CN104404065A

CN104404065A - 罗汉果糖基转移酶基因ugt74ac1及其应用

Info

Publication number: CN104404065A
Application number: CN201410671420.2A
Authority: CN
Inventors: 孙媛霞; 戴隆海; 张江生; 门燕; 朱玥明
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-03-11

Abstract

本发明公开了一种罗汉果糖基转移酶基因 UGT74AC1 及所述基因 UGT74AC1 编码的糖基转移酶在合成罗汉果甜甙ⅠE中的应用。糖基转移酶基因 UGT74AC1 具有SEQIDNO.1所示的核苷酸编码序列及SEQIDNO.2所示的多肽序列。利用本发明的罗汉果糖基转移酶基因 UGT74AC1 在大肠杆菌中表达，重组的糖基转移酶 UGT74AC1 能催化罗汉果醇(Mogrol)与UDP-葡萄糖进行反应生成罗汉果甜甙ⅠE(MogrosideⅠE)。本发明的糖基转移酶基因 UGT74AC1 可应用于人工合成罗汉果甜甙ⅠE。同时，该基因在转基因技术改造罗汉果以提高罗汉果甜甙含量方面具有重要的应用价值。

Description

罗汉果糖基转移酶基因UGT74AC1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地是涉及一种新的糖基转移酶UGT74AC1及其在催化罗汉果醇生成罗汉果甜甙ⅠE中的应用。

背景技术

罗汉果为葫芦科藤本落叶植物罗汉果(Siraitia grosvenorii Swingle)的成熟果实，是我国所特有的珍贵药用和甜料植物，1977年以来一直收录于中华人民共和国药典，作为常用中药使用。***和中医药管理局将罗汉果列入第一批“既是药品又是食品的品种名单”。罗汉果味极甜、性凉、无毒，具有止咳润肺、化痰补血、润肠通便、祛瘀等功能(Prakash, Indra, and Venkata Sai Prakash Chaturvedula. Additional New Minor Cucurbitane Glycosides from Siraitia grosvenorii. Molecules 19.3 (2014): 3669-3680.)。

罗汉果甜甙是罗汉果中的主要活性物质，是一种高甜度、低卡路里的理想天然甜味剂，此外还具有降血糖、抗氧化、抗癌、抗病毒等作用（Chiu, Chun-Hui, et al. Biotransformation of Mogrosides from Siraitia grosvenorii Swingle by Saccharomyces cerevisiae. Journal of agricultural and food chemistry 61.29 (2013): 7127-7134.）。罗汉果甜甙是葫芦烷型四环三萜类化合物，自上世纪70年代以来，国内外学者对其进行了大量研究，并先后从罗汉果中分离获得了罗汉果甜甙ⅠE、 E、、、、和赛门甙等20多种甜甙。这类物质除少数外，均为极甜或微甜成分，其中罗汉果甜甙V是罗汉果中含量最高的成分，其甜度在水中浓度为万分之一时，是5%蔗糖水溶液的425倍(Kasai R, Nie R L, Nashi K, et al. Sweet Cucurbitane Glycosides from Fruits of Siraitia siamensis (chi-zi luo-han-guo), a Chinese Folk Medicine (Organic Chemistry)[J]. Agricultural and biological chemistry, 1989, 53(12): 3347-3349.)。罗汉果甜甙化学结构复杂，目前还不能化学合成，只能从罗汉果中提取获得。同时，由于罗汉果对生长环境要求苛刻，仅限于广西北部等少数地区生成，且果实生长周期长，甜甙含量低，果实产量受自然环境影响大，无法满足市场需求，因此亟待探索提高罗汉果甜甙的新方法。

