剂型。另外，也可以选择性地以喷雾形态应用于皮肤，也可以是固体形态例如、棒状形态。也可以作为皮肤用清洗产品和/或化妆产品使用。
如上所述制造的本发明的化妆料组合物，皮肤美白效果、皮肤弹性改善效果、皮肤保湿效果非常优异，细胞活化效果优异，皮肤再生及伤治愈功效卓越，还具有刺激缓解效果，能够作为多功能性化妆料组合物使用。
另一方面，根据本发明的第2实施方式，本发明提供一种用于预防及治疗关节炎的组合物，其包含鱼类眼球粉碎物或提取物作为有效成分。
本发明人为了开发关节炎预防治疗功效优异且副作用大幅度减少的用于预防及治疗关节炎的组合物而进行了不懈的努力。其结果，确认到在关节炎的发病中投入鱼类眼球粉碎物或提取物的情况下，免疫耐受(tolerance)反应较大地增大，关节炎特异性炎症反应大幅度减少，从而最终能够实现关节炎预防及治疗功效。
在本发明的组合物中，基本的有效成分是鱼类眼球粉碎物或提取物。
本发明的有效成分、即鱼类眼球粉碎物或提取物含有大量的维生素A、B2等，尤其眼球后位含有大量的维生素B1，有助于糖质代谢。另一方面，本发明人还发现，鱼类眼球粉碎物或提取物能够起到增加由胶原蛋白诱导出的免疫耐受反应的作用。本发明的组合物是在这种新颖的发现为基础实现的。另外，在本发明的组合物中，鱼类眼球粉碎物或提取物起到促进IL-10、TGF-β这类的抗炎症细胞因子的生成的作用。
在本发明中，鱼类眼球粉碎物能够使用利用粉碎机例如搅拌器或均化器将冷冻的鱼类眼球粉碎而得的粉碎物，优选均匀地处理为人体内部容易吸收的1μm-5㎜大小。在本发明中，鱼类眼球粉碎物其自身能够大大地改善关节炎特异性炎症反应，其结果能够实现关节炎预防及治疗功效，为了提高预防及治疗功效，也可以将由鱼类眼球粉碎物提取的提取物作为有效成分使用。
在本发明中，鱼类眼球提取物采用如下方式获得，在鱼类眼球粉碎物中加入2倍-20倍、优选2倍-5倍左右的水、甲醇或乙醇等低级(C1-C4)醇的极性溶剂或它们的混合溶剂，在10℃-30℃的提取温度下，利用冷浸提取、回流冷却提取、热水提取、超声波提取、超高压提取等提取方法，获得提取液，将提取液过滤、加压浓缩或冻结干燥，由此获得加入于极性溶剂的提取物。
在本发明中，上述提取采用超高压提取方式的情况下，具有如下优点：基于鱼类眼球细胞组织破坏的有效成分的溶出变得容易，基于能量水平受限的氢结合、范德华力结合等弱结合的结合分离，从而能够溶出新物质，细胞毒性物质破坏，能够在短时间内提取出重要构成成分，提取物中几乎不存在杂质，能够容易地获得高纯度的单一成分。
在本发明中，上述超高压提取优选在压力100-3000MPa，40-90℃温度下处理5-60分钟，更优选在压力500～1000MPa、温度40～60℃下处理10～30分钟。在上述压力条件为100MPa以下的低压力条件或提取时间为5分钟以内的情况下，鱼类眼球细胞组织破坏不充分，有效成分的溶出效率下降，在压力条件为3000MPa以上的高压力条件或提取时间为60分钟以上的情况下，提取中消耗的能量效率下降，因此优选在上述范围进行提取，为了有效地消除氢结合、电结合、范德华力结合等弱结合，优选在40-90℃温度条件下执行。另外，进行超高压提取时，pH不限于特定pH，但优选将超高压机内容物的pH降低到1～6进行处理。使pH处于上述范围内的情况下，有效成分的溶出效率增大。
另外，本发明如上所述优选利用从精制水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷、己烷及其混合物选择的提取溶剂，将经过超高压处理的鱼类的眼球提取物进行回流提取、冷浸之后，进行过滤，将过滤后的过滤液转送到浓缩槽，在50℃以下进行加压浓缩及冻结干燥。
另外，本发明中使用选自精制水、乙醇、丁二醇、丙二醇的1种以上的溶剂，使得最终产物中加压浓缩物及冻结干燥物的含量为0.001～70.0重量百分比，由此制造提取物。
在本发明的鱼类眼球粉碎物或提取物中，诱导免疫耐受反应的物质作为抗原起到作用。关节炎由于与免疫反应相关的自我抗原的种类非常多，所以不可能开发出特异性的治疗剂。本发明的核心原理是利用在生物肠相关淋巴组织(Gut AssociatedLymphoid Tissue：GALT)中发生的免疫耐受。免疫耐受是指，针对经口传递的物质，存在于小肠的上皮细胞下方的免疫***(GALT)选择性地引起免疫抑制反应。
在本发明的优选的实现例中，本发明的组合物还可以包含葡萄糖胺、软骨素或它们的组合。上述葡萄糖胺及软骨素均是软骨构成成分。而且，除了鱼类眼球粉碎物或提取物之外，利用能够作为自我抗原发挥作用的其他软骨构成成分(葡萄糖胺及软骨素)的话，能够诱导更高的免疫耐受反应。另外，葡萄糖胺起到促进软骨形成和再生的作用。软骨素不仅诱导免疫耐受反应，还能够抑制破坏软骨的酶，起到软骨保护作用。
本发明的关节炎预防或治疗组合物能够作为药剂学组合物制备，在该情况下，除了作为有效成分的上述成分之外，还可以包含允许在药剂学上使用的载体。本发明的药剂学组合物中包含的在药剂学上允许使用的载体是在制剂时通常使用的，包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、已六醇、淀粉、***橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微细结晶性纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖汁、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。本发明的药剂学组合物中除了上述成分之外，还包含润滑剂、湿润剂、减味剂、香味剂、乳化剂、悬浊剂、保存剂等。适当的在药剂学上允许使用的载体及制剂在Remington’sPharmaceutical Sciences(19thed.,1995)中有详细记载。
本发明的药剂学组合物需要诱导免疫耐受反应来发挥功效，所以经口投入。
本发明的药剂学组合物的合适的投入量根据制剂化方法、投药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、饮食、投药时间、投药路径、***速度及反应感应性等要素而不同，普通有经验的医生可以根据治疗目的，容易地决定能够有效治疗的投药量进行处方。另一方面，本发明的药剂学组合物的投药量优选1天0.01-2000mg/kg(体重)。
本发明的药剂学组合物基于本领域技术人员容易实施的方法，利用药剂学上允许使用的载体和/或赋型剂来制剂化，可以采用单位容量方式制作，也可以装入大容量容器中制造。此时，剂型可以是油或水性介质中的溶液、悬浊液或乳化液形态，或者精华液、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可以包含分散剂或稳定剂。
本发明的关节炎预防或治疗组合物也能够作为食品、尤其功能性食品组合物制造。本发明的功能性食品组合物包含在食品制造时通常添加的成分，包含例如、蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素及调味剂。例如，在作为饮料制造的情况下，除了作为有效成分的鱼类眼球粉碎物或提取物之外，作为附加成分，还可以包含香味剂或天然碳水化合物。例如，天然碳水化合物可以使用单糖(例如、葡萄糖、果糖等)；双糖(例如、麦芽糖、蔗糖等)；低聚糖；多糖(例如、糊精、环式糊精等)；及糖醇(例如、木糖醇、山梨糖醇、赤藻糖醇等)。作为香味剂，可以使用天然香味剂(例如、祝马丁、甜叶菊提取物等)及合成香味剂(例如、糖精、阿斯巴特等)。
考虑到对食品的容易亲近性，本发明的食品作为关节炎的治疗或预防非常有用。
在此，本发明的食品组合物中，相对于组合物的总重量，优选上述鱼类眼球的粉碎物或提取物的含量为0.0001～90重量百分比，在含量小于0.0001重量百分比的情况下，难以期待其效果，在含量大于90重量百分比的情况下，也不能看到功效有显著的提高。
如下述实施例中所证明的，本发明的组合物诱导免疫耐受反应，从而减少促炎症细胞因子(proinflammatory cytokines)、例如、TNF-α、IL-1β及IL-12的表达量，增加抗炎症细胞因子(antiinflammatory cytokines)、例如、IL-10、Foxp3及TGF-β的表达量，增加Th2型免疫反应，减少Th1型免疫反应。其结果，作为关节特异性产生的自我免疫反应及炎症反应剧减，能够发挥关节炎预防或治疗功效。
本发明的组合物针对关节炎(骨关节炎及风湿病性关节炎)，尤其对自我免疫疾病的一种、即作为炎症性疾病的风湿病性关节炎的预防或治疗发挥非常优异的功效。另外，在本发明的组合物中作为有效成分利用的成分的安全性已得到认证。所以本发明的组合物对人体的安全性也非常优异。本发明的组合物中包含的有效成分是作为食品原料获得认证的安全性优异的物质，这些成分相比于现有医药(例如、甲氨蝶呤)能够发挥更优异的关节炎预防或治疗功效，这是非常令人惊奇的事情。
