CN104394890B - 由毕赤酵母生物质制得的天然生物复合粉、制备方法及其作为赋形剂的用途 - Google Patents

由毕赤酵母生物质制得的天然生物复合粉、制备方法及其作为赋形剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由毕赤酵母(Pichia pastoris)的生物质制得的天然生物复合粉，其包含几丁质‑葡聚糖复合物(chitin‑glucan complex，CGC)和含有甘露糖的多糖。在第二方面，本发明涉及所述天然生物复合粉的制备方法。本发明还涉及获取含有提高的CGC含量以及在所述CGC中提高的几丁质/葡聚糖的含量的毕赤酵母的方法。最后，本发明涉及所述天然生物复合粉作为药物、化妆品或食品工业赋形剂的用途，所述天然生物复合粉由本发明的方法从毕赤酵母的细胞壁制得。

Description

由毕赤酵母生物质制得的天然生物复合粉、制备方法及其作 为赋形剂的用途
在整个本申请中，引用了多种出版物，包括引用于括号中的。括号中引用的出版物完整的引用可见于权利要求前说明书的结尾处所列出的。所有引用的出版物以其全部公开内容通过引用并入本申请中，以便更全面地描述本发明所涉及的领域的状态。
技术领域
本发明涉及由毕赤酵母(Pichia pastoris)的生物质制得的天然生物复合粉，其包含几丁质-葡聚糖复合物(chitin-glucan complex，CGC)和含有甘露糖的多糖，所述天然生物复合粉的制备方法，获得含有提高的CGC含量以及在所述CGC中提高的几丁质/葡聚糖的含量的毕赤酵母的方法，以及所述天然生物复合粉作为赋形剂在药物、化妆品或食品工业中的用途。根据本发明的所述方法，所获得的天然生物复合粉提供了作为可在制药工业中用作多功能赋形剂(作为粘合剂、崩解剂和/或润滑剂)的独特添加剂的高的优势。
背景技术
酵母细胞壁是不同大分子的复杂网络，其中多糖为主要组分，占细胞干重的50％以上。含有甘露糖和葡萄糖的多糖是酵母细胞壁的主要成分，以及较少量的通常以几丁质-葡聚糖复合物形式存在的几丁质。几丁质-葡聚糖复合物(chitin-glucan complex，CGC)是由共价连接至β-1,3-葡聚糖(葡萄糖单元的聚合物)的几丁质(N-乙酰葡萄糖胺单元的聚合物)组成。该共聚物在酵母细胞中具有重要的结构功能并且是水不溶性的。含有甘露糖和葡萄糖的多糖包括甘露聚糖(甘露糖单元的聚合物)、葡聚糖(葡萄糖单元的聚合物)、葡甘露聚糖(甘露糖和葡萄糖单元的聚合物)和/或半乳甘露聚糖(甘露糖和半乳糖单元的聚合物)。
由于其组成，酵母细胞壁是不同类型多糖的重要来源，包括甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡聚糖、几丁质和几丁质-葡聚糖复合物。具有相似组成的多糖还可以从藻类、植物或动物中提取，例如，角叉菜胶、瓜尔胶和几丁质。然而，从这些高等生物(藻类、植物或动物)提取多糖存在许多制约因素：它们依赖于季节性生产，具有高度可变的质量和数量，使生产工艺尤其不可复制。在从甲壳类提取几丁质的情况下，所得到的产物可能包含使它们不适合人使用的毒素或过敏原。另一方面，从酵母提取，在控制条件下培养，是更加可靠、可持续和安全。
最近，美国专利7556946和专利申请US 2010/0221382、US2010/0003292和WO2010/013174公开了由真菌或酵母生物质制备细胞壁衍生物以获得几丁质聚合物或几丁质-葡聚糖聚合物的方法。
然而，这些方法着重于多数为富含几丁质和几丁聚糖的聚合物的生产，而没有利用其它多糖如甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的存在。
另一方面，其它文献，如美国专利6444448和专利申请EP 2272876和WO 2010/070207，公开了从不同天然来源获得葡聚糖和甘露聚糖的方法，包括细菌、真菌、酵母和植物。这些方法依赖于酶法(EP 2272876)或自溶(US 6444448)处理，或依赖于酸和碱处理的组合(2010/070207)。
赋形剂是制药工业使用的以将活性成分配制成成品剂型的成分。活性药物成分(active pharmaceutical ingredients，APIs)与赋形剂的制剂是与强大的制造工艺一起确保有效药物递送具有所需特性的基础(primordial)。实质上，赋形剂被用于提供基质，在其中所述药物可以被处理以控制剂量速率，在药物递送***制造过程中以帮助处理所述药物递送***并协助产品标识、保护、支持或增强稳定性、生物利用度或患者可接受度，并以增强存储或使用过程中药物的整体安全性、有效性或递送的任何其它属性。
赋形剂的主要类别是粘合剂和填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂和助流剂、防腐剂和抗氧化剂。范围为给定药物的总重量的15％至99％，赋形剂在采购、物流、质量控制和流程生产能力方面与药物生产工艺极其相关。因此，赋形剂必须能够给配方带来高功能性好处，如提高的润滑性、改善的流动性、增强的可压缩性和相容性、提高的产品特征和可持续的生产工艺。
作为例子，具有可接受的物理化学性质的片剂剂型的制备包括采用上述的填充剂、粘合剂、助流剂和润滑剂。为了被压制成片剂，这些材料必须具有特定的物理性质，即，它们必须是自由流动的、粘着的和润滑的。此外，对于活性药物成分的释放，加入崩解剂以促进固体剂型的解体。
虽然传统片剂成分具有长期建立的效力，它们中的一些具有涉及成本、中等功效以及常常耗时的赋形剂工艺的缺点。因此，需要克服这些缺点的新赋形剂制剂。一个很大的优点是采用自身结合不同的传统赋形剂成分的特性的高功能性赋形剂，从而使得制剂工艺更容易并更快速的可能性。
目前，大多数传统赋形剂是合成的或者是采用天然分子作为起点进行化学修饰的。纤维素或淀粉衍生物、合成聚合物和醇是本领域技术人员会容易地确定的几个例子。在制药工业中完全天然赋形剂的使用仍然有限。然而，这些天然赋形剂具有安全、无毒、生物相容和生物降解的优点。鉴于此，天然多糖可用于开发具有改善的性质的通用赋形剂。它们可以提取自各种来源，如植物、动物、或甚至微生物。
在当今作为赋形剂出现的天然多糖中，本领域技术人员会鉴定聚合物，如瓜尔胶或角叉菜胶。瓜尔胶，用作洗剂(lotion)和乳膏剂(cream)的增稠剂，作为片剂粘合剂或作为乳液(emulsion)稳定剂，是一种半乳甘露聚糖(半乳糖和甘露糖单元的聚合物)，其在一些植物的种子胚乳中作为存储多糖。角叉菜胶是适用于片剂制造的、由某些红海藻种类获得的高分子量硫酸多糖家族的总称。
发明内容
本发明涉及由毕赤酵母的细胞壁制得的天然生物复合粉，其包含几丁质-葡聚糖复合物和含有甘露糖的多糖。
本发明还涉及通过本发明的所述方法从毕赤酵母的细胞壁制得的该天然生物复合粉作为制药工业的赋形剂的用途。
此外，本发明涉及本发明的所述天然生物复合粉的制备方法，其包括生产毕赤酵母生物质、从毕赤酵母生物质提取多糖得到本发明的所述天然生物复合物的步骤，以及干燥并研磨所述天然生物复合物以获得所需粉末的步骤。
根据本发明所述的方法，所述天然生物复合物中CGC和含有甘露糖的多糖的量，通过控制从毕赤酵母细胞壁提取天然生物复合物的步骤的条件来调整。天然生物复合粉的物理性质，即，堆积密度、颗粒大小分布和水分，通过控制干燥并研磨所述天然生物复合物的条件来调节。
本发明还涉及获得具有特定CGC含量以及特定几丁质与葡聚糖的比的毕赤酵母生物质的培养条件。
本发明的方面涉及生物复合粉，其包含20-95％(w/w)的几丁质-葡聚糖复合物(CGC)，优选40-90％(w/w)，以及高达50％的含有甘露糖的多糖，优选高达25％(w/w)，提取自毕赤酵母的生物质，其中生物复合粉的颗粒大小范围在5-1500μm之间，优选在30-400μm之间，并且其中所述生物复合粉的表观堆积密度(apparent bulk density)在0.05-1.0g/cm3之间，优选在0.5-1.0g/cm3之间。
本发明的方面涉及包含提取自本发明的毕赤酵母的生物质的多糖的生物复合粉的制备方法，其特征在于以下顺序步骤：
a)将毕赤酵母生物质与浓度在0.5-5.0M之间的碱性水溶液(NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3、K2CO3、CaCO3、NaHCO3或KHCO3，优选NaOH或NaHCO3)接触，其中所述生物质在悬浮液中，优选浓度在10-15％(w/v)之间；
b)于60-90℃之间的温度下将所述碱性生物质悬液搅拌1-5小时的时间以形成反应混合物；