糖基转移酶（Glycosyltransferase）是生物体内广泛存在的一大类酶，它将活性的糖供体如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖等转移到糖受体如三萜类、黄酮类、苯丙酯类等化合物的-COOH、-OH、-NH₂等基团上形成糖苷(Das, Shibendu Sekhar, et al. Purification and characterization of a betanidin glucosyltransferase from Amaranthus tricolor L catalyzing non-specific biotransformation of flavonoids. Plant Science 211 (2013): 61-69.)。糖基化是生物体内常见的具有重要意义的生化反应之一，通过糖基化改变糖受体的稳定性、水溶性、生物活性以及在细胞内的运输及定位，另外，通过糖基化还能降低或者去除内源及外源性物质的毒性(Richman, Alex, et al. Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides of Stevia rebaudiana. The Plant Journal 41.1 (2005): 56-67.)。罗汉果甜甙共同的前体物质是罗汉果醇，其3号碳和24号碳上连接的羟基分别可以被糖基化并通过β-1→6糖苷键生成相应的罗汉果甜甙E和罗汉果甜甙A，或3号碳和24号碳上连接的羟基同时被糖基化生成罗汉果甜甙E。此外，罗汉果醇3号碳和24号碳羟基上连接的葡萄糖分子的2号位羟基和6号位羟基又都可继续被糖基化，从而生成最多含有6个葡萄糖基的罗汉果甜甙。糖基化修饰是罗汉果甜甙生物合成途径中最后一步反应，糖基化的程度决定了罗汉果甜甙的品质。目前罗汉果甜甙糖基化修饰机理目前还是一片空白，发现并明确罗汉果甜甙糖基化修饰过程中关键糖基转移酶对罗汉果育种及通过代谢工程技术生成罗汉果甜甙具有重要的意义。

UGT74AC1是罗汉果糖基转移酶家族中的一员，在之前的转录组研究中发现了包括UGT74AC1在内的可能参与罗汉果甜甙合成途径中的的大量糖基转移酶编码基因(Tang, Qi, et al. An efficient approach to finding Siraitia grosvenorii triterpene biosynthetic genes by RNA-seq and digital gene expression analysis. BMC genomics 12.1 (2011): 343.)，但是并不明确这些糖基转移酶是否真的与罗汉果甜甙的合成有关。现有的文献检索表明，国内外尚未有任何有关糖基转移酶UGT74AC1在催化甜甙合成的相关报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供从罗汉果转录组数据库中挖掘到的糖基转移酶基因UGT74AC1, 其核苷酸序列如SEQ ID NO:1, 所编码的多肽序列如SEQ ID NO:2。具体是以罗汉果果肉为原料，经液氮碾磨后，利用Trizol试剂提取罗汉果总RNA，然后以提取的RNA为模板逆转录获得罗汉果的总cDNA。获得总cDNA后，再利用特定的引物通过PCR扩增获得糖基转移酶UGT74AC1编码基因。

本发明的目的之二是提供一种糖基转移酶UGT74AC1的表达与纯化方法。具体是将获得的糖基转移酶UGT74AC1通过NdeI和EcoRI双酶切与同样经NdeI和EcoRI双酶切处理的大肠杆菌表达质粒进行连接，重组质粒经测序验证正确后，再转化导入到大肠杆菌Rosetta gami (DE3)中，构建重组大肠杆菌。挑取重组大肠杆菌单菌落接种至5 mL LB培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养过夜。按照1%的接种量，将种子液接种于100 mL 培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养2-3 h。当菌体浓度OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度为0.1 mmol 的IPTG，同时降低培养温度至16℃，摇床转速降低至150 rmp，诱导时间为20h。然后通过离心收集菌体，经超声破碎后再次离心收集破碎液上清并按照GE公司提供的组氨酸标签重组蛋白纯化手册上的相关操作纯化目的蛋白UGT74AC1。

本发明的目的之三是提供一种利用糖基转移酶UGT74AC1催化罗汉果醇生成甜甙E的方法。具体的是在酶反应体系中加入50 mM Tris-HCL，5 mM MgCl₂，0.2 mM 罗汉果醇，1 mM UDP-葡萄糖和100 μg纯化的UGT74AC1蛋白，在30 ℃条件下反应4 h。

