CN107338264B - 病毒介导的基因沉默的vigs载体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了FoMV介导的VIGS载体的构建及其在单子叶植物基因沉默中的应用。本发明的FoMV介导的VIGS载体为狗尾草花叶病毒(Foxtail Mosaic Virus,FoMV)介导外源片段沉默植物目的基因的载体。本发明的FoMV介导的VIGS载体克服了重要经济作物遗传转化周期长、步骤繁琐等困难，不仅为单子叶植物的基因功能研究提供强有力的工具，也为大规模地研究单子叶植物功能基因组学提供高效的技术手段，具有重要的科学意义和重大应用价值。

Description

病毒介导的基因沉默的VIGS载体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及病毒介导的基因沉默的VIGS载体，特别涉及FoMV介导的基因沉默的VIGS载体。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)是利用植物对RNA病毒防御机制发展的技术。重组的植物病毒携带被侵染植物的基因序列并侵染植物，病毒侵染将诱发植物内源基因转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional genesilencing，PTGS)，使植物内源基因的RNA被特异降解，从而诱导植物内源基因沉默，引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。VIGS技术不需要植物的遗传转化或获取突变体，能简单、快速、瞬时、高效、特异地下调特定基因的表达，VIGS已成为植物基因功能研究领域的强大技术工具。VIGS技术是既是反向遗传学方法又是正向遗传学方法对相关功能基因进行研究。随着VIGS技术发展的不断成熟和研究的不断深入，该技术已经广泛的应用在植物抗性、生长发育以及代谢调控等相关功能基因的研究鉴定，在植物性状改良和植物保护等方面具有良好的发展及应用前景。
VIGS在基因功能研究方面具有突出的优势，众多VIGS载体的成功构建及应用极大地增加了用于VIGS进行基因功能分析的植物种类；但每个VIGS载体病毒都有自身的寄主范围，对于不同寄主的植物往往需要不同的病毒载体。尽管现在应用VIGS技术在双子叶植物功能基因的研究方面发挥了重要的作用，然而针对单子叶植物尤其是重要的经济作物构建适合的VIGS***则具有更实际的应用价值。
目前单子叶植物功能基因组研究主要依赖于基因的自然突变、T-DNA***突变系及转基因介导的RNA沉默。虽然这些方法在研究中已取得了许多重要的结果，然而这些方法非常耗时；另外T-DNA***基因的数目有限，有兴趣的基因常没有***突变体。采用VIGS技术比传统的方法节省时间。目前构建的VIGS载体有5个载体用于单子叶植物的研究：1)大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)(Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue G P.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocotplant[J].Plant Journal,2002,30(3):315-327.)；2)雀麦花叶病毒(Brome mosaicvirus,BMV)(Ding X S,Schneider W L,Chaluvadi S R,Mian M A，Nelson RS.Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector forgene silencing in monocotyledonous hosts[J].Mol Plant Microbe Interact,2006,19(11):1229-1239.)介导的RNA病毒VIGS载体***；3)竹花叶病毒和它的卫星RNA(Bamboomosaic virus and its satellite RNA)(Liou MR,Huang YW,Hu CC,Lin NS,Hsu YH.Adual gene-silencing vector system for monocot and dicot plants.PlantBiotechnol[J].2014,12:330-343)介导的VIGS***在烟草和短柄草上的应用；4)水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus,RTBV)DNA病毒VIGS载体***，通过农杆菌转化，实现了对水稻内源基因的高效沉默(Purkayastha A，Mathur S，Verma V，Sharma S，Dasgupta I.Virus-induced gene silencing in rice using a vector derived from aDNA virus[J].Planta,2010,232(6):1531–1540.)