c)将所述反应混合冷却物至30-45℃之间的温度，以及冷却后，通过离心或过滤将所述反应混合物的可溶性组分与所述碱性不可溶性组分分离；
d)用以下溶剂***的一种或几种洗涤所述碱性不可溶性组分以形成浆液：
i.水，
ii.盐水溶液，例如，磷酸盐缓冲液(PBS)(20.45g/L NaCl；0.46g/L KCl；10.14g/LNa2HPO4.7H2O；0.54g/L KH2PO4，pH7.2)，
iii.乙醇(70％，v/v)，或
iv.酸的水溶液，例如，盐酸(HCl)；
e)采用以下步骤中的一种干燥所述浆液：
i.用液氮冷冻，接着进行冷冻干燥；
ii.在温度为60-80℃之间的烘箱中干燥12-18小时；
iii.在120-200℃之间的温度下喷雾干燥1-10秒之间的时间，优选在130-150℃之间的温度下；或
iv.以70℃-90℃之间的进气进行流化床干燥；
f)通过以下方式研磨干燥的材料以获得粉末：将其一次或多次通过碾碎机(Comminuting Mill)、圆锥研磨机、球磨机、多用研磨机或辊压机，其输出处配有范围在0.25-10mm的筛子，以在500-5000rpm之间的转子速度进行操作；以及
g)通过将其一次或多次通过配有范围在0.05-1.5mm的筛子的振荡旋转筛磨机来校准所述粉末。
附图说明
图1-由毕赤酵母生物质制备的高甘露糖含量(实线)和低甘露糖含量(虚线)生物复合物的DSC扫描。
发明详述
本发明的方面涉及生物复合粉，其包含20-95％(w/w)、或大约20、30、40、50、60、70、80、90或95％(w/w)的几丁质-葡聚糖复合物(CGC)，优选40-90％(w/w)，以及高达50％的含有甘露糖的多糖，优选高达25、30、35、40、45％(w/w)，其提取自毕赤酵母的生物质，其中生物复合粉的颗粒大小范围在5-1500μm之间，优选在30-400μm之间，或大约50、100、150、200、250、300或350μm，并且其中所述生物复合粉的表观堆积密度在0.05-1.0g/cm3之间，优选在0.5-1.0g/cm3之间，或大约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/cm3。
在一些实施方案中，所述生物复合粉的粒度分布是这样的：大约90％的颗粒的大小低于355μm，大约50％的颗粒的大小低于250μm并且少于大约10％的颗粒的大小低于90μm。
在一些实施方案中，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高达15:90(％mol)，优选高于15:85(％mol)，更优选高于50:50(％mol)。
本发明的方面涉及包含提取自本发明的毕赤酵母的生物质的多糖的生物复合粉的制备方法，其特征在于以下顺序的步骤：
a)将毕赤酵母生物质与浓度在0.5-5.0M之间、或大约1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0M的碱性水溶液接触，其中所述生物质在悬浮液中，优选浓度在10-15％之间、或大约11、12、13、14或15％(w/v)；
b)于大约60-90℃之间的温度下搅拌所述碱性生物质悬浮液大约1-5小时的时间以形成反应混合物；
c)将所述反应混合物至冷却大约30-45℃之间的温度，以及冷却后，通过离心或过滤将所述反应混合物的可溶性组分与所述碱性不可溶性组分分离；
d)用以下溶剂***的一种或几种洗涤所述碱性不可溶性组分以形成浆液：
i.水，
ii.盐水溶液，
iii.乙醇(大约70％，v/v)，或
iv.酸的水溶液；
e)采用以下步骤中的一种干燥所述浆液：
i.用液氮冷冻，接着进行冷冻干燥；
ii.在温度为大约60-80℃之间的烘箱中干燥大约12-18小时；
iii.在大约120-200℃之间或大约130、140、150、160、170、180或190℃的温度下喷雾干燥大约1-10秒之间的时间；或
iv.以大约70℃-90℃之间的进气进行流化床干燥；
f)通过以下方式研磨干燥的材料以获得粉末：将其一次或多次通过碾碎机、圆锥研磨机、球磨机、多用研磨机或辊压机，其输出处配有范围在大约0.25-10mm的筛子，以大约500-5000rpm之间、或大约600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000rpm的转子速度进行操作；以及
g)通过将其一次或多次通过配有范围在大约0.05-1.5mm的筛子的振荡旋转筛磨机来校准所述粉末。
在一些实施方案中，CGC含量高达大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质是通过以下方式获得的：培养于补充有浓度在30-60g/L之间、优选在大约40-50g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的标准基本盐培养基(BSM)，在分批、补料分批或连续的模式下，控制温度为大约28-32℃，控制pH为大约4.5-5.5，控制溶解氧浓度(DO)为高于大约10、20、30、40或50％，优选高于大约30％，更优选高于大约50％。
在一些实施方案中，CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质是通过以下方式获得的：培养于补充有浓度在大约60-180g/L之间、优选在大约80-120g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM。
在一些实施方案中，通过不进行温度控制来培养，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过以下方式通过控制温度于大约28-32℃直至达到稳定生长期然后在大约2-48小时、优选大约6-24小时期间提高温度大约5-20℃、优选大约10-15℃来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过不进行pH控制来培养，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过控制pH于大约3.5-6.5、或大约3.5、4.0、5.0、5.5、6.0或6.5直至达到稳定生长期然后在大约2-48小时或6、12、18、24、36或48小时、优选6-24小时期间或以上提高pH大约1.0-3.0、优选大约2.0-3.0来培养，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，其中BSM中所述咖啡因的最终浓度高达大约100mmol/L，优选在大约10-50mmol/L之间，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度高达大约100mmol/L、优选在大约10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度高达大约1.0％(w/v)、优选在大约0.01-0.1％(w/v)之间的表面活性剂，如SDS、Triton X100或PEG的BSM中培养，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度在大约1-200mmol/L之间、或大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mmol/L、优选在大约5-50mmol/L之间的钙、钴、铜、铁、镁和/或锰的盐酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐形式的BSM中培养，获得CGC含量高于大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在大约40-180g/L之间、或大约40、50、60、70、80、90、100、120、140、160或180g/L、优选在大约60-120g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于大约15:85(％mol)、优选高于大约50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，所述BSM中的所述咖啡因的终浓度高达大约100mmol/L、或大约10、15、20、25、30、35、40、45或50mmol/L、优选在10-50mmol/L之间，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于大约15:85(％mol)、优选高于大约50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度高达大约100mmol/L、或大约10、15、20、25、30、35、40、45或50mmol/L、优选在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于大约15:85(％mol)、优选高于大约50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在高于大约6.5的pH下培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于大约15:85(％mol)、优选高于大约50:50(％mol)。