采用以上技术方案，本发明提供了一种糖基转移酶UGT74AC1及其在催化罗汉果醇生成罗汉果甜甙ⅠE中的应用。实验证明，糖基转移酶UGT74AC1可在大肠杆菌中高效可溶性表达，并且可以以罗汉果醇和UDP-葡萄糖为底物，催化生成罗汉果甜甙ⅠE。该基因的发现同时也为利用基因工程菌改造罗汉果以提高罗汉果甜甙的含量提供了重要的理论基础。

附图说明

图1构建的重组大肠杆菌表达载体pET21-UGT74AC1的物理图谱

图2表达了重组质粒pET21-UGT74AC1的大肠杆菌菌体、破碎上清、沉淀及纯化产物的SDS-PAGE电泳图；

图3为UGT74AC1反应产物的高效液相色谱（HPLC）图谱；

图4. 糖基化产物的质谱图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施案例对本发明的具体实施方式做详细叙述。以下实施方式仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的使用范围。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干种变动和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施案例中未注明具体实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pross, 1989）中所述的条件，或者按照相关试剂制造厂商所提供的建议。

实施例1、糖基转移酶基因UGT74AC1的克隆与原核表达载体的构建

以罗汉果果肉为原料，按照TRIzol (Invitrogen, USA )试剂盒上的操作步骤提取罗汉果总RNA，然后以提取获得的总RNA为模板，利用First Strand cDNA Synthesis Kit (Ferments, USA ) 逆转录获得罗汉果的总cDNA。根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库上公布的罗汉果糖基转移酶基因UGT74AC1的DNA序列，设计一对特异性引物UGT74AC1-F:CGC CATATG CACCACCACCACCACCACATG

GAGAAAGGCGATACGCATATT和UGT74AC1-R:CGGAATTCTCAA

GTTTGCTTGAGCATGGCCAC扩增UGT74AC1全序列。将获得的UGT74AC1先经过NdeI和EcoRI酶切之后，与同样经NdeI和EcoRI双酶切处理的pET21a进行连接构建表达载体pET21-UGT74AC1（附图1）。

实施例2、大肠杆菌重组菌株的构建及目的蛋白的表达与分离纯化

将测序正确的表达载体pET21-UGT74AC1转化导入大肠杆菌表达菌株Rosetta gami (DE3)，转化子再经过菌落PCR验证重组质粒pET21-UGT74AC1已进入大肠杆菌表达菌株Rosetta gami (DE3)后用于重组蛋白UGT74AC1的表达。在添加了相应浓度的氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素和链霉素的LB培养基中接种适量大肠杆菌转化子，37℃，220 rpm过夜培养。然后将过夜培养物按2：100的比例接种到新鲜的含有相应抗生素的LB培养基中，37℃，220 rpm培养至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8。然后加入IPTG至终浓度为0.1 mM，在16℃，150 rpm下培养16-20h诱导目的蛋白的表达。诱导完成后，6000 rpm离心10 min收集菌体，然后将菌体悬浮与Buffer A（25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，30 mM Imidazole，PH=7.2）中，于4℃条件下对菌体进行超高压破碎。将大肠杆菌细胞破碎液在15000 rpm条件下离心60 min，收集上清并加入到预先用Buffer A平衡好的镍琼脂糖柱中，按照GE蛋白纯化手册上的操作，用Buffer B （25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，250 mM Imidazole，PH=7.2）对目的蛋白进行梯度洗脱。目的蛋白的纯度经SDS-PAGE检测达到电泳纯（附图2），可用于后续的酶活测定。