；5)最近报道，黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)介导的VIGS在玉米上得到了应用(Wang R,Yang X,Wang N,Liu X,Nelson RS,Li W,Fan Z,Zhou T.An efficient virus-induced gene silencing vectorfor maize functional genomics research[J].Plant Journal,2016，86:102-115)。BMSV在单子叶植物大麦和小麦上建立了沉默***；BMV在水稻和玉米、水稻上建立了应用。然而，这些VIGS***仍有一些缺陷：基因组结构复杂，对温度要求相对敏感，不能对特定寄主的所有品种产生侵染或发生沉默表型等，使得现有的用于单子叶植物的VIGS载体还不能对单子叶植物进行大规模的基因功能分析。为了更好地进行单子叶植物植物功能基因组的研究，目前迫切需要构建新的具有广泛寄主的单子叶植物的VIGS载体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种病毒诱导的基因沉默载体。
本发明提供的病毒诱导的基因沉默载体是狗尾草花叶病毒(Foxtail MosaicVirus,FoMV)介导外源片段沉默植物目的基因的载体。
上述FoMV是马铃薯X病毒属，寄主范围广泛，包括56种禾本科和至少35种双子叶植物。FoMV为正向单链(ss)RNA病毒，其基因组由5’帽子结构、3’poly-A尾巴结构和5个主要开放阅读框(ORFs)组成。五个主要ORF分别编码一个功能蛋白。ORF1是编码复制酶相关蛋白，其功能与复制、转录及戴帽活性有关；ORF2、ORF3和ORF4亚基因组分别编码TGB1、TGB2和TGB3组成三基因盒，这个三基因盒是病毒在细胞之间移动所必须的；ORF5亚基因组编码外壳蛋白，其功能则和病毒基因体的包被及病毒在宿主内的移动有关。
本发明基于FoMV设计了可以在植物中有效使用的新的VIGS载体，可应用于植物基因的功能研究，尤其是在单子叶植物的研究中，如大麦、小麦、谷子和玉米等。
本发明提供的病毒诱导的基因沉默载体包括可转移的核苷酸序列和允许所述可转移的核苷酸序列转入植物基因组中的边界序列；
所述可转移的核苷酸序列包括启动子、重组FoMV的cDNA序列和终止子序列；
所述允许可转移的核苷酸序列转入植物基因组中的边界序列是植物中常用的表达载体的骨架序列；
所述重组FoMV的cDNA序列包含至少两个FoMV亚基因组启动子，分别将其命名为第一个亚基因组启动子和第二个亚基因组启动子；所述第一个亚基因组启动子用于启动外源核苷酸序列的转录；所述第二个亚基因组启动子用于启动FoMV自身基因的转录。所述重组FoMV的cDNA序列中可连接靶基因序列，优选为反向重复序列。
通常，所述第一个亚基因组启动子和所述第二个亚基因组启动子都源自相同的FoMV ORF，例如它们可以是外壳蛋白(CP)亚基因组启动子或三基因盒蛋白(TGB)亚基因组启动子。
在本发明的一个具体实施例中，所述重组FoMV的cDNA序列包含至少两个FoMV外壳蛋白CP亚基因组启动子，分别将其命名为第一个CP亚基因组启动子和第二个CP亚基因组启动子；所述第一个CP亚基因组启动子用于启动外源核苷酸序列的转录；所述第二个CP亚基因组启动子用于启动FoMV外壳蛋白CP基因编码序列的转录。
优选地，所述载体包括在植物中复制和运动所需的全部序列，例如，一个有侵染性的cDNA克隆，其中，cDNA编码整个FoMV基因组(参见例如图1A，序列1)，而且还包括外源核苷酸序列和启动该序列转录的第一个CP亚基因组启动子，优选地，外源核苷酸序列为期望沉默的靶基因的反向重复序列，该序列转录后可形成发夹结构。在本发明的具体实施例中，外源核苷酸序列来自靶基因序列，长度为40至70个核苷酸，更优选为50至65个核苷酸，具体为55或60。
所述可转移的核苷酸序列位于所述边界序列之间，并且能够在合适的条件下转入植物细胞中。通常通过农杆菌介导方法整合到受体植物的基因组中。
所述外源核苷酸序列并非FoMV自身的序列，它在FoMV病毒基因组中不是天然存在的。