在一些实施方案中，毕赤酵母生物质是作为制药工业副产品获得的。
本发明的方面涉及生物复合粉，其包含20-95％(w/w)的几丁质-葡聚糖复合物(CGC)，以及高达50％的含有甘露糖的多糖，其提取自毕赤酵母的生物质，其中生物复合粉的颗粒大小范围在5-1500μm之间，并且其中所述生物复合粉的表观堆积密度在0.05-1.0g/cm3之间。
在一些实施方案中，所述生物复合粉包含高达25％(w/w)的含有甘露糖的多糖。
在一些实施方案中，所述复合粉的颗粒大小范围在30-400μm之间。
在一些实施方案中，所述生物复合粉的表观堆积密度在0.5-1.0g/cm3之间。
在一些实施方案中，所述生物复合粉的粒度分布是：90％的颗粒具有低于355μm的大小，50％的颗粒具有低于250μm的大小并且少于10％的颗粒具有低于90μm的大小。
在一些实施方案中，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高达15:90(％mol)。
在一些实施方案中，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)。
在一些实施方案中，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于50:50(％mol)。
本发明的方面涉及包含提取自本发明的毕赤酵母的生物质的多糖的生物复合粉的制备方法，其特征在于以下顺序的步骤：
a)将毕赤酵母生物质与浓度在0.5-5.0M之间的碱性水溶液接触，其中所述生物质在悬浮液中，优选浓度在10-15％(w/v)之间；
b)在60-90℃之间的温度下搅拌所述碱性生物质悬浮液1-5小时的时间以形成反应混合物；
c)将所述反应混合物冷却至30-45℃之间的温度，以及冷却后，通过离心或过滤将所述反应混合物的可溶性组分与所述碱性不可溶性组分分离；
d)用以下溶剂***的一种或几种洗涤所述碱性不可溶性组分以形成浆液：
i.水，
ii.盐水溶液，
iii.乙醇(70％，v/v)，或
iv.酸的水溶液；
e)采用以下步骤中的一种干燥所述浆液：
v.用液氮冷冻，接着进行冷冻干燥；
vi.在温度为60-80℃之间的烘箱中干燥12-18小时；
vii.在120-200℃之间的温度下喷雾干燥1-10秒之间的时间；或
viii.以70℃-90℃之间的进气进行流化床干燥；
f)通过以下方式研磨干燥的材料以获得粉末：将其一次或多次通过碾碎机、圆锥研磨机、球磨机、多用研磨机或辊压机，其输出处配有范围在0.25-10mm的筛子，以500-5000rpm之间的转子速度进行操作；以及
g)通过将其一次或多次通过配有范围在0.05-1.5mm的筛子的振荡旋转筛磨机来校准所述粉末。
在一些实施方案中，所述碱性水溶液是NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3、K2CO3、CaCO3、NaHCO3或KHCO3。
在一些实施方案中，所述碱性水溶液是NaOH或NaHCO3。
在一些实施方案中，步骤d)ii)中的所述水溶液是磷酸盐缓冲液(PBS)(20.45g/LNaCl；0.46g/L KCl；10.14g/L Na2HPO4.7H2O；0.54g/L KH2PO4，pH7.2)。
在一些实施方案中，步骤d)iv)中的所述酸的水溶液是盐酸(HCl)的水溶液。
在一些实施方案中，所述喷雾干燥是在130-150℃之间的温度下。
在一些实施方案中，通过培养于补充有浓度在30-60g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的标准基本盐培养基(BSM)中，在分批、补料分批或连续的模式下，控制温度为28-32℃，控制pH为4.5-5.5，控制溶解氧浓度(DO)为高于10％，获得CGC含量高达15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，所述溶解氧浓度(DO)控制为高于30％。
在一些实施方案中，所述溶解氧浓度(DO)控制为高于50％。
在一些实施方案中，通过培养于补充有浓度在40-50g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的标准基本盐培养基(BSM)中，获得CGC含量高达15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，所述毕赤酵母生物质是以高于15％(w/w)的CGC含量获得的，通过培养于补充有浓度在60-180g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中。
在一些实施方案中，通过培养于补充有浓度在80-120g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过不进行温度控制来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过控制温度于28-32℃直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高温度5-20℃来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过控制温度于28-32℃直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高温度10-15℃来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，当达到稳定生长期时，所述温度在6-24小时期间提高。
在一些实施方案中，通过不进行pH控制来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过控制pH于3.5-6.5直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高pH1.0-3.0来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过控制pH于3.5-6.5直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高pH2.0-3.0来培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，当达到稳定生长期时，所述pH在6-24小时期间提高。