以往，关节炎治疗的局限性在于，涉及免疫反应的自我抗原的种类非常多，难以开发关节炎特异性的治疗剂，已开发出的现有的关节炎治疗剂只是单纯地抑制炎症反应的医药，长期服用时，存在安全性问题和会产生诸多副作用。另外，大部分的关节炎治疗用保健食品只具有以软骨构成成分之一的葡萄糖胺复合体及鲨鱼软骨提取物等为主原料的单一性功能。相对于此，本发明的组合物通过诱导在肠相关淋巴组织中产生的免疫耐受，从而能够在无副作用的情况下，有效地消除在关节上特异性地产生的自我免疫反应及炎症，能够预防及治疗关节炎。
另一方面，根据本发明的第3实施方式，本发明提供一种包含鱼类眼球提取物的用于治疗眼球干燥症的药剂学组合物。
本发明人为了开发眼球干燥症治疗功效优异且副作用大幅度减少的用于治疗眼球干燥症的组合物而进行了不懈的努力。其结果，确认到在眼球干燥症中使用鱼类眼球提取物的情况下，保湿效果及眼角膜上皮细胞障碍得到迅速治疗，其结果能够治疗眼球干燥症。
在本发明的组合物中，基本的有效成分是鱼类眼球提取物。在本发明中，鱼类眼球粉碎物其本身显示出眼球保湿效果、眼角膜上皮细胞障碍的治愈效果等，但是为了使眼睛不会有异物感，并提高眼球干燥症治疗及预防功效，优选以将有效成分提取的提取物形态使用。
在本发明中，鱼类眼球提取物采用如下方式获得，在鱼类眼球粉碎物中加入2倍-20倍、优选为2倍-5倍左右的水、甲醇或乙醇等低级(C1-C4)醇的极性溶剂或它们的混合溶剂，在10℃-30℃提取温度下，利用冷浸提取、回流冷却提取、热水提取、超声波提取、超高压提取等提取方法，获得提取液，将提取液过滤、加压浓缩或冻结干燥，由此获得加入于极性溶剂的提取物。
在本发明中，上述提取采用超高压提取方式的情况下，具有如下优点：基于鱼类眼球细胞组织破坏的有效成分的溶出变得容易，基于能量水平受限的氢结合、范德华力结合等弱结合的结合分离，从而能够溶出新物质，细胞毒性物质破坏，能够在短时间内提取出重要构成成分，提取物中几乎不存在杂质，能够容易地获得高纯度的单一成分。
在本发明中，上述超高压提取优选在压力100-3000MPa，40-90℃温度下处理5-60分钟，更优选在压力500～1000MPa、温度40～60℃下处理10～30分钟。上述压力条件为100MPa以下的低压力条件或提取时间为5分钟以内的情况下，鱼类眼球细胞组织破坏不充分，有效成分的溶出效率下降，在压力条件为3000MPa以上的高压力条件或提取时间为60分钟以上的情况下，提取中消耗的能量效率下降，因此优选在上述范围进行提取，为了有效地消除氢结合、电结合、范德华力结合等弱结合，优选在40-90℃温度条件执行。另外，超高压提取时，pH不限于特定pH，但优选将超高压机内容物的pH降低到1～6进行处理。使pH处于上述范围内的情况下，有效成分的溶出效率增大。
另外，本发明如上所述优选利用从精制水、甲醇、乙醇、甘油、乙酸乙酯、丁二醇、丙二醇、二氯甲烷、己烷及其混合物选择的提取溶剂，将经过超高压处理的鱼类的眼球提取物进行回流提取、冷浸之后，进行过滤，将过滤后的过滤液转送到浓缩槽，在50℃以下进行加压浓缩及冻结干燥。
本发明的用于治疗眼球干燥症的组合物根据本领域技术人员容易地实施的方法，利用药剂学上允许使用的载体和/或赋型剂来制剂化，可以采用单位容量方式制作，也可以装入大容量容器中制造。
此时，以全部组合物为基准，上述鱼类眼球提取物含量为0.01-10％(w/v)，在小于0.01的情况下，不能充分实现眼球干燥症治疗效果，在10％(w/v)以上的情况下，眼球干燥症治疗效果增加微小，所以优选上述范围。
在本发明的用于治疗眼球干燥症的组合物中，粘度的设定根据药理活性物质的种类、药物中浓度、眼球内的电解质的浓度及其用途的不同，理想的组合物的量及投药范围有所不同。为了减轻由眼球上的手术或异物造成的损伤治愈及外部物质炎症或过敏性免疫反应，优选相对地为中、高浓度的药物，投药次数根据所要治疗的眼球干燥症的重症度而有所不同，但是通常一天(例如、24小时)向眼球点滴2次-4次。
另外，本发明的用于治疗眼球干燥症的组合物还可以包含选自由抗炎症性药物及类固醇系或非类固醇系消炎性药物组成的组中的1种以上。
作为在本发明中能够使用的消炎性药物，包括***(dexamethasone)、氟米龙(fluorometholone)、***龙(prednisolone)、溴芬酸(bromfenac)、双氯芬酸(diclofenac)、氟布洛芬、酮咯酸、及其盐等。优选上述消炎性药物是选自由***0.01-2.0％(w/v)、氟米龙0.01-2.0％(w/v)、***龙0.01-5.0％(w/v)、溴芬酸0.001-1.0％(w/v)、双氯芬酸0.05-1.0％(w/v)、氟布洛芬(Flurbiprofen)0.005-0.5％(w/v)、酮咯酸0.005-1.0％(w/v)、及其盐组成的组中的1种以上，更优选使用氟米龙和双氯芬酸。
另一方面，本发明的组合物还可以另外含有选自由保存剂、等张化剂、稳定剂、缓冲剂及pH调节剂组成的组中的1种以上的辅助剂。
上述辅助剂是本发明所属的技术领域中通常使用的，根据各自的目的而不同，没有特别限定，根据眼科用组合物的一般性pH、渗透压及粘度的范围来决定。但是，考虑到给有效成分带来的影响，以全部组合物为基准，辅助剂的含量为0.001-20％(w/v)，优选含量为0.01-10％(w/v)。
另外，眼泪中含有高分子物质和糖蛋白质类、无机物类(vitamine等)和无机盐类，与相当于生理食盐液的0.9％(w/v)氯化钠溶液的渗透压相同。本发明的眼药水用组合物优选调整为在投入到眼球中时生理盐水的渗透压在290mOsmol/kg附近，其范围为270-310mOsmol/kg。
本发明中使用的用于治疗眼球干燥症的组合物的渗透压调节物质是选自由D-山梨糖醇、甘油、浓缩甘油、已六醇及麦芽糖醇糖浆及离子性物质组成的组中的一种以上，其组成比在使用一种等张化剂时相对于负载的重量比为0.5-20％程度，优选为1-10％。
尤其，为了将天然高分子调整成水性眼药水组成而添加的稳定剂，使用选自由乙酸钠0.05-0.2％(w/v)及ε-氨基己酸0.01-0.05％(w/v)、无水磺酸钠0.01-0.2％(w/v)、抗坏血酸(ascorbicacid)0.02-0.5％(w/v)、枸椽酸0.3-2.0％(w/v)等组成的组中的1种以上。
在本发明中，作为保存剂，可以使用选自由苯扎氯铵(benzalconiumchloride)0.002-0.1％(w/v)、溴棕三甲铵(cetrimide)0.002-0.01％(w/v)、硫柳汞(thimerosal)0.001-0.01％(w/v)、氯丁醇0.25-0.5％(w/v)、聚六亚甲基双胍0.002-0.1％(w/v)、对氧基苯甲酸烷基甲酯、对氧基苯甲酸乙酯、对氧基苯甲酸丙酯或对氧基苯甲酸丁酯(para-oxybenzoatesbutyl)0.001-0.05％(w/v)、二氢醋酸0.001-0.1％(w/v)、氯化甲酚(chlorocresol)0.0001-0.05％(w/v)、及氯己定(chlorohexidine)0.001-0.01％(w/v)组成的组中的1种以上。
另一方面，向视网膜传递光的路径中，作为透明的组织的眼角膜在光的折射和传递中发挥主要作用，眼角膜是不存在血管、但具有丰富的神经分布的组织。眼角膜细胞的生长从基底细胞(basal cell)分化为表面细胞(superficial cell)，在正常眼球的情况下，直至表面细胞的脱落需要经过约1～2周。眼前段外伤(anterior segmenttrauma)的发生分布主要以眼角膜、眼皮为对象，其原因分为化学性损伤、物理性损伤，物理性损伤分为由外部异物造成的损伤和由手术导致的损伤。
眼角膜上皮(corneal epithelium)的脱落主要以表面细胞和翼细胞层为对象，相邻的上皮细胞滑动而将上皮缺损部位覆盖，通过基底细胞的有丝***来治愈。在这种治愈机理中，炎症反应是白血球通过缘部侵入损伤部位而引起的，作为抑制过度的炎症反应的药物，使用类固醇系。通常，类固醇系伤治愈滴眼液，在初期使用10天能够减少炎症细胞浸润的同时，阻止蛋白质分解酶的游离，但是在经过10天以上伤仍未治愈的情况下，持续投入类固醇系伤治愈剂的话，助长阿胶纤维的破坏，抑制损伤部位回复过程，会导致眼角膜基质层坏死。尤其，长期使用时，会引发绿内脏或白内脏、细菌性结膜炎等。
使用将本发明的鱼类眼球提取物作为用于治疗眼睛的药理活性物质(有效成分)包含的眼药水用组合物时，通过形成对与角结膜上皮细胞的损伤部位结合性良好的胶，从而能够保护眼球内的组织、尤其眼角膜上皮细胞层，能够诱导生长促进，并促进细胞的纤维蛋白(Fibrin)生成，从而能够促进眼球损伤部位的组织生成，有助于恢复损伤部位。