上述载体中，所述载体含有FoMV RNA依赖的RNA聚合酶的基因编码序列、FoMV三基因盒的基因编码序列和FoMV外壳蛋白CP的基因编码序列。在本发明的实施例中，使用的是FoMV-P9的cDNA克隆(Robertson等人，2000)。该cDNA序列如序列1所示。在cDNA序列内，优选保留所有天然的FoMV ORF，即RNA聚合酶、三基因盒和外壳蛋白。然而，一个或多个序列可以被删除，条件是删除后的cDNA在植物体内仍具有***侵染性。
上述载体中，所述第一个CP亚基因组启动子位于所述FoMV三基因盒的基因编码序列的3’端；所述第二个CP亚基因组启动子位于所述FoMV外壳蛋白CP的基因编码序列的5’端；所述第一个CP亚基因组启动子包含FoMV CP亚基因组启动子的全部或部分序列；所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子包含相同的序列。例如，两个CP亚基因组启动子都包含天然的FoMV外壳蛋白CP亚基因组启动子，在本发明的具体实施例中，所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子的核苷酸序列均为序列1第5202至5371所示的大小为170bp的序列，但此处也可以使用比序列1第5202至5371所示的大小为170bp的序列稍长或更短的序列。
上述载体中，所述外源核苷酸序列位于所述第一个CP亚基因组启动子的3’端，所述第二个CP亚基因组启动子的5’端，其由所述第一个CP亚基因组启动子驱动转录。
上述载体中，所述启动子包括可在植物细胞中表达的启动子，可以是几乎在所有植物组织中高水平表达的花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子，也可以是诱导型启动子，例如GST启动子或DEX启动子。在本发明的具体实施例中，所述启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或含有双增强子的CaMV 35S启动子。
上述载体中，所述终止子可以为Nos终止子。
上述载体中，所述载体还包括poly-A序列，其位于Nos终止子的5’端。
上述载体中，所述边界序列来源于根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens。
上述载体中，所述外源核苷酸序列通过多克隆位点***所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子之间。所述多克隆位点位于所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子之间，以便***外源核苷酸序列；在本发明的具体实施例中，所述多克隆位点具体为HpaI、MluI、XhoI和AscI。
上述载体中，所述外源核苷酸序列是对应于植物靶基因或靶基因家族的保守序列的一段序列；所述外源核苷酸序列是与靶基因反向互补的序列，所述外源核苷酸序列的大小为100-300bp；所述外源核苷酸序列是靶基因的反向重复序列，所述反向重复序列转录后形成发卡结构；所述反向重复序列由靶基因的正向序列和靶基因的反向互补序列组成；所述靶基因的正向序列和所述靶基因的反向互补序列的大小均为40-70bp。
上述载体中，所述靶基因可以为与植物生长、发育、植物抗病或植物非生物胁迫途径相关的基因。
在本发明的一个具体实施例中，所述载体为将所述可转移的核苷酸序列***植物T-DNA载体中得到的载体，所述植物载体具体为pYL44，pYL44是一种含有双增强子的CaMV35S启动子和NOS终止子的以pBIN19为骨架的T-DNA载体。所述载体具体为FoMV-sg载体，所述FoMV-sg载体为将序列10所示的DNA分子***pYL44载体的StuI和XbaI酶切位点间，且保持pYL44载体的其他序列不变得到的载体。
上述载体的构建方法也属于本发明的保护范围。
上述构建方法包括将上述外源核苷酸序列即靶序列克隆到所述载体的多克隆位点中的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种用VIGS技术沉默植物组织中靶基因的方法。
本发明提供的VIGS技术沉默植物组织中靶基因的方法包括将上述载体转入植物组织中的步骤。具体步骤如下：将用于沉默植物靶基因的外源核苷酸序列通过上述载体导入植物中，得到导入外源片段的植物；用所述导入外源片段的植物的汁液侵染所述植物，实现植物靶基因的沉默。
本发明提供的用VIGS技术沉默植物组织中靶基因的方法可以使植物组织中对应的靶基因的mRNA 50％以上被沉默。所述沉默通常指下调基因表达。沉默的程度可以是完全地也可为部分地沉默，但更通常地，沉默是部分的。因此，所述沉默不应被视为要求完全沉默。
上述方法中，所述植物组织是植株或培养物中的任何植物组织。优选地，植物组织是处于2-3叶期的植物组织。