在一些实施方案中，通过在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，其中BSM中所述咖啡因的最终浓度高达100mmol/L，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，其中BSM中所述咖啡因的最终浓度在10-50mmol/L之间，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度高达100mmol/L、优选在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度高达1.0％(w/v)的表面活性剂，如SDS、Triton X100或PEG的BSM中培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度在0.01-0.1％(w/v)之间的表面活性剂，如SDS、Triton X100或PEG的BSM中培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度在1-200mmol/L之间的钙、钴、铜、铁、镁和/或锰的盐酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐形式的BSM中培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过在补充有浓度在5-50mmol/L之间的钙、钴、铜、铁、镁和/或锰的盐酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐形式的BSM中培养，获得CGC含量高于15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在40-180g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在60-120g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在40-180g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在60-120g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，所述BSM中的所述咖啡因的终浓度为高达100mmol/L，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，所述BSM中的所述咖啡因的终浓度为高达100mmol/L，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于50:50(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在高于6.5的pH下培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)。
在一些实施方案中，通过将毕赤酵母在高于6.5的pH下培养，所述CGC中几丁质与葡聚糖的比高于50:50(％mol)。
在一些实施方案中，所述毕赤酵母生物质是作为制药工业副产品获得的。
本发明的方面涉及包含提取自本发明所述的毕赤酵母的生物质的CGC和含有甘露糖的多糖的生物复合粉作为药物赋形剂的用途。
本发明的方面涉及包含提取自本发明所述的毕赤酵母的生物质的多糖的所述粉作为化妆品赋形剂的用途。
本发明的方面涉及包含提取自本发明所述的毕赤酵母的生物质的多糖的所述粉在药物制剂中的用途。
本发明的方面涉及包含提取自本发明所述的毕赤酵母的生物质的多糖的所述粉在化妆品制剂中的用途。
本发明的方面涉及包含提取自本发明所述的毕赤酵母的生物质的多糖的所述粉在食品制剂中的用途。
预期本文公开的每个实施方案适用于每个其它公开的实施方案。因此，本文描述的各种要素的所有组合落于本发明的范围内。
可以理解的是，当提供了参数范围，则本发明也提供在该范围内的所有整数及其十分之一的小数位。例如，“0.2-5mg/kg/天”公开了0.2mg/kg/天、0.3mg/kg/天、0.4mg/kg/天、0.5mg/kg/天、0.6mg/kg/天等直至5.0mg/kg/天。
如本文所使用的，除非该上下文要求更限制性的范围，本发明上下文中的数值或范围中的“大约”是指所引用或要求的数值或范围的±10％。
1.天然生物复合粉的特征
在一个实施方案中，本发明涉及由毕赤酵母细胞壁制备的天然生物复合粉，其包含20-95％(w/w)的几丁质-葡聚糖复合物(CGC)，优选40-90％(w/w)，以及高达50％的含有甘露糖的多糖，优选高达25％(w/w)，其颗粒大小范围在5-1500μm之间，优选30-400μm之间，表观堆积密度在0.05-1.0g/cm3之间，优选在0.5-1.0g/cm3之间，并且球度系数范围在0.20-0.95之间。
所述生物复合粉优选具有这样的粒度分布：90％的颗粒的大小低于355μm，50％的颗粒的大小低于250μm并且少于10％的颗粒的大小低于90μm。
所述生物复合粉包含CGC，其中几丁质与葡聚糖的比高达15:90(％mol)，优选高于15:85(％mol)，更优选高于50:50(％mol)。
所述天然生物复合粉的物理化学性质可以以受控的方式进行调节，通过改变本发明的所述方法的一个或多个步骤的操作参数，即，生产毕赤酵母生物质、从毕赤酵母细胞壁提取生物复合物和干燥并研磨所述天然生物复合物的步骤。
2.从毕赤酵母生物质制备天然生物复合粉的方法
2.1.生产具有高达15％(w/w)的GCG含量的毕赤酵母生物质的步骤
通过培养于补充有浓度在30-60g/L之间、优选在大约40-50g/L之间的合适的碳源的标准基本盐培养基(BSM)(毕赤酵母发酵工艺指南，Invitrogen)，获得CGC含量高达大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。获得高毕赤酵母生物质浓度的合适碳源包括甘油、甲醇和葡萄糖、富含这些化合物的物质(例如，干酪乳清、甘蔗糖蜜、木质纤维素水解产物、来自生物柴油工业等的甘油副产物)或其混合物。生成毕赤酵母生物质的其它合适碳源包括山梨糖醇、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖和乳糖，以及富含这些化合物的物质或其混合物。
毕赤酵母培养是在分批、补料分批或连续的模式下进行的，控制温度为28-32℃，控制pH为4.5-5.5，并控制溶解氧浓度(DO)高于10％，优选高于30％，更优选高于50％。所述pH通过加入碱性溶液控制，优选还可作为细胞生长所需的氮源的氢氧化铵。所述DO通过在200-2000rpm之间，优选在300-1000rpm之间改变搅拌速度，在0.5-3.0vvm(每分钟每反应器体积的空气体积)之间，优选在1.0-2.0vvm之间改变空气流速，用纯氧富集和/或改变压力直至2.0巴(bar)。
2.2.生产具有高于15％(w/w)的GCG含量的毕赤酵母生物质的步骤
在一个实施方案中，通过培养于补充有浓度在60-180g/L之间、优选在80-120g/L之间的甘油、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中，获得CGC含量高达大约15％(w/w)的毕赤酵母生物质。
根据本发明，培养温度用于获得具有高于15％(w/w)的CGC含量的毕赤酵母生物质。通过在控制于28-32℃的温度下生长毕赤酵母达到高特异性细胞生长速率(>0.15h-1)。在该温度范围之外(15-28℃或32-50℃)，所述特异性细胞生长速率较低(<0.15h-1)并诱导CGC生物质含量的改变。
可选的是，毕赤酵母在控制温度于28-37℃培养直至达到稳定生长期然后所述温度提高5-20℃、优选10-15℃，并且所述培养物于该温度保持2-48小时之间的时间，优选在6-24小时之间。由此施加到培养物的热休克诱导毕赤酵母的CGC含量改变。
可选的是，毕赤酵母在不进行温度控制下培养。在指数生长期过程中，温度逐渐升高，从而将培养物暴露于提高的温度值并因此诱导毕赤酵母的CGC含量改变。
根据本发明，在毕赤酵母培养过程中的pH也可用于控制毕赤酵母生物质的CGC含量。通过在控制pH于4.5-5.5生长毕赤酵母达到高特异性细胞生长速率(>0.15h-1)。在该pH范围之外(2.0-3.5或6.5-10.0)，所述特异性细胞生长速率较低(<0.15h-1)并诱导CGC生物质含量改变。
可选的是，毕赤酵母在控制pH于4.5-5.5培养直至达到稳定生长期然后所述pH提高或降低1.0-3.0、优选2.0-3.0，并且所述培养物于该pH保持在2-48小时之间的时间，优选在6-24小时之间。由此施加到培养物的碱或酸休克诱导毕赤酵母的CGC含量改变。
可选的是，毕赤酵母在不进行pH控制下培养。在指数生长期过程中，pH逐渐降低，从而将培养物暴露给酸性环境并因此诱导毕赤酵母的CGC含量改变。
在含有合适的碳源的BSM中培养的毕赤酵母生物质的CGC含量的控制可另外通过用补充有浓度高达100mmol/L、优选在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的培养基来实现。葡萄糖胺的存在刺激酵母的细胞壁中几丁质的积累，从而富集CGC中的生物质。葡萄糖胺优选在细胞指数生长期过程中加至培养基中。
在含有合适的碳源的BSM中培养的毕赤酵母生物质的CGC含量的控制可另外通过补充有用浓度高达100mmol/L、优选在10-50mmol/L之间的咖啡因的培养基来实现。咖啡因的存在影响毕赤酵母细胞生长并导致细胞壁的破坏。因此，作为对咖啡因存在的防御机制，毕赤酵母提高细胞壁中几丁质的量，从而富集CGC中的生物质。咖啡因可以在细胞指数生长期过程中或在稳定生长期过程中加至培养基中。为了保证生产足够的细胞生物质，咖啡因优选当生物质达到浓度高于20g/L、优选高于50g/L时加至培养基中。可选的是，于指数生长期结尾时或在稳定生长期过程中添加咖啡因。