而且，包含本发明的鱼类眼球提取物作为有效成分的眼药水用组合物具有对角结膜上皮障碍的预防或治疗效果。作为能够减少现有的类固醇剂或非类固醇剂药物的长期使用引起的副作用的角结膜上皮障碍症药物具有特殊的价值。
发明效果
根据本发明，能够提供一种可应用于皮肤化妆料且对人体无害而安全性优异的鱼类眼球的粉碎物或提取物。
另外，本发明利用鱼类眼球的粉碎物或提取物，能够提供一种皮肤美白效果、皮肤保湿效果、皮肤弹性改善效果非常优异的化妆料组合物。
另外，本发明利用鱼类眼球的粉碎物或提取物，能够提供一种细胞活化效果优异、皮肤再生及损伤治愈功效卓越、刺激缓解效果也非常显著的化妆料组合物。
另外，本发明提供一种通过诱导在肠相关淋巴组织中产生的免疫耐受，从而能够在无副作用的情况下，有效地抑制在关节上特异性产生的自我免疫反应及炎症，从而能够预防及治疗关节炎的组合物。
另外，本发明提供包含鱼类眼球提取物的眼药水用组合物，从而能够制造对由眼球内小伤和小手术、化学性损伤引起的伤具有优异的治愈效果的用于治疗眼球干燥症的药物。
附图说明
图1是示出利用诱导了AIA(adjuvant induced arthritis：佐剂性关节炎)的大老鼠对本发明的包含鱼类眼球提取物作为有效成分的组合物的关节炎预防功效进行分析的结果的图。
图2是示出利用诱导了AIA的大老鼠对本发明的包含鱼类眼球提取物作为有效成分的组合物的关节炎治疗功效进行分析的结果的图。
图3是针对本发明的包含鱼类眼球提取物作为有效成分的组合物的关节炎治疗功效，示出与各个组合物、本发明的混合组合物及关节炎治疗剂(甲氨蝶呤：MTX)比较的试验结果。
图4是利用混合淋巴对本发明的包含鱼类眼球提取物作为有效成分的组合物的促炎症(proinflammatory)细胞因子的表达带来的影响以实时PCR方法进行分析的结果。
图5是利用关节周围混合淋巴球来对包含本发明的鱼类眼球提取物作为有效成分的组合物的细胞繁殖进行分析的结果。
图6是示出利用诱导了AIA(adjuvant induced arthritis)的大老鼠对本发明的包含鱼类眼球粉碎物作为有效成分的组合物的关节炎预防功效进行分析的结果的图。
图7是示出利用诱导了AIA的大老鼠对本发明的包含鱼类眼球粉碎物作为有效成分的组合物的关节炎治疗功效进行分析的结果的图。
图8是针对本发明的包含鱼类眼球粉碎物作为有效成分的组合物的关节炎治疗功效，示出与各个组合物、本发明的混合组合物及关节炎治疗剂(甲氨蝶呤：MTX)比较的试验结果。
图9是利用混合淋巴球针对本发明的包含鱼类眼球粉碎物作为有效成分的组合物的促炎症(proinflammatory)细胞因子的表达带来的影响以实时PCR方法进行分析的结果。
图10是利用关节周围混合淋巴球来对本发明的包含鱼类眼球粉碎物作为有效成分的组合物给细胞繁殖产生的影响进行分析的结果。
图11是示出在添加了本发明的包含鱼类眼球提取物的组合物之后随着时间推移的寒天培养基的水分蒸发量的图。
图12是示出本发明的包含鱼类眼球提取物的组合物在眼角膜上皮损伤诱发后随时间经过的损伤宽度比的图。
具体实施方式
下面，针对本发明更详细地说明实施例，但是本发明的权利保护范围不限于下述实施例，还包括与其等效的技术思想的变形。
实施例1、6：金枪鱼或鲭鱼眼球的粉碎物制造
将新鲜的金枪鱼或鲭鱼速冷之后，与肉质分离而获取眼球，进行了冷冻。将冷冻的金枪鱼眼球用均化器均匀地粉碎。
实施例2、7：金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物制造
将新鲜的金枪鱼或鲭鱼速冷之后，将与肉质分离而获取的冷冻眼球用70％乙醇水溶液于100～120℃提取2～3小时。
实施例3、8：金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物制造
将新鲜的金枪鱼或鲭鱼速冷之后，对与肉质分离而获取的冷冻眼球，用超高压处理机在压力1000MPa下将温度升温到50℃，处理30分钟之后，冷却到室温。将经过超高压处理的金枪鱼眼球提取物，利用精制水进行3次各5个小时的回流提取，进行冷浸之后，用沃特曼(whatman)#10滤纸进行了过滤。将这样获得的过滤液再次用0.25uM的过滤机进行最终过滤。将完成过滤而获得的过滤液转送到浓缩槽，在50℃以下加压浓缩及冻结干燥。使用精制水、乙醇、丁二醇、丙二醇中的1种以上的溶剂，将得到的加压浓缩物及冻结干燥物以0.001～70.0重量百分比的含量溶解，制备出最终提取物。
实施例4、9：金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物制造
将经过超高压处理的金枪鱼眼球提取物利用70％(v/v)乙醇水溶液进行回流提取，除此之外，采用与上述实施例3、8相同的方式制造了金枪鱼眼球的提取物。
实施例5、10：金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物制造
将经过超高压处理的金枪鱼眼球提取物利用30％(v/v)丁二醇进行回流提取，除此之外，采用与上述实施例3、8相同的方式制造了金枪鱼眼球的提取物。
比较例1：牛眼球的粉碎物的制造
除了替代金枪鱼或鲭鱼而使用牛眼球之外，采用与上述实施例1相同的方式制造了牛眼球的粉碎物。
比较例2：牛眼球的提取物的制造
除了替代金枪鱼或鲭鱼而使用牛眼球之外，采用与上述实施例2相同的方式制造了牛眼球的提取物。
比较例3：牛眼球的提取物的制造
除了替代金枪鱼或鲭鱼而使用牛眼球之外，采用与上述实施例3相同的方式制造了牛眼球的粉碎物。
比较例4：牛眼球的提取物的制造
除了替代金枪鱼或鲭鱼而使用牛眼球之外，采用与上述实施例4相同的方式制造了牛眼球的粉碎物。
比较例5：牛眼球的提取物的制造
除了替代金枪鱼或鲭鱼而使用牛眼球之外，采用与上述实施例5相同的方式制造了牛眼球的粉碎物。
试验例1：利用B16F1黑素细胞进行的黑色素生成抑制效果测定
本试验例为了确认在上述实施例1-10及比较例1-5中取得的粉碎物或提取物的美白效果，测定了针对B16F1黑素细胞的黑色素生成抑制程度。
本试验例中使用的B16F1黑素细胞是来自小老鼠的细胞菌株，是由称之为麦拉宁的黑色素分泌的细胞。在该细胞的人工培养中对试样进行处理，比较评价了麦拉宁黑色素减少程度。本试验例中使用的B16F1黑素细胞是从ATCC(American TypeCulture Collection，保藏号：6323)分让使用的。
B16F1黑素细胞的黑色素生物合成抑制效果测定采用如下方法执行。在6-孔板(well-plate)中，对各个孔以2x106浓度分别注入B16F1黑素细胞，在附着细胞之后，以不会诱发毒性的浓度对试样进行处理，培养72小时。采用trypsin-EDTA，将培养了72小时后的细胞取走之后，测定细胞水，进行离心分离，将细胞回收。
细胞内黑色素的定量通过对罗腾(Lotan：CancerRes.，40：3345-3350，1980)方法进行变形来实施。用PBS对细胞聚合体(cell pellet)进行1次清洗后，添加1ml的均化缓冲液(50mM磷酸钠，pH6.8，1％Triton X-100、2mM PMSF)，实施5分钟涡流，将细胞粉碎。在经过离心分离(3000rpm，10分钟)后得到的细胞滤液中加入1N NaOH(10％DMSO)，然后将提取的黑色素溶解，利用酶标仪(microplatereader)在405nm下测定黑色素的吸光度，对黑色素进行定量，测定试样的黑色素生成抑制率(％)。B16F1黑素细胞的黑色素生成抑制率(％)通过数学式1计算，IC50值是将黑色素生成降低50％的物质的浓度。
【数学式1】
抑制率(％)＝[(A-B)/A]×100
A：未添加试样的孔中的黑色素量
B：添加了试样的孔中的黑色素量
对B16F1黑素细胞的黑色素生成抑制效果进行试验的结果示于下述表1。
【表1】
黑色素生成抑制效果(IC50)
实施例1(金枪鱼眼球的粉碎物) 0.30
实施例2(金枪鱼眼球的提取物) 0.31
实施例3(金枪鱼眼球的提取物) 0.38
实施例4(金枪鱼眼球的提取物) 0.25
实施例5(金枪鱼眼球的提取物) 0.32
实施例6(鲭鱼眼球的粉碎物) 0.35
实施例7(鲭鱼眼球的提取物) 0.34
实施例8(鲭鱼眼球的提取物) 0.40
实施例9(鲭鱼眼球的提取物) 0.33
实施例10(鲭鱼眼球的提取物) 0.36
比较例1(牛眼球的粉碎物) 0.51
比较例2(牛眼球的提取物) 0.50
比较例3(牛眼球的提取物) 0.75
比较例4(牛眼球的提取物) 0.42
比较例5(牛眼球的提取物) 0.55
清蛋白 0.33
如上述表1所示，金枪鱼或鲭鱼眼球的粉碎物或提取物相比于牛眼球的粉碎物或提取物显示出非常高的黑色素生成抑制效果，并且显示出与作为现有的美白剂的清蛋白同等以上的黑色素生成抑制效果。
试验例2：体外进行的MMP-1抑制试验