实施案例3、 UGT74AC1酶活的测定

在2 mL的EP管测定UGT74AC1的酶活。反应体系为：1 mM UDP-葡萄糖，0.2 mM罗汉果醇，100 μg UGT74AC1蛋白，50 mM Tri-HCl (PH 7.2)，30℃条件下反应4 h。然后用等体积的乙酸乙酯萃取反应产物3次，合成萃取产物并用氮气吹干。最后将产物溶解于色谱级甲醇中，经0.22 μm的滤膜处理后用于LC-MS分析。

实施案例4、酶反应产物的LC-MS鉴定

利用HPLC对酶反应产物进行分析，液相***为Agilent 1260***，色谱柱为Welch Ultimate C18 柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) ，进样量为20 μL，紫外检测器，检测波长为210 nm。流动相为乙腈和水，梯度运行方法为：0-20 min，23%乙腈；20-60 min，50%乙腈。HPLC结果显示（附图3）UGT74AC1能够催化罗汉果醇生成一个新的产物峰，该产物出峰时间为36.10 min，且出峰时间与罗汉果甜甙ⅠE标准品的出峰时间是一致的。当用表达了空载体pET21的大肠杆菌所提取的总蛋白与罗汉果醇进行反应并利用同样的液相色谱检测条件进行检测时，在36.10 min处没有新产物生成。

质谱仪为Bruker-micrOTOF-II，ESI离子源，负离子模式。优化后的离子条件为：离子喷雾电压为4500V; 毛细管温度为400℃，干燥气体为氮气，流速为6 mL/min，干燥温度为180℃。质谱结果显示（附图4）UGT74AC1蛋白与罗汉果醇的反应产物在36.10 min处的离子碎片包括（m/z, 637 [M-H]^－, 683 [M-H+HCOOH]^－and 751 [M-H+TFA]^－）, 这与甜甙ⅠE标准品的的质谱结果是一致的，以上结果表明UGT74AC1能够催化罗汉果醇与UDP-葡萄糖反应生成罗汉果甜甙ⅠE。

以上对本发明的具体实施案例进行了描述。使用本发明中发现的罗汉果糖基转移酶基因UGT74AC1可以以罗汉果醇和UDP-葡萄糖为底物催化生成罗汉果甜甙E。需要理解的是，本发明并不局限于上述所述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围做出各种变形或者修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列来自下组：

具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列不同但是编码SEQ ID NO.2所示的多肽序列的核苷酸序列；

与序列SEQ ID NO.1所示序列同源性≧85%（较佳地95%），且具有催化罗汉果醇生产甜甙ⅠE活性的核苷酸序列；

在高严谨条件下可以与序列表SEQ ID NO.1限定的序列杂交的核苷酸序列

与任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.一种多肽序列，其特征在于所述多肽序列选自下组：

具有如SEQ ID NO.2所示的多肽序列；

SEQ ID NO.2所示的多肽序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有催化罗汉果醇生成甜甙ⅠE活性的由衍生的多肽序列；

多肽序列与SEQ ID NO.2所示多肽序列的同源性≧90%（较佳地95%），并且具有催化罗汉果醇生成甜甙ⅠE活性的由衍生的多肽序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于该表达载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。

4.按照权利3所述的重组表达载体，其特征在于它是pET21-UGT74AC1。

5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是转化、转导了权利3中所述表达载体或者基因组上整合了权利2所述核酸序列的宿主细胞及其后代细胞。

6.按照权利5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、动物细胞或者植物细胞及这些宿主细胞的后代。

7.按照权利6所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞Rosetta gami (DE3)。

8.权利1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的氨基酸残基序列和权利3所述的重组表达载体应用于表达糖基转移酶UGT74AC1。

9.利用权利要求8表达的糖基转移酶UGT74AC1进行酶反应催化罗汉果醇与UDP-葡萄糖反应生成罗汉果甜甙ⅠE。

10.反应体系为： 50 mM Tris-HCL，5 mM MgCl₂，0.2 mM 罗汉果醇，1 mM UDP-葡萄糖和100 μg纯化的UGT74AC1蛋白，在30 ℃条件下，反应4 h。