可选的是，在含有合适的碳源的BSM中培养的毕赤酵母生物质的CGC含量的改变可通过用补充有浓度高达1.0％(w/v)、优选在0.01-0.1％(w/v)之间的表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X100或聚乙二醇(PEG)的培养基来获得。在表面活性剂的存在下，作为对表面活性剂存在导致细胞壁破坏的防御机制，毕赤酵母提高细胞壁中CGC的量，从而富集CGC中的生物质。表面活性剂可以在细胞指数生长期过程中或在稳定生长期过程中加至培养基中。为了保证生产足够的细胞生物质，表面活性剂优选当生物质达到浓度高于20g/L、优选高于50g/L时加至培养基中。
毕赤酵母生物质的CGC含量还受到BSM中浓度高于它们通常值的某种盐的存在的影响。因此，毕赤酵母在补充有浓度在高达200mmol/L、优选在5-50mmol/L之间的钙、钴、铜、铁、镁和/或锰的盐酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐形式的BSM中的培养影响毕赤酵母生物质的CGC含量。
2.3-生成具有几丁质与葡聚糖的比高于15:85(％mol)的CGC的步骤
根据本发明，CGC中几丁质与葡聚糖的比通过用于毕赤酵母生物质生产的培养条件来调节。由毕赤酵母生产的CGC通常具有高达15:90(％mol)的几丁质与葡聚糖的比。根据本发明，CGC中几丁质与葡聚糖的比可有利地提高至高于15:85(％mol)，优选高于50:50(％mol)，通过将毕赤酵母在补充有浓度在40-180g/L之间、优选在60-120g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的BSM中培养。
CGC中几丁质与葡聚糖的比还可以提高至高于15:85(％mol)，优选高于50:50(％mol)，通过将毕赤酵母在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的BSM中培养，所述BSM中的所述咖啡因的终浓度为高达100mmol/L，优选在10-50mmol/L之间。咖啡因的存在影响毕赤酵母细胞生长并导致细胞壁的破坏。因此，作为对咖啡因存在的防御机制，毕赤酵母提高细胞壁中几丁质的量，从而提高CGC中几丁质与葡聚糖的比。咖啡因可以在细胞指数生长期过程中或在稳定生长期过程中加至培养基中。为了保证生产足够的细胞生物质，咖啡因优选当生物质达到浓度高于20g/L、优选高于50g/L时加至培养基中。
CGC中几丁质与葡聚糖的比还可以提高至高于15:85(％mol)，优选高于50:50(％mol)，通过在补充有浓度高达100mmol/L、优选在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的BSM中培养。葡萄糖胺的存在刺激酵母的细胞壁中几丁质的积累，从而提高CGC中几丁质与葡聚糖的比。葡萄糖胺优选在细胞指数生长期过程中加至培养基中。
CGC中几丁质与葡聚糖的比还可以提高至高于15:85(％mol)，优选高于50:50(％mol)，通过将毕赤酵母在高于6.5的pH下培养。由此施加到培养物的碱休克诱导CGC的几丁质与葡聚糖的比改变。
2.4.从毕赤酵母细胞壁提取天然生物复合物
毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，常用于制药工业作为宿主用于生产各种重组异源蛋白。因此，在这些工艺的产物回收后，毕赤酵母生物质是作为副产品获得，以高数量和低成本可供使用。因此，根据本发明的所述方法，来自药物工艺作为副产品得到的毕赤酵母可有利地用于制备上述天然生物复合物。
由包含20-95％(w/w)CGC，优选40-90％(w/w)以及高达50％(w/w)、优选高达35％(w/w)的含有甘露糖的多糖的毕赤酵母细胞壁制得天然生物复合粉，其中CGC中几丁质与葡聚糖的比高达15:90(％mol)、优选高于15:85(％mol)、更优选高于50:50(％mol)，其具有颗粒大小范围在5-1500μm之间，优选在30-400μm之间，表观堆积密度在0.05-1.0g/cm3之间，优选在0.5-1.0g/cm3之间，并且球度系数范围在0.20-0.95之间，其通过以下方法制备：
a)将毕赤酵母生物质与浓度在0.5-2.0M之间的碱性水溶液(NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3、K2CO3、CaCO3、NaHCO3或KHCO3，优选NaOH或NaHCO3)接触。该悬浮液包含在10-15％(w/v)之间的生物质含量；
b)在60-70℃之间的温度下搅拌所述碱性生物质悬浮液1-5小时、优选2小时以形成反应混合物；
c)将所述反应混合物冷却至30-45℃之间的温度后，通过离心或过滤将所述反应混合物的可溶性组分与碱性不可溶性组分分离；
d)用以下溶剂***的一种或几种洗涤所述碱性不可溶性组分：
i.水，反复洗涤直至混合物的pH和电导率分别在5.0-8.0之间和低于50μS/cm；
ii.盐水溶液，例如，磷酸盐缓冲液(PBS)(20.45g/L NaCl；0.46g/L KCl；10.14g/LNa2HPO4.7H2O；0.54g/L KH2PO4，pH7.2)，反复洗涤直至混合物的电导率在50-200μS/cm之间；
iii.乙醇(70％，v/v)；
iv.酸的水溶液，例如，盐酸(HCl)水溶液，，反复洗涤直至混合物的pH在5.0和8.0之间；
这些洗涤的目的是提高提取物中的溶解的细胞壁成分的去除，即，蛋白(通过用水和/或PBS溶液和/或HCl溶液洗涤)、脂质(通过用乙醇和/或HCl溶液洗涤)以及盐(通过用水和/或HCl溶液洗涤)。适当选择溶剂***的类型、所进行洗涤的次数以及它们所进行的顺序用于控制蛋白、脂质和灰分(ashes)中生物复合物的含量。
天然生物复合物中的CGC、含有甘露糖的多糖、蛋白、脂质和灰分的量通过控制本发明的制备方法的条件来调节。
2.5.从毕赤酵母生物质提取的天然生物复合物的干燥
由本发明的毕赤酵母的生物质制得的天然生物复合物采用本领域技术人员知晓的方法的一种干燥，但不限于此。各种工业干燥设备如冷冻干燥机、流化床干燥机、锥形干燥机、盘式干燥机、带式干燥机、真空盘式干燥机、旋转式干燥器、喷雾干燥机可用于获得干燥的生物复合物。
在本发明的一个实施方案中，湿的生物复合物用液氮冷冻干燥，接着冷冻干燥48小时。冷冻干燥的时间主要取决于起始材料的水分含量，并对其进行控制使得水分含量低于10％，优选低于5％。
在本发明的另一个实施方案中，湿的生物复合物在温度为60-80℃之间的空气干燥烘箱中干燥12-18小时。
有利的是，所述生物复合物在120-200℃之间、优选在130-150℃之间的温度范围下喷雾干燥。喷雾干燥所述生物复合物的一个好处是获得具有15-50μm之间、优选在25-35μm之间的可控的和均匀大小的颗粒，具有在0.25-0.95g/cm3之间、优选在0.45-0.75g/cm3之间的堆积密度并呈现基本上球形的形状，这有利于所得到的粉末/颗粒的下游处理。
取决于所采用的干燥方法，所干燥的天然生物复合物将以从低密度/高体积泡沫至高密度/紧凑粒料(pellet)范围的形式获得，其被用于调节物理性质。
本发明的优点在于根据制药工业的需要生产可进一步加工和研磨的干燥的生物复合物，寻求高可加工性。
2.6用于制备天然生物复合粉的研磨步骤
本发明的天然生物复合粉是通过本领域已知的用于生产粉末或颗粒的任何方法制备，如流化床制粒、高剪切制粒、喷雾干燥或湿法制粒。优选地，所述干燥的生物复合物通过本领域技术人员知晓的用于获得颗粒的任何工业碎裂和崩解设备进行研磨和制粒，如锤、轧辊、刀、刀片或盘。在该方法中采用的制粒机可以是低剪切的，如流化床制粒机、中等剪切或高剪切制粒机。
在本发明的一个实施方案中，在40-100℃之间的温度下干燥的天然生物复合物通过使其经过配备有刀冲击转子和在输出处配有范围在0.25-10mm的筛子、优选在输出处配有范围在0.25-1.0mm的筛子的碾碎机进行研磨。所得材料在具有范围在0.25-5mm的筛子、优选范围在0.25-0.5mm的筛子的相同设备中进行第二次加工。将所得颗粒通过具有范围在0.0125-2.5mm的筛子的振荡旋转筛磨机。