上述方法中，所述载体利用了农杆菌介导的T-DNA转移到植物组织中。具体是通过农杆菌介导的T-DNA转移将载体引入植物细胞中，转移序列可以瞬时地整合到植物(细胞)基因组中。
上述方法中，所述植物为C3植物或C4植物或单子叶植物或禾本科植物；所述植物具体为烟草、扁豆、苜蓿、大麦、小麦、谷子、水稻、柳枝稷或玉米。
本发明还有一个目的是提供一种分析靶基因特性或研究靶基因功能的方法。
本发明提供的分析靶基因特性或研究靶基因功能的方法包括如下步骤：
1)用上述方法在植物、植物的一部分或在植物生长发育某一阶段沉默靶基因；
2)观察靶基因被沉默后的植物表型。
本发明还有一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段为序列1第5202-5371位所示的DNA片段或含有序列1第5202-5371位的DNA片段或序列1第5202-5371位所示的DNA片段的部分片段。
如下a1)-a5)中任一所述的物质也属于本发明的保护范围：
a1)来源于上述载体的RNA转录物；
a2)含有来源于上述载体的RNA转录物的病毒或病毒颗粒；
a3)含有上述载体的试剂盒；
a4)含有上述载体的宿主细胞，这些宿主细胞可以是植物细胞，也可以是微生物(特别是细菌和农杆菌)细胞；
a5)含有或瞬时表达上述载体的植物组织。
本发明的最后一个目的是提供序列1第5202-5371位所示的DNA片段或含有序列1第5202-5371位的DNA片段或序列1第5202-5371位所示的DNA片段的部分片段的新用途。
本发明提供了序列1第5202-5371位所示的DNA片段或含有序列1第5202-5371位的DNA片段或序列1第5202-5371位所示的DNA片段的部分片段在制备VIGS载体中的应用。
上述载体或序列1第5202-5371位所示的DNA片段或含有序列1第5202-5371位的DNA片段或序列1第5202-5371位所示的DNA片段的部分片段在沉默植物目的基因中的应用也属于本发明的保护范围。
上述载体或序列1第5202-5371位所示的DNA片段或含有序列1第5202-5371位的DNA片段或序列1第5202-5371位所示的DNA片段的部分片段在分析靶基因特性或研究靶基因功能中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明构建了由FoMV介导的适用于单子叶植物功能基因研究的VIGS载体，该载体可将大麦、小麦和谷子等单子叶植物的内源基因高效沉默。本发明利用FoMV介导的VIGS载体，成功地沉默大麦的PDS(phytoene desaturase)基因和ChlH(Cloroplastosalterados1)基因、小麦和谷子的PDS基因和CLA1(Cloroplastos alterados1)基因以及谷子的IspH基因，上述基因的沉默会导致大麦、小麦和谷子出现光漂白、白化或褪绿的表型。此外，FoMV介导的VIGS载体是首个在谷子中报道并成功应用的VIGS载体(谷子是重要的C4模式植物)。本发明的FoMV介导的VIGS载体克服了重要经济作物遗传转化周期长、步骤繁琐等困难，不仅为单子叶植物的基因功能研究提供强有力的工具，也为大规模地研究单子叶植物功能基因组学提供高效的技术手段，具有重要的科学意义和重大应用价值。
附图说明
图1为FoMV的基因组结构和FoMV侵染性克隆载体。图1A为FoMV基因组结构示意图，其中，长方块代表开放阅读框(ORF)，152kDa蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶；三种蛋白 26kDa、11.3kDa和5.8kDa统称为三基因盒(TGB)，其功能可能是参与细胞与细胞间的运动蛋白；5A蛋白是由体内合成；24kDa外壳蛋白(CP)位于3’端；图1B为pFoMV-wt载体示意图，其中，LB为左边界，RB为右边界；FoMV克隆位于CaMV 35S启动子与NOS终止子的T-DNA二元载体之间，pFoMV-wt载体3’末端加入70个A；图1C为pFoMV-sg载体示意图，其中，pFoMV-sg是以pFoMV-wt载体为骨架载体；图1D为pFoMV-wt和pFoMV-sg侵染大麦的症状及RT-PCR检测的结果。
图2为FoMV-HvPDS和FoMV-HvChlH的PCR和酶切鉴定结果。图2A为PCR鉴定结果；其中，M：Marker；泳道1-2：FoMV-HvChlH的PCR鉴定结果；引物分别为F2/F6和F3/F6；泳道3-4：FoMV-HvPDS的PCR鉴定结果；引物分别为F2/F5和F3/F5；图2B为双酶切鉴定结果；其中，M：Marker；泳道5-6：FoMV-HvChlH及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果；泳道7-8：FoMV-HvPDS及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果。