在本试验例中，针对上述实施例1-10、比较例1-5的粉碎物或提取物，在生物化学性模型中测定基质金属蛋白酶(MMP-1)抑制活性，它是以利用与精制的胶原酶及作为其基质的荧光素接合的胶原蛋白和明胶为基础(EnzChek(商标名)明胶酶/胶原酶检测试剂盒，Molecular Probes)。
将由溶组织梭菌精制的胶原酶供给到上述EnzChek(商标名)明胶酶/胶原酶检测试剂盒。由从猪皮肤精制而结合到荧光素上的DQ-胶原蛋白和0.05M3-HCl，0.15MNaCl，5mM CaCl2及0.2mM钠叠氮化物(pH7.6)形成的反应缓冲液利用了EnzChek(商标名)明胶酶/胶原酶检测试剂盒(Molecular Probes)。将上述实施例1-10、比较例1-5的粉碎物或提取物溶解于上述反应缓冲液。在0.02；0.04％(w/v)下对其进行了测试。测试的稀释液与25ug/ml的DQ-胶原蛋白及0.1U/ml的胶原酶一起在室温下进行了15分钟、45分钟、120分钟的恒温处理。
在各个试验条件下，对与胶原酶和DQ-胶原蛋白混合物相应的对比用混合物(control)进行相同的恒温处理。
另外，在各个试验条件下，Blank、下面称之为“不含酶的blank”的样品在DQ-胶原蛋白的存在及胶原酶的不在下进行了恒温处理。各个试验执行3次。
经过15分钟、45分钟、120分钟之后，利用荧光测定机(激发：485nm、放出505nm)测定了与DQ-胶原蛋白的分解相应的信号。
以不含酶的blank’荧光值为基准，测定各个样品的荧光值。结果以每个样品的荧光单位及相对于对比组的变异率(％)表示。
【表2】
根据上述表2，在0.02、0.04％(v/v)下测试的眼球的粉碎物或提取物根据投药量依赖性维持抗胶原酶/明胶酶活性。另外，金枪鱼或鲭鱼眼球的粉碎物或提取物以0.04％进行处理时，抑制了各个梭菌胶原酶的胶原蛋白分解活性的约52％～68％，由此确认到比绿茶提取物的抑制效果更加优异。
试验例3：紫外线照射后的MMP-1表达抑制评价
在本试验例中，为了对上述实施例1-10及比较例1-5的粉碎物或提取物进行UV照射及试样添加后测定MMP-1浓度，实施了ELISA。
利用UV室，对人真皮纤维原细胞以5J/cm2的能量照射UVA。紫外线照射量和培养时间通过预备试验来确立在纤维原细胞中MMP表达量达到最大的条件。阴性对比组用银箔纸包裹，在UVA的环境下保持相同时间。UVA放出量利用UV辐射仪进行测定。UVA照射期间的细胞是之前分注的培养基原样，在照射UVA之后，交换成加入了样品的培养基，培养24小时，将培养基回收，涂布到96-孔板上。对一次抗体(MMP-1(Ab-5)单克隆抗体和MMP-2(Ab-3)单克隆抗体)进行处理，在37℃下反应60分钟。作为二次抗体的抗鼠IgG(whole mouse,alkaline phosphatase conjugated)再次反应60分钟左右之后，将碱性磷酸酶基质溶液(1mg/mlρ-nitrophenyl phosphate indiethanolamine缓冲溶液)在常温下反应30分钟，用酶标仪在405nm下测定吸光度。在对比组中，不添加试样。
【表3】
处理浓度(％) MMP-1表达抑制率(％)
实施例1(金枪鱼眼球的粉碎物) 0.1 20
实施例2(金枪鱼眼球的提取物) 0.1 21
实施例3(金枪鱼眼球的提取物) 0.1 18
实施例4(金枪鱼眼球的提取物) 0.1 24
实施例5(金枪鱼眼球的提取物) 0.1 21
实施例6(鲭鱼眼球的粉碎物) 0.1 20
实施例7(鲭鱼眼球的提取物) 0.1 21
实施例8(鲭鱼眼球的提取物) 0.1 16
实施例9(鲭鱼眼球的提取物) 0.1 23
实施例10(鲭鱼眼球的提取物) 0.1 20
比较例1(牛眼球的粉碎物) 0.1 13
比较例2(牛眼球的提取物) 0.1 14
比较例3(牛眼球的提取物) 0.1 11
比较例4(牛眼球的提取物) 0.1 16
比较例5(牛眼球的提取物) 0.1 14
松香油 0.1 21
对比组 - -
如上述表3所示，针对照射紫外线时表达诱导的MMP-1，与未对试样进行处理的对比组相比，金枪鱼或鲭鱼眼球的粉碎物或提取物显示出高抑制率，这是作为阳性对比组使用的松香油的抑制率同等以上的结果。
试验例4：基于紫外线照射的细胞毒性缓解效果
本试验例是为了对上述实施例1-10、比较例1-5的粉碎物或提取物在紫外线照射下的细胞毒性的缓解效果进行评价而实施。
在24-孔试验板中分别放入1x105个纤维原细胞(fibroblast)，附着24小时。用PBS对各孔清洗1次，在各孔中加入500ul的PBS。利用紫外线B(UVB)灯(Model：F15T8、UV B 15W，SankyoDennki公司,Japan)对纤维原细胞以10mJ/cm2照射紫外线，除去PBS，添加1Ml细胞培养基(在DMEM中添加了10％FBS)。对在此想要评价的眼球超高压提取物进行处理之后，培养了24小时。经过24小时后，除去培养基，在各个孔中加入500μl的细胞培养基和60μlMTT溶液(2.5㎎/Ml)之后，在37℃CO2培养基下培养了2小时。去除培养基，分别加入500μl异丙醇-HCl(0.04N)。摇动5分钟而将细胞溶解之后，将上清液各100μl移入96-孔试验板，利用酶标仪测定了565nm吸光度。通过数学式2来计算细胞生存率(％)，基于紫外线的细胞毒性缓解率通过数学式3计算。
【数学式2】
细胞生存率(％)＝[(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100
Bo：只使细胞培养基进行发色反应时的孔的565nm吸光度
Bt：使未对试样进行处理的孔进行发色反应时的孔的565nm吸光度
St：使对试样进行了处理的孔进行发色反应时的孔的565nm吸光度
【数学式3】
基于紫外线的细胞毒性缓解率(％)＝[1-(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100
Bo：未照射紫外线且未处理试样时的孔的细胞生存率
Bt：照射紫外线但未处理试样时的孔的细胞生存率
St：照射紫外线且处理试样时的孔的细胞生存率
【表4】
如上述表4所示，金枪鱼或鲭鱼眼球的粉碎物或提取物将由紫外线引起的细胞毒性从0.02％浓度缓解50～62％左右，能够在低浓度下有效地防御由紫外线引起的细胞毒性。
试验例5：利用了细胞培养技术的刺激缓解效果评价
在本试验例中，为了评价上述实施例1-10、比较例1-5的粉碎物或提取物的皮肤刺激缓解效果，利用细胞培养技术，以抑制由作为引发皮肤刺激的物质的十二烷基硫酸钠(Sodium Lauryl Sulfate；SLS)造成细胞死亡的程度，评价刺激缓解效果。
SLS是作为化妆品基材的皮肤刺激评价的基准的物质，与细胞膜结合，抑制细胞代谢并破坏细胞膜，引发皮肤刺激。
在本试验例中，向人纤维原细胞同时添加SLS和超高压眼球提取物，对减少由SLS造成的细胞死亡的效果进行评价。
在本试验例中使用的Hs68纤维原细胞是人的皮肤真皮细胞，从ATCC(AmericanType Culture Collection，保藏号：1635)受让使用。
利用了细胞培养技术的刺激缓解评价试验采用如下方式进行。
将来自人体的纤维原细胞以1×105浓度分注到96孔板培养基中，培养了24小时之后，对0.002％SLS单独进行处理，以及对0.002％SLS和上述实施例1-10、比较例1-5的粉碎物或提取物0.1％同时进行处理，再次培养了24小时。培养后添加MTT(Sigma)试剂，培养4小时，然后去除培养液，加入1N NaOH/异丙醇溶液，搅拌20分钟，用吸光光度仪在565nm下测定吸光度，测定超高压眼球提取物抑制由SLS造成的细胞死亡的效果，示于表5。
【表5】
试样名 纤维原细胞生存率(％)
0.002％SLS 41
0.002％SLS+实施例1(金枪鱼眼球的粉碎物) 76
0.002％SLS+实施例2(金枪鱼眼球的提取物) 77
0.002％SLS+实施例3(金枪鱼眼球的提取物) 74
0.002％SLS+实施例4(金枪鱼眼球的提取物) 80
0.002％SLS+实施例5(金枪鱼眼球的提取物) 77
0.002％SLS+实施例6(鲭鱼眼球的粉碎物) 75
0.002％SLS+实施例7(鲭鱼眼球的提取物) 75
0.002％SLS+实施例8(鲭鱼眼球的提取物) 72
0.002％SLS+实施例9(鲭鱼眼球的提取物) 78
0.002％SLS+实施例10(鲭鱼眼球的提取物) 75
0.002％SLS+比较例1(牛眼球的粉碎物) 69
0.002％SLS+比较例2(牛眼球的提取物) 70
0.002％SLS+比较例3(牛眼球的提取物) 66
0.002％SLS+比较例4(牛眼球的提取物) 73
0.002％SLS+比较例5(牛眼球的提取物) 70