可选的是，干燥的天然生物复合物可以通过使其经过配备有圆锥形或V形转子，以及在输出处配有范围在0.25-10mm的筛子、优选在输出处配有范围在0.25-1.0mm的筛子的圆锥研磨机进行研磨。所使用的转子速度可以在从500rpm至5000rpm的范围。
在另一个替代方案中，天然生物复合物可以通过使其经过球磨机进行研磨。所使用的转子速度可以在从500rpm至1500rpm的范围。
在另一个替代方案中，天然生物复合物可以通过使其经过多用研磨机进行研磨。所使用的转子速度可以在从500rpm至5000rpm的范围。
另一种选择是使通过冷冻干燥或喷雾干燥或流化床干燥或圆锥干燥机干燥的天然生物复合物通过也被称作chilsonator的辊压实机，例如chilsonator IR520，一次或两次，或充分考虑的多次，以获得目的粉末。
在本发明中，生物复合粉以这样的方式制备使得其颗粒大小范围在5-1500μm之间，优选在30-400μm之间。
由上述任何方法获得的粉末通过本领域技术人员采用的任何校准方法进行校准，如在连续筛子进行筛选接着进行重力测定。例如，颗粒可以通过配有范围在0.05-1.5mm的筛子的振荡旋转筛磨机来校准。优选至少85％的颗粒应当具有在0.5μm至1500μm之间、优选范围在在200μm至500μm之间的颗粒大小范围。还优选细粉(fines)(即大小低于90μm的颗粒)残留以有利于粉末进一步压缩成片剂，优选低于1％。在一个优选的实施方案中，90％的颗粒具有低于355μm的大小，50％的颗粒具有低于250μm的大小并且少于10％的颗粒具有低于90μm的大小。
本发明的天然生物复合粉的特征在于具有最小可能的孔隙率的颗粒，优选小于2.5％，其通过调节干燥工艺的参数来控制，如干燥速度、时间和温度。颗粒形状可以为球形或圆柱形甚至层叠的，且取决于之前所进行的步骤组合，但最终形状优选为球形。
按照欧洲药典2.9.15(表观体积)，所获得的颗粒的表观堆积密度在0.05-1.0g/cm3的范围，优选在0.2-1.0g/cm3的范围，更优选在0.5-1.0g/cm3的范围。所获得的生物复合粉的填充密度包括在0.4-1.7g/cm3之间，优选在0.5-1.5g/cm3之间。
本领域技术人员采用如休止角、卡尔指数、豪斯纳比和流动时间的参数表征粉末的流动性质。本发明的优点在于生产的生物复合粉呈现休止角在20-40o之间，优选在25-30o之间。
在另一个实施方案中，所述粉末的卡尔指数在10％-25％之间，优选在15％-20％之间。根据欧洲药典2.9.36(粉末流动)中的分类，本发明的另一个优点在于获得具有豪斯纳比低于1且流动时间低于5s的粉末。
已经证实本发明的药物赋形剂提供改善的流动性能、高相容性和压缩性以及快速崩解的性质。更好的流动性是指粉末呈现的流动时间低于5s，比市售的最常见的广泛使用的赋形剂之一的微晶纤维素更好。显然，这是本发明的一个优点，因为物质的进料速度对于实现最终目标至关重要。
改善的压缩性是指使用较小的压缩力即可获得具有可接受的硬度和崩解时间的片剂。例如，采用本发明所述的生物复合物，15kN压缩力即足够用于获得硬度为7Kgf的满意的片剂。
本文提到的所有出版物和其它参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文，就如同每个单独的出版物或文献被具体地和单独地通过引用并入本文。本文所引用的出版物和文献并不承认是现有技术。
将通过参考以下实验细节更好地理解本发明，但本领域技术人员将容易理解的是，这些特定的详细实验仅用于说明如所附的权利要求所限定的本发明。
实施例
实施例1：在具有指数补料的补料分批生物反应器中培养生产毕赤酵母生物质
将毕赤酵母菌株DSM70877培养于标准基本盐培养基(BSM)(Pichia FermentationProcess Guidelines(毕赤酵母发酵工艺指南)，Invitrogen)，其具有以下组成(每升)：H3PO485％,26.7mL；CaSO4,0.93g；K2SO4,18.2g；MgSO4,.7H2O,14.9g；KOH,4.13g；消泡剂A(Sigma),0.75mL和4.35mL的痕量元素溶液(trace elements solution，PTM)。PTM溶液具有以下组成(每升)：CuSO4·5H2O,6g；NaI,0.08g；MnSO4·H2O,3g；Na2MoO4·2H2O,0.2g；H3BO3,0.02g；CoCl2·6H2O,0.5g；ZnCl2,20g；Fe2SO4·7H2O,65g；生物素,0.2g和H2SO4,5mL。所述PTM溶液分别进行无菌过滤并在BSM培养基在121℃灭菌30min(分钟)之后将其加入培养基。BSM补充有浓度40g/L的甘油，在121℃对其灭菌30min。
接种物是通过将培养物在含有甘油(40g/L)的BSM培养基中、30℃下于摇瓶中在恒温箱振荡器(250rpm)中孵育2天来制备。该预接种物用于以10％(v/v)接种250mL摇瓶，其在30℃以及250rpm下生长3天。
在起始工作体积为1.4L的2L生物反应器(BioStat B-plus,Sartorius)中进行培养。用控制的温度30℃±0.1和pH5.0±0.05操作生物反应器。通过添加还作为氮源的25％的氢氧化铵溶液来控制pH。通过自动改变搅拌速率(在300-1000rpm之间)和用纯氧充实空气流来控制DO浓度高于30％。起始批次期进行26小时。当观察到氧气消耗速率下降时启动补料分批模式，通过采用指数补料速率给生物反应器供给补充有每升甘油的24mL痕量元素PTM溶液，其中F＝F0×eμt，F是以g/h表示的补料速率，F0是起始补料速率(5.6g/h)，并且μ是所需特定生长速率，0.16h-1。
在起始分批培养过程中(26小时)，毕赤酵母细胞以最大特定生长速率0.17h-1生长并从开始的浓度为40g/L的甘油达到22g/L的生物质。这相当于每g甘油收获0.55g生物质，与公开的纯甘油(0.55g/g，由Oliveira et al.,2005)或粗甘油(0.57g/g，由Celik etal.,2008)中生长毕赤酵母的结果相似。
26小时后，当甘油耗尽，如搅拌速度的下降所指示的(相应于氧气消耗速率的下降)，启动指数补料的补料分批期，导致氧气消耗速率立即增加。培养41小时后生物质浓度达到104g/L。在补料分批期生物质收率稍微提高至消耗每g甘油得到0.63g生物质(接近于由Jahic et al.,2002发现的0.7g/g)。最终细胞浓度在其他作者采用纯甘油(75-120g/L)获得的结果的范围内(Chauhan et al.,1999；Oliveira et al.,2005)。
实施例2：在分批生物反应器中培养生产毕赤酵母生物质
毕赤酵母菌株DSM70877培养于具有实施例1中所述的组成的BSM中。BSM补充有浓度60g/L的甘油，在121℃对其灭菌30min。
除了甘油浓度是60g/L外，如实施例1所述，接种物通过将培养物在BSM培养基中孵育制备。
用起始工作体积为3.0L的5L生物反应器(BioStat B-plus,Sartorius)进行培养。用控制的温度30℃±0.1和pH5.0±0.05操作生物反应器。通过添加还作为氮源的25％的氢氧化铵溶液来控制pH。通过自动改变搅拌速度(在300-2000rpm之间)和用纯氧充实空气流来控制DO浓度高于50％。
分批培养运行32小时直至培养物通过耗尽碳源达到稳定生长期。在指数生长期期间，毕赤酵母细胞以特定生长速率0.18h-1生长。在运行结束时，从开始的54g/L的甘油浓度获得42g/L生物质。这相当于每g甘油收获0.79g生物质，其比实施例1所获得的值更高。
实施例3：用1M NaOH碱处理和用PBS溶液洗涤碱性不可溶性组分从毕赤酵母生物质提取天然生物复合物
离心(10000g，15分钟)如实施例1所述生产的毕赤酵母的培养肉汤(200mL)并弃去上清。湿的细胞沉淀(pellet)用1M NaOH(200mL)于65℃处理2h。悬浮液基于干基的的生物质含量为10.4％(w/v)。
离心(10000g，15分钟)反应混合物以从弃去的碱性可溶性组分分离碱性不可溶性组分。
用200mL去离子水洗涤碱性不可溶性组分两次，以去除碱性可溶性成分。然后，依次用相同体积的磷酸盐缓冲液(PBS)(20.45g/L NaCl；0.46g/L KCl；10.14g/LNa2HPO4.7H2O；0.54g/L KH2PO4，pH7.2)洗涤两次以去除残留蛋白，并用乙醇(70％，w/v)洗涤一次以去除脂质。最后用去离子水洗涤以去除乙醇和残留的盐。冷冻干燥所得天然生物复合物(48h)。