图3为FoMV介导的VIGS载体在大麦上的应用。图3A为沉默HvPDS的大麦植株(FoMV-HvPDS)、沉默HvChlH的大麦植株(FoMV-HvChlH)和对照植株(pFoMV-sg)在侵染21天时第三片叶子上的沉默表型，Bar＝1cm；图3B为沉默HvPDS的大麦植株(FoMV-HvPDS)、沉默HvChlH的大麦植株(FoMV-HvChlH)和对照植株(pFoMV-sg)的实时定量PCR检测结果，其中，***代表P<0.01。
图4为FoMV-SiPDS、FoMV-SiCLA1和FoMV-SiISPH的PCR和酶切鉴定结果。图4A为PCR鉴定结果；其中，M：Marker；泳道1-2：FoMV-SiPDS的PCR鉴定结果；引物分别为F2/F10和F3/F10；泳道3-4：FoMV-SiCLA1的PCR鉴定结果；引物分别为F2/F11和F3/F11；泳道5-6：FoMV-SiISPH的PCR鉴定结果；引物分别为F2/F12和F3/F12。图4B为双酶切鉴定结果；其中，M：Marker；泳道7-8：FoMV-SiPDS质粒及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果；泳道9-10：FoMV-SiCLA1质粒及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果；泳道11-12为：FoMV-SiISPH质粒及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果。
图5为FoMV介导的VIGS载体在谷子上的应用。图5A、图5C和图5E分别为对照植株(pFoMV-sg)、沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)、沉默SiCLA1的谷子和沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)在侵染第24天时谷子第七片叶子(7L)，39天时第十片叶子(10L)和55天时第十三片叶子(13L)上的沉默表型；图5B、图5D和图5F分别为对照植株(pFoMV-sg)、沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)、沉默SiCLA1的谷子和沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)在侵染24天，39天和55天时SiPDS、SiCLA1和SiIspHmRNA的实时定量PCR检测结果，***代表P<0.01。
图6为FoMV-TaPDS和FoMV-TaCLA1的PCR和酶切鉴定结果。图6A为PCR鉴定结果；其中，M：Marker；泳道1-2：FoMV-TaPDS PCR的鉴定结果，引物分别为F2/F10和F3/F10；泳道3-4：FoMV-TaCLA1的PCR鉴定结果，引物分别为F2/F17和F3/F17。图6B为双酶切鉴定结果；其中，M：Marker；泳道5-6：FoMV-TaPDS及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果；泳道7-8：FoMV-TaCLA1及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果。
图7为FoMV介导的VIGS载体在小麦上的应用。图7A为对照植株(pFoMV-sg)、沉默TaPDS的小麦植株(FoMV-TaPDS)、沉默TaCLA1的小麦植株(FoMV-TaCLA1)在侵染第35天时小麦第四片叶子上的沉默表型；Bar＝1cm；图7B为对照植株(pFoMV-sg)、沉默TaPDS的小麦植株(FoMV-TaPDS)、沉默TaCLA1的小麦植株(FoMV-TaCLA1)的TaPDS和TaCLA1mRNA的实时定量PCR检测结果，**代表P<0.05，***代表P<0.01。
图8为FoMV-ZmPDS的PCR和酶切鉴定结果。图8A为PCR鉴定结果；其中，M：Marker；泳道1-2：FoMV-ZmPDS的PCR鉴定结果；引物分别为F2/F21和F3/F21；图8B为双酶切鉴定结果；其中，M：Marker；泳道3-4：FoMV-ZmPDS质粒及其SpeI/Xbal双酶切鉴定结果。