如上述表5所示，金枪鱼或鲭鱼眼球的粉碎物或提取物能够有效抑制由SLS引发的细胞死亡，是与化妆料基材一起使用时能够减少由化妆料基材引起的皮肤刺激的刺激缓解物质。
实施例11、12及比较例6：化妆料制造
在本实施例中，利用由上述实施例4、9及比较例4取得的提取物，制造了化妆料。所制造的化妆料为霜形态，其组成如表6所示。
对表6中记载的“乙”栏物质进行加热而于70℃保存，在保存的“乙”栏物质中加入“甲”物质，进行预备乳化，用高速搅拌器(homomixer)均匀地乳化后慢慢冷却，制造了各种霜(实施例11、12及比较例6)。
【表6】
单位：重量百分比
试验例6：皮肤保湿效果测定
在本试验例中，针对上述实施例11、12、比较例6、参考例中制造的化妆料，以人为对象，通过比较试验来评价皮肤保湿效果。
以30名试验者(30年龄段-40年龄段的女性)为对象，在其中10人的面部右侧部位涂布由实施例11制造的霜，在面部左侧部位涂布由比较例6制造的霜，在另外10人的面部右侧部位涂布由实施例12制造的霜，在面部左侧部位涂布由比较例6制造的霜，在剩余的10人的面部右侧部位涂布由参考例制造的霜，在面部左侧部位涂布由比较例6制造的霜，一天2次，连续涂布4周。利用Corneometer，在产品涂布前(0周)、产品涂布2周后、涂布4周后，分别测定了被试验人的试验部位的保湿效果。参与4周试验的被试验人均未出现异常反应。
Corneometer测量将探针(Probe)接触到皮肤表面时传导到内置于探针头(probe的head)的传感器的微小的电流容量(Capacitance)，示出含水量的数值，测定到的数值越高，表示皮肤的水分含量越多。
表7是使用了由实施例11、12、比较例6及参考例制造的霜的被试验人的皮肤保湿结果。
【表7】
n＝30，p＜0.05
皮肤保湿改善率通过数学式4来计算，结果如表8所示。
【数学式4】
皮肤保湿改善率＝[(B-A)/A]×100
A：0天保湿测定结果
B：2，4周保湿测定结果
【表8】
n＝30，p＜0.05
由上述表8可知，金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物具有比牛眼球的提取物优异的皮肤保湿效果。
试验例7：皮肤弹性改善效果的评价
在本试验例中，针对上述实施例11、12及比较例6的霜，如下评价人体的皮肤弹性改善效果。
以30名试验者(30年龄段-40年龄段的女性)为对象，在其中15人的面部右侧部位涂布由实施例11制造的霜，在面部左侧部位涂布由比较例6制造的霜，在剩余的15人的的面部右侧部位涂布由实施例12制造的霜，在面部左侧部位涂布由比较例6制造的霜，一天2次，连续涂布2个月，完成试验。皮肤弹性改善效果是利用皮肤弹性测定机(cutometer SEM 575，C+K Electronic Co.，Germany)测定产品使用前和使用2个月后的皮肤弹性。试验结果在下述表9中作为Cutometer SEM 575的ΔR8值记载，R8值表示皮肤的粘弹性(viscoelasticity)的性质。
【表9】
试样名 皮肤弹性效果(ΔR8)
实施例11 0.37
实施例12 0.35
比较例6 0.23
n＝30，p＜0.05
如上述表9所示，金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物的皮肤弹性改善效果远远优于牛眼球的提取物。
试验例8：在皮肤全层缺损模型中的伤治愈效果
在本试验例中，针对实施例11、12及比较例6的霜，以试验用鼠为对象，执行对比试验，评价了在皮肤全层缺损模型中的伤治愈效果。
按日期，将5只老鼠，随机按体重分组，在试验第一天制作了全层缺损创伤模型。创伤引发通过对试验动物的腹部沿着手术者视线从左侧上方向下方依次指定创伤1、2，从右侧上方至下方指定创伤3、4。
在试验用鼠的腹部弄出横、竖各10mm的皮肤全层缺损伤，贴上试验物质Patch，在1、3、7、9、14天测定各个创伤收缩率，评价了皮肤全层缺损创伤模型中的治愈效果。
如表10所示分组并投入试样。
【表10】
试样名 投药用量 动物别适用部位
对比组 Blank patch full-thickness wound1
阳性对比组(积雪苷) 500mg/cm2 full-thickness wound2
实施例11 500mg/cm2 full-thickness wound3
实施例12 500mg/cm2 full-thickness wound4
比较例6 500mg/cm2 full-thickness wound5
为了将创伤治愈效果定量化，将初始创伤面积设为100，在14天的剖检组中，将1天后、第3、7、9、11、14天的创伤面积数字图像化，求出创伤收缩率。创伤收缩率通过数学式5来计算，结果示于表12。
【表11】
单位：cm2，n＝5，p＜0.05
【数学式5】
创伤收缩率＝[(B-A)/A]×100
A：1天创伤面积测定结果
B：4、7、9、11、14天创伤面积测定结果
【表12】
n＝5，p＜0.05
如上述表11、12所示，测定创伤诱发后14天期间的创伤收缩率的结果，所有创伤在试验期间(14天)均通过创伤面积收缩而创伤面积逐渐减小，包含实施例11、12的金枪鱼或鲭鱼眼球的提取物的霜相比于包含牛眼球的提取物的霜和阳性对比组，创伤面积减少明显。
实施例1’：鱼类眼球提取物制造
将新鲜的金枪鱼速冷，将鱼类眼球与肉质分离后备好。用盐水将准备好的鱼类眼球清洗干净，利用均化器均匀粉碎，由此准备了鱼类眼球粉碎物。
将这样准备的鱼类眼球粉碎物放入超高压处理机(Ilshin autoclave,Korea)中，在压力1000MPa下，将温度升温至50℃，处理30分钟之后，冷却到室温。
向超高压处理后的金枪鱼眼球提取物分别添加精制水(实施例1’-1)、最终70％(V/V)乙醇水溶液(实施例1’-2)、最终30％(V/V)butyleneglycol(实施例1’-3)，回流提取3次各5小时，冷浸后，用沃特曼(whatman)10号滤纸进行过滤。将这样获得的过滤液，再次利用0.25uM的过滤机进行最终过滤，再次于50℃下进行加压浓缩及冻结干燥。向这样制造的加压浓缩物及冻结干燥物10g，分别作为溶剂添加精制水100g、乙醇100g、丁二醇100g，最终制造出金枪鱼眼球提取液。
除了替代金枪鱼眼球而使用鲭鱼及牛眼球之外，采用与上述金枪鱼眼球提取液制造方法相同的方法，制造了鲭鱼眼球提取液(实施例1’-4-1’-6)及牛眼球提取液(比较例1’-1～1’-3)。
【表13】
眼球种类 提取溶剂
实施例1’-1 金枪鱼 精制水
实施例1’-2 金枪鱼 70％乙醇
实施例1’-3 金枪鱼 30％丁二醇
实施例1’-4 鲭鱼 精制水
实施例1’-5 鲭鱼 70％乙醇
实施例1’-6 鲭鱼 30％丁二醇
比较例1’-1 牛 精制水
比较例1’-2 牛 70％乙醇
比较例1’-3 牛 30％丁二醇
试验例1’：本发明的组合物的关节炎预防及治疗功效分析
胶原蛋白诱导关节炎(collagen induced arthritis：CIA)动物模型是由作为关节构成成分的II型胶原蛋白诱导的关节炎，在病理学、临床学、免疫学上，从多个侧面与人的风湿病关节炎类似。该动物模型通过具备胶原蛋白特异性免疫反应的T细胞和胶原蛋白等对自我抗原的抗体而显示出自我免疫疾病。
佐剂诱导关节炎(adjuvant induced arthritis：AIA)动物模型是由不是自我抗原的结核菌诱导的关节炎，显示出慢性关节炎的病理学状态。作为自我抗原作用的正确缘由尚不明确，但是通过免疫反应T细胞，显示出与关节的炎症或组织破坏相同的自我免疫疾病。该动物模型与人身体上自然产生的关节炎类似。
风湿病关节炎的直接原因尚不明确，利用这2种动物模型进行试验，从而能够更加有效地评价功效。
试验例1’-1：胶原蛋白诱导关节炎动物模型的制造
胶原蛋白诱导关节炎(collagen induced arthritis，CIA)动物模型通过注入作为风湿病关节炎的原因的胶原蛋白并采用如下方式制造。
将鸡的II型胶原蛋白(Sigma)4mg混合到100mM乙酸1ml中，在4℃下溶解一天。将其混合到包含结核菌(Mycobacterium tuberculosis)4mg/ml的费氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，DIFCO)1ml中，乳化之后，将150μl(300μg)皮内注射到6-8周龄的Lewis大老鼠的尾巴部位，进行了免疫。1次免疫后的第7天，将鸡的II型胶原蛋白4mg混合到100mM乙酸1ml中，在4℃下溶解一天，混合到费氏非完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，DIFCO)1ml中，进行了乳化。将上述乳液的150μl(300μg)皮内注射到尾巴部位中，诱导2次免疫(boosting)反应，将2次免疫后，经过1-2周，逐渐开始显现出作为关节炎症状的红斑。