为了确定糖中天然生物复合物的组成，进行两个酸水解步骤；三氟乙酸(TFA)用于水解含有甘露糖的多糖和CGC的葡聚糖部分，而强酸(HCl)对于CGC中的几丁质组分的定量是必要的。对于TFA水解，冷冻干燥的生物复合物样品(约5mg)在去离子水(5mL)中重悬并加入0.1mL99％的TFA。120℃下水解2小时。对于HCl水解，冷冻干燥的生物复合物样品(约5mg)在HCl12N(7.5mL)中重悬。120℃下水解5小时。水解产物均用于通过采用CarboPac PA10柱(Dionex)、配有电流检测器的液相色谱(HPLC)对单糖组成进行定量。用氢氧化钠(NaOH4mM)作为洗脱剂以流速0.9mL/min于30℃进行分析。葡萄糖(Sigma)、甘露糖(Sigma)和葡萄糖胺(Sigma)用作标准品，如聚合物样品一样经受相同的水解步骤。
为了确定蛋白中生物复合物的含量，在密封的小瓶中用2M NaOH(7mg:1ml)于120℃水解冷冻干燥的样品15min。根据修改的Lowry方法，将离心(10000g，10分钟)所得上清用于蛋白分析。1-mL份量的碱性硫酸铜试剂加入1mL上清(必要时稀释)并室温放置10min。加入3-mL份量的稀释的Folin-Ciocalteu试剂，并且室温孵育30min。在750nm读取吸光度。牛血清白蛋白(BSA，Sigma)用作标准品。
通过将冷冻干燥的样品在550℃的温度热分解48小时来确定生物复合物中的灰分含量(ash content)。
采用Setaram Calorimeter(型号DSC131，法国)在保护性氮气气氛下进行冷冻干燥的生物复合物的差示扫描量热(Differential Scanning Calorimetry，DSC)分析。将准确称量的干燥材料置于铝杯中并进行不透气密封。从25-450℃在氮气中以10℃/min的扫描速率进行测定。
采用所述步骤从毕赤酵母生物质制得的天然生物复合物为水含量约6％(w/w)的微黄色粉末。它代表了细胞的干重的23.6％。如通过TFA和HCl水解产物进行的组成分析所确定的，所述生物复合物由42％(w/w)的CGC和28％(w/w)的含有甘露糖的多糖组成。CGC的葡萄糖(35％，w/w)和葡萄糖胺(7％，w/w)含量相应于几丁质与葡聚糖的比为16:84(％mol)。此外，采用实施例中所述步骤获得的生物复合物还具有9.5wt％的总蛋白含量，以及15.0wt％的灰分含量。
由毕赤酵母制备的天然生物复合物的热性能显示，它呈现宽的约50-100℃的吸热峰，这可以归因于与生物复合物结合的水的蒸发(图1)。强吸热峰表明生物复合物呈现高保水能力。生物复合物在205.18℃和288.38℃显示两个分解放热峰。这两个分解放热峰的存在指示不同聚合物的存在，可能是CGC和含有甘露糖的多糖的混合物。此外，非常低量的生物复合物的峰焓显示生物材料具有非常低的结晶性。
实施例4：用5M NaOH碱处理和用1M HCl溶液洗涤碱性不可溶性组分以从毕赤酵母生物质提取天然生物复合物
离心(10000g，15分钟)如实施例1所述生产的毕赤酵母的培养肉汤(200mL)并弃去上清。湿的细胞沉淀(pellet)用5M NaOH(200mL)于60℃处理2h。悬浮液基于干基的生物质含量为10.4％(w/v)。
通过离心(10000g，15分钟)从碱性不可溶性组分弃去碱性可溶性组分。
用200mL去离子水重悬碱性不可溶性组分并通过加入12N HCl调节悬浮液的pH为7.0。然后，用去离子水(8×200mL)反复洗涤。在洗涤步骤中检测悬浮液pH和电导率，当pH和电导率分别为6.3和15μS时结束洗涤。将所得天然生物复合物冷冻干燥48h。
如实施例3所述，确定由该步骤制得的天然生物复合物的组成。还如实施例3所述进行DSC。
采用该实施例所述步骤从毕赤酵母生物质制得的天然生物复合物为水含量低于5％(w/w)的浅(pale)粉末。它代表了细胞干重的12.4％。如通过TFA和HCl水解产物进行的组成分析所确定的，所述生物复合物由89％(w/w)的CGC和仅1.7％(w/w)的含有甘露糖的多糖组成。CGC的葡萄糖(71％，w/w)和葡萄糖胺(18％，w/w)含量相应于几丁质与葡聚糖的比为20:80(％mol)。此外，它还具有3.0wt％的总蛋白含量并且在样品中未检测到灰分。
由毕赤酵母制备的天然生物复合物的热性能显示，它也呈现约50-100℃的吸热峰，这可以归因于与生物复合物结合的水的蒸发(图1)。与实施例3中所获得的生物复合物相比较弱的吸热峰显示它呈现较弱的保水能力。该生物复合物在320℃显示单个强分解放热峰，其表明生物材料与实施例3中所获得材料相比具有较高的结晶性。
实施例5：毕赤酵母培养条件对生物质中CGC含量和对CGC的几丁质与葡聚糖的比的影响
将毕赤酵母菌株DSM70877培养于实施例1中所述组成的BSM中。以分批摇瓶在恒温箱振荡器(250rpm)中于30℃进行培养试验96小时，除了研究起始pH作用的试验花费48小时外。未在任何分析中控制pH，但在整个运行过程中对其进行监测。测试了几个培养条件，如表1所示。在试验结尾时，采用如实施例4中所述的步骤从毕赤酵母生物质提取天然生物复合物。
表1：不同培养条件下的毕赤酵母分批摇瓶试验
在这些试验的分批条件下，观察到通过用补充有浓度在40-60g/L之间的甘油的BSM培养有利于细胞生长(CDW>8.00g/L)，浓度100g/L的甘油则降低。山梨糖醇也是用于生长的良好碳源。补充MnCl2或CaSO4也导致提高的细胞生长。另一方面，大幅度抑制细胞生长(CDW<4.00g/L)的条件是采用半乳糖(30g/L)、乳糖(40g/L)或蔗糖(40g/L)作为碳源、补充咖啡因、起始pH低于3.0或高于8.5。
毕赤酵母生物质中最高CGC含量(>15％，w/w)是用补充有浓度≥60g/L甘油作为碳源的BSM培养获得。尽管采用乳糖和蔗糖作为碳源导致降低的细胞生长，生物质仍具有提高的CGC含量(21-23％，w/w)。补充有咖啡因和葡萄糖胺的BSM培养基也导致高CGC含量(分别为25和17％(w/w))。补充有浓度在140-200mmol/L之间的MgSO4、MnCl2、CaSO4或CaCl2的BSM培养基也导致高CGC含量(在16-27％之间，w/w)。起始pH高于7.0也大幅度提高毕赤酵母生物质中的CGC含量(高于19％，w/w)。
提高的几丁质与葡聚糖的比(高于15:85，％mol)是由采用葡萄糖、乳糖或蔗糖作为碳源、补充咖啡因或葡萄糖胺以及起始pH在6.0-10.0之间的培养获得。
实施例6：干燥和研磨天然生物复合物
通过实施例3中所述的步骤获得的天然生物复合物与去离子水混合(31g冷冻干燥的生物复合物+900mL去离子水)以产生浓的均匀浆液。将生物复合物浆液铺在抗粘的托盘(大约0.5mm厚的层)中并置于70℃的烘箱中16小时。
使干燥的天然生物复合物(31.231g)通过有1mm筛子的碾碎机、之后通过具有0.5mm孔径筛子的振荡旋转研磨机(Erweka pilot-plant device)以获得颗粒大小降低的高密度颗粒。通过将粉末经过振荡旋转研磨设备中的0.75mm筛子、通过0.50mm筛子且最后经过相同设备中的0.35mm的筛子来进行校准。由此获得的粉末的粒度分布如下(表2)：
表2：研磨和校准后的从70℃干燥的生物复合物获得粉末的粒度分布
平均表观密度是0.64g/cm3并且振实密度(tapped density)为0.71g/cm3。
实施例7：采用由毕赤酵母生物质制备的天然生物复合粉作为赋形剂制备片剂
如实施例5所述获得的生物复合粉以百分比范围为20-85％在典型的电流直接压缩配方(typical current direct compression formulae)中用作粘合剂/填充剂如下(表3)：
表3：用于用由毕赤酵母生物质制备的天然生物复合物生产片剂的电流直接压缩配方
物质 ％ mg/片剂
生物复合物 50.000 50.00
一水乳糖 30.000 30.00
胶体二氧化硅 6.667 6.67
羟基乙酸淀粉钠 8.333 8.33
硬脂酸镁 5.000 5.00
总计 100.000 100.00
首先目测分析最终粉末混合物的流变学特性。此后测定休止角并且所获得的卡尔指数值是9.8，其表明粉末具有非常好的流动性(低于12)。在Piccola型号B-10机器(来自RIVA的用于研发的高科技旋转压片机)中采用7mm直径的圆凹冲孔(round concave punch)进行片剂压缩试验。所得片剂具有100mg的理论重量(95-105mg)、7.5Kgf的硬度、小于1％的脆碎度(friability)和在37℃水中少于5分钟的崩解时间。
参考文献
Celik E,Ozbay N,Oktar N,Calik P(2008)Ind Engineer Chem Res47(9),2985-2990.