图9为FoMV介导的VIGS载体在玉米上的应用。图为对照植株(pFoMV-sg)和沉默ZmPDS的玉米(FoMV-ZmPDS)在侵染第21天时玉米第4片叶子上的沉默表型，Bar＝1cm。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pYL44载体在文献“Liu Y,Schiff M,Marathe R,etal.2002.Tobacco Rar1,EDS1and NPR1/NIM1like genes are required for N-mediatedresistance to tobacco mosaic virus.Plant Journal[J],30:415-429.”中公开过，公众可从清华大学获得。
下述实施例中的农杆菌GV3101和本生烟草植株均在文献“Xu G,Sui N,Tang Y,etal.2010.One-step,zero-background ligation-independent cloning intron-containing hairpin RNA constructs for RNAi in plants.New Phytologist[J],187:240-250.”中公开过，公众可从清华大学获得。
实施例1、FoMV介导的VIGS载体的构建
1、pFoMV-wt载体的构建
(1)以FoMV cDNA全长基因组(图1A)(来源于FoMV-P9的cDNA克隆)为模板，采用引物F1/R1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为FoMV cDNA全长基因组的核苷酸序列。引物序列如下：
F1：5’-GAAAACTCTTCCGAAACCGAAACTG-3’；
R1：5’-TCTAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATAAGCGATGTGTGCATTCACC-3’。
(2)用限制性内切酶Xba I对步骤(1)获得的PCR扩增产物进行酶切，回收得到大小为6237bp的DNA片段；用限制性内切酶StuI和XbaI对pYL44载体进行双酶切，回收得到大小为12786bp的骨架载体；将上述大小为6237bp的DNA片段和大小为12786bp的骨架载体连接，得到大小为19023bp的pFoMV-wt载体(图1B)。并对其进行测序验证。
测序结果表明：pFoMV-wt载体为将序列1所示的FoMV全长基因组的DNA分子***pYL44载体的StuI和XbaI酶切位点间，且保持pYL44载体的其他序列不变得到的载体。
2、建立基于pFoMV-wt载体的农杆菌介导的侵染性克隆
(1)将步骤1获得的pFoMV-wt载体转化到农杆菌GV3101中；三天后挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mL Kan，30μg/mL Rif，25μg/mL Gen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，得到pFoMV-wt/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mM MgCl2，10mMMES和200μM乙酰丁香酮)重悬。室温下放置4小时。
(2)选取6-8叶龄大的、生长良好的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用pFoMV-wt/GV3101重组菌对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养，得到pFoMV-wt侵染的本生烟草植株。
(3)10天后，取上部新生叶片提取RNA，检测pFoMV-wt在本生烟草上的侵染性。
具体检测方法如下：
A、Trizol法分别提取本生烟草植株(对照植株)和pFoMV-wt侵染的本生烟草植株叶片总RNA；
B、分别取2μg提取的RNA进行反转录，得到cDNA；
C、以获得的cDNA为模板，采用F2和R2引物进行RT-PCR，得到扩增产物，即为FoMV的mRNA。引物序列如下：
F2：5’-CCTCACACAGCCATATCTAGCTACCAG-3’；
R2：5’-GACTATAGCTGCTTGAACAAAGGC-3’。
RT-PCR扩增程序为：94℃预变性10分钟；循环条件为94℃30秒，55℃30秒；共35循环。
D、RT-PCR检测结果表明，扩增得到大小为490bp的条带，说明FoMV-wt在本生烟草上有侵染性。
(4)取注射10天后的烟草接种叶片，研磨，将含有pFoMV-wt的烟草汁液，用摩擦接种法接种2叶期的大麦(Hordeum vulgare)。
(5)接种12-14天后，在新生的大麦叶片上出现轻微的褪绿条斑症状。
(6)取该叶片提取RNA并进行RT-PCR检测。结果证明pFoMV-wt在大麦上有侵染性(图1D)。具体检测方法同上述描述。