试验例1’-2：佐剂诱导关节炎动物模型的制造
佐剂诱导关节炎(adjuvantinducedarthritis，AIA)动物模型是显现出与人的风湿病关节炎类似的病例特性的动物模型，与胶原蛋白诱导关节炎动物模型一样使用广泛。
用粉碎机将结核菌10mg粉碎成粉末状态之后，混合到1ml的费氏非完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，DIFCO)，将其中的100μl(1mg)皮内注射到6-8周龄的Lewis大老鼠的尾巴部位。免疫后经过1周，关节炎症状开始逐渐显现。
试验例1’-3：本发明的组合物的关节炎预防及治疗功效分析
从免疫反应诱导次日起，每天利用食饵用托架，经口投入试验物质。每组选择10只Lewis大老鼠，一组利用佐剂诱导关节炎动物模型，每天投入粉末状态的饲料和实施例及比较例的混合物25g(11.5g/kg)，另一组作为阴性对比组使用只投入了粉末饲料的佐剂诱导关节炎动物模型。然后，测定关节部位肿胀(jointswelling)、关节的浮肿程度(pawthickness)、红斑等能够通过肉眼看到的关节炎的进行程度、体重变化推移，对各个组进行了比较。
为了确认关节炎预防效果，经口投入实施例及比较例的组合物之后，在经过2周的时刻，实施AIA诱导免疫化反应。试验实施共9周。另外，为了确认关节炎治疗效果，实施AIA诱导1次免疫化反应之后，立即经口投入实施例1的组合物。试验实施了共9周。每组利用了10只大老鼠。
观察各个组的大老鼠的各个脚关节和指关节的浮肿程度、红斑等，根据表14和表15中记载的评分指数(scoringindex)，计算临床分数。
【表14】
分数 病的经过状态
0 未显现红斑和浮肿
1 脚中间部分或脚脖关节上出现红斑且有点浮肿
2 从脚脖关节到脚中间部分遍布红斑且有点浮肿
3 从脚脖关节到中足骨关节遍布红斑和中等程度的浮肿
4 脚脖、脚、脚趾均出现红斑且严重浮肿
【表15】
由示出针对关节炎预防效果的试验结果的图1的临床分数可知，阴性对比组作为佐剂诱导关节炎模型，诱导了免疫反应之后，从约2周起开始显现关节炎症状，经过约4周后，症状逐渐减弱。在投入了本发明的组合物的实施例1’-1～1’-6组中，与对比组相比，症状得到了很大程度的抑制，与阴性对比组相比，脚的浮肿得到很大程度的抑制。这种抑制效果在投入了牛眼球提取物的比较例1’-1～1’-3组中明显减缓。包含本发明的鱼类眼球提取物的组合物对关节炎发挥出优异的预防功效。
由示出针对关节炎治疗效果的试验结果的图2的临床分数可知，对比组作为佐剂诱导关节炎模型，在诱导了免疫反应之后，从约2周起开始显现关节炎症状，经过约5周后症状逐渐减轻。在投入了本发明的组合物的实施例1’-1～1’-6组中，能够看到关节炎症状得到了很大程度的抑制，脚浮肿也得到了很大程度的抑制。这样的抑制效果在投入了牛眼球提取物的比较例1’-1～1’-3组中并不明显。包含本发明的鱼类眼球提取物的组合物对关节炎发挥出优异的治疗功效。
试验例2’：关节炎治疗功效比较试验
利用了在上述试验例1’中已判断出功效优异的实施例1’-1及1’-4的组合物，更精密地分析了关节炎预防或治疗功效。
试验方法与上述试验例1’-3类似。各组分别利用了10只大老鼠。
阴性对比组是非投药组，投入给阳性对比组的MTX是以往作为关节炎治疗剂使用的甲氨蝶呤处理组，对每只大老鼠每周投入2次各60μg。
先经口投入2周各组合物，利用胶原蛋白诱导了1次免疫反应。一周后诱导2次免疫反应，测定临床分数及脚厚度，对各个组进行比较。由图3及图4可知，CIA诱导免疫反应后，从约20天起出现关节炎症状，到35天为止的急性阶段，MTX的效果比本发明的组合物显著，但是之后的慢性阶段(chronicphase)，相反本发明的组合物的治疗及预防功效更优异(图3)。
本发明的组合物能够发挥与现有的关节炎治疗剂即MTX相同或比其优异的关节炎治疗功效。
试验例3’：给促炎症、抗炎症细胞因子表达带来的影响分析(利用关节周围淋巴球)
与上述试验例2’相同地进行了关节炎治疗功效试验。在关节炎诱导免疫化反应后第75天，针对各试验组，将获得平均值的临床分数的大老鼠杀死，分离出位于关节周围的腘(popliteal)***和腹股沟浅(inguinal)***，将这些组织研磨(grinding)，获得混合淋巴球(mixed lymphocytes)。
然后，将混合淋巴球以5x106细胞/孔分注到24-孔板中，加入类型II胶原蛋白40μg/孔，刺激24小时。然后，收集细胞，在此对Trizol进行处理，获得总RNA。利用oligod Tprimer和Promega，由各试验组的RNA 1μg合成了cDNA。接着，将合成的cDNA作为模子，利用针对各细胞因子的10pmol的primer及SYBR premix，定量地实时实施PCR，分析和比较了细胞因子表达水准(图4)。定量性实时PCR是在95℃下孵化10分钟之后，经过95℃30秒、62℃30秒及72℃30秒的40次循环，在每次循环中进行了定量。
图4的数据是，对作为持家基因的β-肌动蛋白的值进行定量之后，将作为对比组的非处理组的值设为100时的相对值。能够确认到促炎症作为细胞因子的IL-12、TNF-α及IL-1β的表达量在本发明的组合物的投药组中较低。尤其，在IL-12及IL-1β的情况下，本发明的组合物投药组相比于阴性对比组，表达减少50％以上。另外，观看具备抗炎症功能的Foxp3、IL-10及TGF-β的表达量，本发明的组合物投药组比对比组高。
而且，通过本发明的组合物，在关节周围的淋巴球中诱导了经口免疫耐受。尤其，不仅作为调节T细胞标记的Foxp3的表达量增加，具备抑制(suppression)功能的作为细胞因子的TGF-β的表达量也大幅度增加。
综合以上结果可知，在与关节炎直接相关的关节周围的***中，本发明的组合物诱导经口免疫耐受，增加了Foxp3、IL-10及TGF-β这类的抗炎症细胞因子的表达量，抑制了IL-12、TNF-α及IL-1β这类的促炎症细胞因子的表达量。
试验例4’：细胞繁殖分析
与上述试验例2’相同地进行了关节炎治疗功效试验。在关节炎诱导免疫化反应后第75天，针对各试验组，将获得平均值的临床分数的大老鼠杀死，分离出位于关节周围的腘(popliteal)***和腹股沟浅(inguinal)***，将这些组织研磨(grinding)，获得混合淋巴球(mixedlymphocytes)。
然后，将混合淋巴球以2x105细胞/孔分注到96-孔板中，加入类型II胶原蛋白40μg/孔，刺激56小时.
然后，加入0.5μCi[3H]胸苷(Perkin Elmer)，施加16小时脉动，测定了胸苷混入量(图5)。图5的数据是将阴性对比组设为10时的相对值。
由图5可知，在投入了本发明的组合物的组中，显示出最低的胸苷混入量。该结果推测为，在与关节炎直接相关的关节周围的***中，本发明的组合物诱导经口免疫耐受，最终针对胶原蛋白的免疫反应被大幅度抑制。
实施例1”：鱼类眼球粉碎物制造
将新鲜的金枪鱼速冷，将鱼类眼球与肉质干净地分离之后备好。将备好的鱼类眼球用盐水清洗干净，利用均化器均匀粉碎，用沃特曼(whatman)10号滤纸进行过滤。将这样获得的过滤液再次利用0.25uM的过滤机进行最终过滤，最终制造出金枪鱼眼球粉碎物(实施例1”-1).
替代金枪鱼眼球而使用鲭鱼及牛眼球，除此之外，使用与上述金枪鱼眼球粉碎物制造方法相同的方法，制造出鲭鱼眼球粉碎物(实施例1”-2)及牛眼球粉碎物(比较例1”)。
试验例1”：本发明的组合物的关节炎预防及治疗功效分析
试验例1”-1：胶原蛋白诱导关节炎动物模型的制造
胶原蛋白诱导关节炎(collageninducedarthritis,CIA)动物模型通过注入作为风湿病关节炎的原因知晓的胶原蛋白，采用如下方式制造。
将鸡的II型胶原蛋白(Sigma)4mg混合到100mM乙酸1ml中，在4℃下溶解一天。将其混合到包含结核菌(Mycobacterium tuberculosis)4mg/ml的费氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,DIFCO)1ml，进行乳化之后，向6-8周龄的Lewis大老鼠的尾巴部位皮内注射150μl(300μg)，进行了免疫。经过1次免疫后的第7天，将鸡的II型胶原蛋白4mg混合到100mM乙酸1ml中，在4℃下溶解一天，混合到费氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant,DIFCO)1ml中，进行了乳化。将上述乳液的150μl(300μg)皮内注射到尾巴部位，诱导2次免疫(boosting)反应，2次免疫后，经过1-2周，开始逐渐显现作为关节炎症状的红斑。
试验例1”-2：佐剂诱导性关节炎动物模型的制造