Oliveira R,Clemente JJ,Cunha AE,Carrondo MJT(2005)J Biotechnol116(1),35-50
Jahic M,Rotticci-Mulder JC,Martinelle M,Hult K,Enfors SO(2002)Bioprocess Biosyst Eng24,385–393.
Chauhan AK,Arora D,Khanna N(1999)Process Biochemistry34(2),139-145.

Claims (52)

1.生物复合粉，其包含20-95％(w/w)的几丁质-葡聚糖复合物以及含有甘露糖的多糖，所述生物复合粉提取自毕赤酵母的生物质，其中，所述含有甘露糖的多糖的含量最高为50％(w/w)，所述生物复合粉的颗粒大小范围在5-1500μm之间，其中所述生物复合粉的表观堆积密度为0.05-1.0g/cm3，并且其中所述生物复合粉的卡尔指数在10％和25％之间。
2.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中，所述含有甘露糖的多糖的含量最高为25％(w/w)。
3.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述复合粉的颗粒大小范围在30-400μm之间。
4.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述生物复合粉的表观堆积密度在0.5-1.0g/cm3之间。
5.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述生物复合粉的粒度分布是：90％的颗粒的大小低于355μm，50％的颗粒的大小低于250μm并且少于10％的颗粒的大小低于90μm。
6.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比最高可达15:85。
7.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于15:85。
8.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于50:50。
9.根据权利要求1所述的生物复合粉，其中所述生物复合粉提取自保藏编号为DSM70877的毕赤酵母菌株的生物质。
10.制备权利要求1-9中任一项所述的生物复合粉的方法，其特征在于以下顺序步骤：
a)将毕赤酵母生物质与浓度在0.5-5.0M之间的碱性水溶液接触，其中所述生物质在悬浮液中的浓度在10-15％(w/v)之间；
b)在60-90℃之间的温度下搅拌所述碱性生物质悬浮液1-5小时的时间以形成反应混合物；
c)将所述反应混合物冷却至30-45℃之间的温度，以及冷却后，通过离心或过滤将所述反应混合物的可溶性组分与所述碱性不可溶性组分分离；
d)用以下溶剂***的一种或几种洗涤所述碱性不可溶性组分以形成浆液：
i.水，
ii.盐水溶液，
iii.70％v/v乙醇，或
iv.酸的水溶液；
e)采用以下步骤中的一种干燥所述浆液：
ix.用液氮冷冻，接着进行冷冻干燥；
x.于温度为60-80℃之间的烘箱中干燥12-18小时；
xi.于120-200℃之间的温度下喷雾干燥1-10秒之间的时间；或
xii.以70℃-90℃之间的进气进行流化床干燥；
f)通过以下方式研磨干燥的材料以获得粉末：使其一次或多次经过碾碎机、圆锥研磨机、球磨机、多用研磨机或辊压机，其输出处配有范围为0.25-10mm的筛子，以500-5000rpm之间的转子速度进行操作；以及
g)通过使其一次或多次经过配有范围为0.05-1.5mm的筛子的振荡旋转筛磨机来校准所述粉末。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述碱性水溶液是NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3、K2CO3、NaHCO3或KHCO3。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤d)ii)中的所述水溶液是磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液包含20.45g/L NaCl、0.46g/L KCl、10.14g/L Na2HPO4.7H2O、0.54g/LKH2PO4，并且pH为7.2。
13.根据权利要求10所述的方法，其中步骤d)iv)中的所述酸的水溶液是盐酸(HCl)的水溶液。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述喷雾干燥是在130-150℃之间的温度下进行。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，通过培养于补充有浓度在30-60g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的标准基本盐培养基，在分批、补料分批或连续的模式下，控制温度为28-32℃，控制pH为4.5-5.5，控制溶解氧浓度(DO)为高于10％，获得几丁质-葡聚糖复合物含量最高可达15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶解氧浓度(DO)控制为高于30％。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶解氧浓度(DO)控制为高于50％。
18.根据权利要求10所述的方法，其中，通过培养于补充有浓度在40-50g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的标准基本盐培养基中，获得几丁质-葡聚糖复合物含量最高可达15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
19.根据权利要求10所述的方法，其中，通过培养于补充有浓度在60-180g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的基本盐培养基中，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，通过培养于补充有浓度在80-120g/L之间的甘油、山梨糖醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的基本盐培养基中，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
21.根据权利要求10所述的方法，其中，通过不进行温度控制来培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
22.根据权利要求10所述的方法，其中，通过控制温度于28-32℃直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高温度5-20℃来培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
23.根据权利要求10所述的方法，其中，通过控制温度于28-32℃直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高温度10-15℃来培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中当达到稳定生长期时，所述温度在6-24小时期间提高。
25.根据权利要求10所述的方法，其中，通过不进行pH控制来培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
26.根据权利要求10所述的方法，其中，通过控制pH于3.5-6.5直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高pH 1.0-3.0来培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述毕赤酵母生物质是以高于15％(w/w)的几丁质-葡聚糖复合物含量获得，通过控制pH于3.5-6.5直至达到稳定生长期然后在2-48小时期间提高pH 2.0-3.0来培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中当达到稳定生长期时，所述pH在6-24小时期间提高。
29.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的基本盐培养基中培养，其中基本盐培养基中所述咖啡因的最终浓度最高可达100mmol/L，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
30.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的基本盐培养基中培养，其中基本盐培养基中所述咖啡因的最终浓度在10-50mmol/L之间，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
31.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有葡萄糖胺的基本盐培养基中培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质，所述基本盐培养基中所述葡萄糖胺的浓度最高可达100mmol/L。
32.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有浓度在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的基本盐培养基中培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
33.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有表面活性剂的基本盐培养基中培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质，所述基本盐培养基中所述表面活性剂的浓度最高可达1.0％(w/v)。
34.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有浓度在0.01-0.1％(w/v)之间的表面活性剂的基本盐培养基中培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
35.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有浓度在1-200mmol/L之间的钙、钴、铜、铁、镁和/或锰的盐酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐形式的基本盐培养基中培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
36.根据权利要求10所述的方法，其中，通过在补充有浓度在5-50mmol/L之间的钙、钴、铜、铁、镁和/或锰的盐酸盐、硫酸盐和/或磷酸盐形式的基本盐培养基中培养，获得几丁质-葡聚糖复合物含量高于15％(w/w)的所述毕赤酵母生物质。
37.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在40-180g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的基本盐培养基中培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于15:85。
38.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在60-120g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的基本盐培养基中培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于15:85。
39.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在40-180g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的基本盐培养基中培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于50:50。
40.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在60-120g/L之间的葡萄糖、蔗糖、乳糖及其混合物或含有这些化合物的物质作为碳源的基本盐培养基中培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于50:50。
41.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的基本盐培养基中培养，所述基本盐培养基中的所述咖啡因的终浓度最高可达100mmol/L，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于15:85。
42.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的基本盐培养基中培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于15:85。
43.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有咖啡因或含有咖啡因的物质的基本盐培养基中培养，其中所述基本盐培养基中的所述咖啡因的终浓度在10-50mmol/L之间，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于50:50。
44.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在补充有浓度在10-50mmol/L之间的葡萄糖胺的基本盐培养基中培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于50:50。
45.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在高于6.5的pH下培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于15:85。
46.根据权利要求10所述的方法，其中，通过将毕赤酵母在高于6.5的pH下培养，所述几丁质-葡聚糖复合物中几丁质与葡聚糖的摩尔比高于50:50。
47.根据权利要求10所述的方法，其中所述毕赤酵母生物质是作为制药工业副产品获得。
48.权利要求1-9中任一项所述的生物复合粉作为药物赋形剂的用途。
49.权利要求1-9中任一项所述的生物复合粉作为化妆品赋形剂的用途。
50.权利要求1-9中任一项所述的生物复合粉在制备药物制剂中的用途。
51.权利要求1-9中任一项所述的生物复合粉在制备化妆品制剂中的用途。
52.权利要求1-9中任一项所述的生物复合粉在制备食品制剂中的用途。
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