上述试验结果表明：本发明成功建立了基于pFoMV-wt的农杆菌介导的侵染性克隆。本生烟草可作为扩繁病毒的中间寄主。
3、pFoMV-sg载体的构建
(1)以pFoMV-wt为模板，分别用引物F3/R3和F4/R4进行PCR扩增，分别获得包含FoMV nt 4258-5371的DNA片段1和包含FoMV nt 5202-6008的DNA片段2。引物序列如下：
F3：5’-GTCTTCACAGGCGGGGAGC-3’；
R3：5’-GGCGCGCCTCGAGACGCGTTAACTGTGTCCTGAAATGATGAGGTCAC-3’。
F4：5’-GTTAACGCGTCTCGAGGGCGCGCCACTCGACCCGTTCAACCATCGTGC-3’；
R4：5’-CCTGCCCATAGTCAGGAGGC-3’。
(2)用限制性内切酶SalI和AscI对DNA片段1进行双酶切，回收得到大小为880bp的DNA片段；用限制性内切酶AscI和AvrII对DNA片段2进行双酶切，回收得到大小为746bp的DNA片段；用限制性内切酶SalI和AvrII对pFoMV-wt载体进行双酶切，回收得到大小为17601bp的骨架载体；将上述大小为880bp和746bp的DNA片段和大小为17601bp的骨架载体连接，得到pFoMV-sg载体，pFoMV-sg载体包含了重复170bp的FoMV CP亚基因组启动子和多克隆位点(HpaI、MluI、XhoI和AscI)(图1C)。
对pFoMV-sg载体进行测序验证。测序结果表明：pFoMV-sg载体为将序列2所示的大小为1620bp的含有重复的FoMV CP亚基因组启动子(170bp)和多克隆位点(HpaI、MluI、XhoI和AscI)的DNA片段替换pFoMV-wt载体的SalI和AvrII酶切位点间的DNA片段，且保持pFoMV-wt载体的其他序列不变得到的载体。其中，序列2的第690-859位和第882-1051位所示的核苷酸分子为FoMV CP亚基因组启动子或其部分片段，也即为序列1第5202-5371位所示的核苷酸分子；序列2的第860-865位、第864-869位、第870-875位、第875-882位分别为HpaI、MluI、XhoI和AscI的酶切识别位点。
pFoMV-sg载体也即为将序列10所示的DNA分子***pYL44载体的StuI和XbaI酶切位点间，且保持pYL44载体的其他序列不变得到的载体。
4、建立基于FoMV-sg的农杆菌介导的侵染性克隆
(1)将获得的pFoMV-sg载体转化到农杆菌GV3101中；三天后挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mL Kan、30μg/mL Rif和25μg/mL Gen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，得到pFoMV-sg/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mM MgCl2、10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬。室温下放置4小时。
(2)选取6-8叶龄大的、生长良好的本生烟草，用pFoMV-sg/GV3101重组菌对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养。
(3)10天后，取上部新生叶片提取RNA，检测pFoMV-sg在本生烟草上的侵染性。
具体检测方法如下：
A、Trizol法分别提取对照植株(健康植株)和pFoMV-sg侵染的本生烟草植株叶片总RNA；
B、分别取2μg的RNA进行反转录，得到cDNA；
C、以获得的cDNA为模板，采用F2和R2引物进行RT-PCR，得到扩增产物，即为FoMV的mRNA。引物序列如下：
F2：5’-CCTCACACAGCCATATCTAGCTACCAG-3’；
R2：5’-GACTATAGCTGCTTGAACAAAGGC-3’。
RT-PCR扩增程序为：94℃预变性10分钟；循环条件为94℃30秒，55℃30秒；共35循环。
D、RT-PCR检测结果表明，扩增得到大小为682bp的条带，说明FoMV-sg在本生烟草上有侵染性。
(4)取注射10天后的烟草接种叶片，研磨，将含有pFoMV-sg的烟草汁液，用摩擦接种法接种2叶期的大麦(Hordeum vulgare)。
(5)接种12-14天后，在新生的大麦叶片上出现轻微的褪绿条斑症状。
(6)取该叶片提取RNA并进行RT-PCR检测。结果证明pFoMV-sg在大麦上有侵染性(图1D)。具体检测方法同上述描述。
上述结果表明：成功构建了基于FoMV-sg农杆菌介导的侵染性克隆。本生烟草可作为扩繁FoMV介导的病毒的中间寄主。pFoMV-sg即为FoMV介导的VIGS载体。