佐剂诱导性关节炎(adjuvant induced arthritis，AIA)动物模型也是显示出与人的风湿病关节炎类似的病例特性的动物模型，与胶原蛋白诱导关节炎动物模型一样使用广泛。
用粉碎机将结核菌10mg粉碎成粉末状态之后，混合到1ml的费氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，DIFCO)中。将其中的100μl(1mg)皮内注射到6-8周龄的Lewis大老鼠的尾巴部位中进行免疫。免疫后经过1周，逐渐显示出关节炎症状。
试验例1”-3：本发明的组合物的关节炎预防及治疗功效分析
从免疫反应诱导次日起，每天利用食饵用托架，经口投入试验物质。每组选择10只Lewis大老鼠，一组利用佐剂诱导关节炎动物模型，每天投入粉末状态的饲料和实施例及比较例的混合物25g(11.5g/kg)，另一组作为阴性对比组使用只投入了粉末饲料的佐剂诱导关节炎动物模型。然后，测定关节部位肿胀(joint swelling)、关节的浮肿程度(paw thickness)、红斑等能够通过肉眼看到的关节炎的进行程度、体重变化推移，对各个组进行了比较。
为了确认关节炎预防效果，经口投入实施例及比较例的组合物之后，在经过2周的时刻，实施AIA诱导免疫化反应。试验实施共9周。另外，为了确认关节炎治疗效果，实施AIA诱导1次免疫化反应之后，立即经口投入实施例1的组合物。试验实施了共9周。每组利用了10只大老鼠。
观察各个组的大老鼠的各个脚关节和指关节的浮肿程度、红斑等，根据表14和表15中记载的评分指数(scoring index)，计算临床分数。
观看示出针对关节炎预防效果的试验结果的图6的临床分数确认到，阴性对比组作为佐剂诱导性关节炎模型，在诱导了免疫反应后的约14天起，显示出关节炎症状，经过约28天时，症状逐渐减弱。在投入了本发明的组合物的实施例1”-1、1”-2组中，不同于对比组，评分非常低，能够看出关节炎症状得到了很大程度的抑制，相比于阴性对比组，脚的浮肿得到了很大程度的抑制。但是，在投入了牛眼球粉碎物的比较例1”组中，与阴性对比组之间未显示出大的差异，在经过了32天之后，相比于阴性对比组，关节炎症状变严重。由此可知，包含本发明的鱼类眼球粉碎物的组合物对关节炎具备优异的预防功效。
观看示出针对关节炎治疗效果的试验结果的图7的临床分数确认到，对比组作为佐剂诱导性关节炎模型，在诱导了免疫反应后的约14天起，显示出关节炎症状，经过了约35天后，症状逐渐减弱。在投入了本发明的组合物的实施例1”-1、1”-2组中，不同于阴性对比组，评分非常低，能够看出关节炎症状得到了很大程度的抑制，相比于阴性对比组，脚的浮肿得到了很大程度的抑制。但是，在投入了牛眼球粉碎物的比较例1”组中，与阴性对比组之间未显示出大的差异，相反在经过了32天之后，相比于阴性对比组，关节炎症状变严重。由此可知，包含本发明的鱼类眼球粉碎物的组合物对关节炎发挥出优异的治疗功效。
试验例2”：关节炎治疗功效比较试验
利用在上述试验例1”中判断出功效优异的实施例1”-1及1”-2的组合物，更精密地分析了关节炎预防或治疗功效。
试验方法与上述试验例1”-3类似。各组分别使用了10只大老鼠。
阴性对比组为非投药组，投入到阳性对比组的MTX是以往作为关节炎治疗剂使用的甲氨蝶呤处理组，对每只大老鼠每周投入2次各约60μg。
先经口投入2周各组合物之后，利用胶原蛋白诱导了1次免疫反应。1周之后，诱导2次免疫反应，测定临床分数及脚厚度，对各个组进行了比较。由图7及图8可以看出，在CIA诱导免疫反应后，从约2周后起，显示出关节炎症状，实施例1”-1、1”-2相比于阴性对比组、比较例，评分非常低，由此可知关节炎治疗及预防功效优异。另一方面，在到5周为止的极性阶段，MTX的效果比实施例1”-1、1”-2优秀，但之后的慢性阶段(chronic phase)，相反实施例1”-1、1”-2更加优秀，由此可知本发明的组合物对慢性关节炎的治疗及预防功效非常优秀(图7)。
本发明的组合物能够发挥与作为现有的关节炎治疗剂的MTX相同或比起优异的关节炎治疗功效。
试验例3”：对促炎症、抗炎症细胞因子表达产生的影响分析(利用关节周围淋巴球)
与上述试验例2”相同地进行了关节炎治疗功效试验。在关节炎诱导免疫化反应后第75天，针对各试验组，将获得平均值的临床分数的大老鼠杀死，分离出位于关节周围的腘(popliteal)***和腹股沟浅(inguinal)***，将这些组织研磨(grinding)，获得混合淋巴球(mixed lymphocytes)。
然后，将混合淋巴球以5x106细胞/孔分注到24-孔板中，加入类型II胶原蛋白40μg/孔，刺激24小时。然后，收集细胞，在此对Trizol进行处理，获得总RNA。利用oligo dT引物(primer)和逆转录酶(Promega)，由各试验组的RNA 1μg合成了cDNA。接着，将合成的cDNA作为模子，利用针对各细胞因子的10pmol的primer及SYBRpremix，定量地实时实施PCR，分析和比较了细胞因子表达水准(图9)。定量性实时PCR是在95℃下孵化10分钟之后，经过95℃30秒、62℃30秒及72℃30秒的40次循环，在每次循环中进行了定量。
图9的数据是，对作为持家基因的-肌动蛋白的值进行定量之后，将作为对比组的非处理组的值设为100时的相对值。能够确认到促炎症作为细胞因子的IL-12、TNF-α及IL-1β的表达量在实施例1”-1、1”-2的投药组中显著下降。尤其，在IL-12及IL-1β的情况下，实施例1”-1、1”-2投药组相比于阴性对比组，表达减少50％以上。另外，由具备抗炎症功能的Foxp3、IL-10及TGF-β的表达量可知，实施例1”-1、1”-2投药组明显高。
而且，通过本发明的组合物，对关节周围的淋巴球诱导了经口免疫耐受。尤其，不仅作为调节T细胞标记的Foxp3的表达量增加，作为具备抑制(suppression)功能的细胞因子的TGF-的表达量也增加。
综合以上结果可知，在与关节炎直接相关的关节周围的***中，本发明的组合物诱导经口免疫耐受，增加了Foxp3、IL-10及TGF-β这类的抗炎症细胞因子的表达量，抑制了IL-12、TNF-α及IL-1β这类的促炎症细胞因子的表达量。
试验例4”：细胞繁殖分析
与上述试验例2”相同地进行了关节炎治疗功效试验。在关节炎诱导免疫化反应后第75天，针对各试验组，将获得平均值的临床分数的大老鼠杀死，分离出位于关节周围的腘(popliteal)***和腹股沟浅(inguinal)***，将这些组织研磨(grinding)，获得混合淋巴球(mixed lymphocytes)。然后，将混合淋巴球以2x105细胞/孔分注到96-孔板中，加入类型II胶原蛋白40μg/孔，刺激56小时。
然后，加入0.5Ci[3H]胸苷(Perkin Elmer)，施加16小时脉动，测定了胸苷混入量(图10)。图10的数据采用将阴性对比组设为10时的相对值表示。
由图10可以确认到，在实施例1”、1～1”-2投药组中显示出最低的胸苷混入量。由该结果可知，在与关节炎直接相关的关节周围的***中，本发明的组合物诱导经口免疫耐受，其结果，针对胶原蛋白的免疫反应大幅度地得到抑制。
实施例Ⅰ至Ⅵ：包含鱼类眼球提取物的组合物的制造
将新鲜的金枪鱼速冷，将鱼类眼球与肉质分离而备好。用盐水将准备好的鱼类眼球清洗干净，利用均化器均匀粉碎，由此准备了鱼类眼球粉碎物。
将这样准备的鱼类眼球粉碎物放入超高压处理机(Ilshin autoclave，Korea)中，在压力1000MPa下，将温度升温至50℃，处理30分钟之后，冷却到室温。
向经过超高压处理的金枪鱼眼球提取物10g加入精制水100mL，回流提取3次各5小时，冷浸后，用沃特曼(whatman)10号滤纸进行过滤。将这样获得的过滤液，再次利用0.25uM的过滤机进行最终过滤，再次于50℃下进行加压浓缩及冻结干燥，制造金枪鱼眼球提取物，并且采用与上述方法相同的方法，制造鲭鱼眼球提取物。
在实施例Ⅰ中，在灭菌精制水90mL中分别依次加入苯扎氯铵0.01g、依地酸钠0.1g并进行完全溶解，加入金枪鱼眼球提取物0.1g，充分水化。加入磷酸一氢钠0.6g和磷酸二氢钠0.06g，调节pH及渗透压。之后，加入灭菌精制水直至溶液达到100mL，用0.2μm过滤器进行无菌过滤。
采用与上述实施例Ⅰ相同的方法，以下述表16的组成，制造实施例Ⅱ-Ⅵ、比较例Ⅰ的组合物。
【表16】
试验例Ⅰ：保湿效果
比较将由上述实施例Ⅰ-Ⅵ及比较例Ⅰ制造的组合物滴到1.5％寒天平板培养基上时由水分蒸发导致的寒天重量的减少。对1.5％的寒天培养基进行高压灭菌之后，分注到直径为60mm的游离板上凝固，滴加各个滴眼用组合物直到能够在培养基广泛分布的最少量即300uL(Masatsugu N.etal.Cornea 12(5)：433-436,1993).
将无添加组的1.5％寒天平板培养基的随时间的水分蒸发量设为对比组，与添加了实施例Ⅰ-Ⅵ及比较例Ⅰ的组合物时的寒天培养基的水分蒸发量进行比较，示于下面的表17及图11。表17示出随着时间经过的寒天培养基的相对重量(％)。
【表17】
时间 0 0.5 1 2.5 4 6 12 24
对比组 100 96.6 95.6 94.2 92.1 90.8 89.6 81.9
比较例I 100 97.8 96.9 96.2 95.1 94.2 92.7 88.4
实施例I 100 96.7 95.9 94.7 92.9 91.4 89.5 84.7
实施例II 100 96.8 96.7 95.4 93.7 93.0 92.5 87.9
实施例III 100 98.1 97.4 96.7 95.6 94.5 93.6 89.4
实施例IV 100 96.4 96.0 95.1 93.0 91.7 90.1 85.1
实施例V 100 96.7 96.1 95.1 93.3 92.4 90.5 85.5
实施例VI 100 98.0 97.5 96.9 95.2 94.0 92.9 89.7
由上述表17和图11可知，在添加了实施例及比较例的眼球提取物的组中，与什么都没有添加的对比组相比，水分蒸发减少。
另外，在添加了实施例Ⅰ-Ⅵ的鱼类眼球提取物的组中，添加量越多，水分蒸发越得到抑制，根据鱼类眼球提取物的添加量，保湿效果也增加。
对添加了相同量的眼球提取物的比较例Ⅰ和实施例Ⅲ及实施例Ⅵ的组进行比较时，基本上以类似的模式产生水分的蒸发，而在添加了鱼类眼球提取物的实施例Ⅲ及实施例Ⅵ中蒸发少，与投入了牛眼球提取物的比较例相比，水分蒸发得到抑制。
试验例Ⅱ：对眼角膜上皮细胞障碍的伤治愈效果
作为试验动物，选择6只2.3～3.0kg的新西兰白色公兔，所选择的兔子健康且眼球没有眼疾病及异常，将这6只兔子的12只眼睛作为对象实施了试验。试验中使用的兔子，是在养殖场内养殖，使用水和兔子用干饲料，根据试验动物使用及饲养管理规定(2004.10.15食品医药品安全厅例规第116号)进行管理。
作为用于兔子的试验组，使用通过试验结果最好的上述实施例Ⅲ(金枪鱼眼球提取物0.3％)、实施例Ⅵ(鲭鱼眼球提取物0.3％)制备的组合物，作为对比组，使用根据比较例Ⅰ(牛眼球提取物0.3％)制备的组合物。另外，作为阴性对比组，设置了只用盐水(0.9％NaCl)进行处理的组。阴性对比组是为了测定眼角膜的自然治愈能力而设置，未投给任何试验药(’Effect of Topical Na-Hyaluronan on HemidesmosomeFormation in n-Heptanol-Induced Corneal Injury’，J.H.Chung，et al.，(1998)Ophthalmic Res.30，96-100)。
为了进行伤治愈效果试验，在设定为预定的温度(23℃)和湿度(50％)的饲养环境下，将训练了2周的新西兰白色兔子滴给0.4％盐酸丁氧普鲁卡因进行局部麻醉之后，在右侧眼球上，将充分地含浸了n-庚醇的圆形滤纸(filter paper，5.5mmdiameter)与眼角膜中央部接触2分钟，将眼角膜上皮剥离而制造损伤。用2mL的生理盐水清洗2分钟，然后分别用0.9％NaCl盐水(对比组)、实施例Ⅲ、实施例Ⅵ，及比较例Ⅰ的组合物在眼角膜损伤发生5分钟后滴眼，之后每天滴3次(50μl/1次)。损伤后，在1天中第2次试验液的滴入前，一天1次用1％孟加拉玫瑰红染色液进行染色，用0.9％灭菌生理盐水进行清洗，用数码照相机对眼角膜上皮损伤部分的面积进行拍摄测定，共观察7天。
眼角膜损伤比例通过染色液染色的部分的面积值与瞳孔的整个宽度之比来计算，回复力用相对于第1天观察的损伤宽度比的相对值来示于下述表18。另外，将针对实施例及比较例的试验组的测定结果示于图12。
【表18】
由上述表18及图12可知，在通过n-庚醇引发了眼球角结膜的损伤之后，在全部组的全部个体上发生了相似程度的损伤部位，之后，分别用盐水、实施例及比较例的组合物进行了处理，观察到了损伤部分的面积减少。
但是，通过比较损伤部分的面积减少速度来比较伤治愈功效时，确认到根据本发明的实施例制造的组合物具备比用盐水处理的对比组及包含牛眼球提取物的组合物更加优异的伤损伤功效。尤其，确认到在试验时间达到3天、4天以上时，伤治愈效果仍以优异的性能持续，在长期使用时，无副作用，能够有效治疗眼球疾病。

Claims (25)

1.一种化妆料组合物，其特征在于，包含鱼类眼球的粉碎物或提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球是选自由魟鱼、鳕鱼、鲭鱼、坚鳞鲈、胡瓜鱼、三文鱼、玉筋鱼、金线鱼、安康鱼、大白鲨、鲂鱼、明太鱼、东方鲈、鲤鱼、鲫鱼、青鱼、枪鱼、真鲷、金枪鱼、鲻鱼、马鲛鱼、鲇鱼、银鱼、秋刀鱼、翻车鱼、黑鲷、带鱼、桂鱼、欧洲鲈鱼、泥鳅、鲇鱼、乌鱼、叫姑鱼、东方黄鲂鮄、剑鱼、暗纹东方鲀、黄鳍金枪鱼、灰鲭鲨、黄花鱼、河豚、鲽鱼、鼠鱼、鲥鱼、黑鮶鱼、沙丁鱼、竹荚鱼、斑鳍光鳃鱼、远东多线鱼、马头鱼、鳗鱼、鲳鱼、及黄姑鱼组成的组中的一个以上的鱼类的眼球。
3.根据权利要求1所述的化妆料组合物，其特征在于，
相对于整个组合物，以冻结干燥重量为基准，包含0.0001～90.0重量百分比的上述鱼类眼球的粉碎物或提取物。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的化妆料组合物，其特征在于，用于皮肤美白。
5.根据权利要求1至3中的任意一项所述的化妆料组合物，其特征在于，用于强化皮肤弹性。
6.根据权利要求1至3中的任意一项所述的化妆料组合物，其特征在于，用于皮肤保湿。
7.根据权利要求1至3中的任意一项所述的化妆料组合物，其特征在于，
所述化妆料组合物为由化妆水、凝胶、水溶性液体、霜、精华液、水包油型及油包水型构成的基础化妆料剂型、和由水包油型及油包水型的隔离霜、粉底、遮瑕膏、口红、唇膏、粉饼、散粉、眼影、腮红及眉笔构成的彩妆化妆料剂型中选择的任意一种的剂型。
8.一种用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，包含鱼类眼球的粉碎物或提取物作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述组合物诱导在生物肠相关淋巴组织中产生的免疫耐受。
10.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述组合物用于抑制作为细胞因子的IL-12、TNF-α及IL-1β的表达。
11.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述组合物促进作为细胞因子的Foxp3及TGF-β的表达。
12.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述组合物还包含葡萄糖胺、软骨素或它们的组合。
13.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述鱼类是选自由魟鱼、鳕鱼、鲭鱼、坚鳞鲈、胡瓜鱼、三文鱼、玉筋鱼、金线鱼、安康鱼、大白鲨、鲂鱼、明太鱼、东方鲈、鲤鱼、鲫鱼、青鱼、枪鱼、真鲷、金枪鱼、鲻鱼、马鲛鱼、鲇鱼、银鱼、秋刀鱼、翻车鱼、黑鲷、带鱼、桂鱼、欧洲鲈鱼、泥鳅、鲇鱼、乌鱼、叫姑鱼、东方黄鲂鮄、剑鱼、暗纹东方鲀、黄鳍金枪鱼、灰鲭鲨、黄花鱼、河豚、鲽鱼、鼠鱼、鲥鱼、黑鮶鱼、沙丁鱼、竹荚鱼、斑鳍光鳃鱼、远东多线鱼、马头鱼、鳗鱼、鲳鱼、及黄姑鱼组成的组的一个以上的鱼类。
14.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球提取物是在压力100Mpa～3000Mpa、温度40℃～90℃下处理5分钟～60分钟提取的。
15.根据权利要求8所述的用于预防及治疗关节炎的药学性组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球粉碎物是将鱼类的眼球用搅拌器或均化器进行粉碎之后进行过滤得到的过滤液。
16.一种用于改善关节炎的食品组合物，包含鱼类眼球的粉碎物或提取物作为有效成分。
17.根据权利要求15所述的用于改善关节炎的食品组合物，其特征在于，
上述组合物诱导在生物肠相关淋巴组织中产生的免疫耐受。
18.根据权利要求16所述的用于改善关节炎的食品组合物，其特征在于，
上述鱼类是选自由魟鱼、鳕鱼、鲭鱼、坚鳞鲈、胡瓜鱼、三文鱼、玉筋鱼、金线鱼、安康鱼、大白鲨、鲂鱼、明太鱼、东方鲈、鲤鱼、鲫鱼、青鱼、枪鱼、真鲷、金枪鱼、鲻鱼、马鲛鱼、鲇鱼、银鱼、秋刀鱼、翻车鱼、黑鲷、带鱼、桂鱼、欧洲鲈鱼、泥鳅、鲇鱼、乌鱼、叫姑鱼、东方黄鲂鮄、剑鱼、暗纹东方鲀、黄鳍金枪鱼、灰鲭鲨、黄花鱼、河豚、鲽鱼、鼠鱼、鲥鱼、黑鮶鱼、沙丁鱼、竹荚鱼、斑鳍光鳃鱼、远东多线鱼、马头鱼、鳗鱼、鲳鱼、及黄姑鱼组成的组中的一个以上的鱼类。
19.根据权利要求16所述的用于改善关节炎的食品组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球提取物是在压力100MPa～3000MPa、温度40℃～90℃下处理5分钟～60分钟提取的。
20.根据权利要求16所述的用于改善关节炎的食品组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球粉碎物是用搅拌器或均化器将鱼类的眼球粉碎之后进行过滤得到的过滤液。
21.一种用于治疗眼球干燥症的组合物，包含鱼类眼球提取物作为有效成分。
22.根据权利要求21所述的用于治疗眼球干燥症的组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球提取物以整体组合物为基准含有0.01～10％(w/v)。
23.根据权利要求21所述的用于治疗眼球干燥症的组合物，其特征在于，
还包括选自由保存剂、等张化剂、稳定剂、抗氧化剂、及pH调节剂组成的组中的一个以上的辅助剂。
24.根据权利要求21所述的用于治疗眼球干燥症的组合物，其特征在于，
上述鱼类是选自由魟鱼、鳕鱼、鲭鱼、坚鳞鲈、胡瓜鱼、三文鱼、玉筋鱼、金线鱼、安康鱼、大白鲨、鲂鱼、明太鱼、东方鲈、鲤鱼、鲫鱼、青鱼、枪鱼、真鲷、金枪鱼、鲻鱼、马鲛鱼、鲇鱼、银鱼、秋刀鱼、翻车鱼、黑鲷、带鱼、桂鱼、欧洲鲈鱼、泥鳅、鲇鱼、乌鱼、叫姑鱼、东方黄鲂鮄、剑鱼、暗纹东方鲀、黄鳍金枪鱼、灰鲭鲨、黄花鱼、河豚、鲽鱼、鼠鱼、鲥鱼、黑鮶鱼、沙丁鱼、竹荚鱼、斑鳍光鳃鱼、远东多线鱼、马头鱼、鳗鱼、鲳鱼、及黄姑鱼组成的组中的一个以上的鱼类。
25.根据权利要求21所述的用于治疗眼球干燥症的组合物，其特征在于，
上述鱼类眼球提取物是在压力100MPa～3000MPa、温度40℃～90℃下处理5分钟～60分钟提取的。
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