实施例2、FoMV介导的VIGS载体在单子叶植物基因沉默中的应用
一、FoMV介导的VIGS载体在大麦基因沉默中的应用
1、FoMV介导的VIGS载体的构建
(1)以大麦基因组cDNA为模板，采用引物F5和R5进行PCR扩增，得到大小为60bp的大麦PDS基因(HvPDS,nt 1089–1148,GenBank accession:AY062039)，将其命名为DNA片段3；采用引物F6和R6进行PCR扩增，扩增得到大小为55bp的大麦ChlH基因(HvChlH，nt 24-78，GenBank accession:U26545)，将其命名为DNA片段4。引物序列如下：
F5：5’-ACTAGTCGAAGATTCTTAAATACCATGTTGTGAAGACACCAAGGTCTGTTTA-3’；
R5：5’-GGCGCGCCTTCGGGACGGTCTTGTAAACAGACCTTGGTGTCTTCACAACATGG-3’。
F6：5’-ACTAGTCCTGCTGCTCAACGTCATCGACCCCAAGATCGGCGGCGTCATG-3’；
R6：5’-GGCGCGCCGTCGCCCATGATCATGACGCCGCCGATCTTGGGGTCGATGACG-3’。
(2)用限制性内切酶SpeI分别对获得的DNA片段3和DNA片段4进行酶切，分别将回收得到的DNA片段进行自连，分别回收得到DNA片段5(其核苷酸序列由DNA片段3的核苷酸序列和其反向互补序列组成)和DNA片段6(其核苷酸序列由DNA片段4的核苷酸序列和其反向互补序列组成)。
(3)用限制性内切酶AscI分别对DNA片段5和DNA片段6进行酶切，分别回收得到大小为126bp和116bp的DNA片段；用限制性内切酶AscI对pFoMV-sg载体进行单酶切，回收得到大小为19215bp的骨架载体；
(4)将序列3所示的DNA片段5***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，得到FoMV-HvPDS载体；将序列4所示的DNA片段6***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，得到FoMV-HvChlH载体。并分别对FoMV-HvPDS载体和FoMV-HvChlH载体进行PCR及酶切鉴定。具体步骤如下：
用引物F2/F5和F3/F5对FoMV-HvPDS载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图2A中的泳道3和泳道4)；用SpeI/Xbal对FoMV-HvPDS载体进行双酶切鉴定，酶切得到大小为1109bp的片段(图2B中的泳道7和泳道8)。
用引物F2/F6和F3/F6分别对FoMV-HvChlH进行PCR验证，分别扩增出大小为378bp和430bp的片段(图2A中的泳道1和泳道2)。用SpeI/Xbal对FoMV-HvPDS载体进行双酶切鉴定，酶切得到大小为1100bp的片段(图2B中的泳道5和泳道6)。
2、通过VIGS技术下调大麦的HvPDS和HvChlH基因的表达
(1)分别将pFoMV-sg(对照)、FoMV-HvPDS和FoMV-HvChlH载体转化到农杆菌GV3101中；三天后挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mL Kan、30μg/mL Rif和25μg/mLGen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，分别得到pFoMV-sg/GV3101，FoMV-HvPDS/GV3101和FoMV-HvChlH/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mM MgCl2，10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬。室温下放置4小时。
(2)选取6-8叶龄大的、生长良好的本生烟草，分别用pFoMV-sg/GV3101，FoMV-HvPDS/GV3101和FoMV-HvChlH/GV3101重组菌对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养。
(3)取注射10天后的烟草接种叶片，研磨，将含有pFoMV-sg，FoMV-HvPDS和FoMV-HvChlH的烟草汁液，用摩擦接种法接种2叶期的大麦。
(4)接种21天后，分别得到对照植株(pFoMV-sg)、沉默HvPDS的大麦植株(FoMV-HvPDS)和沉默HvChlH的大麦植株(FoMV-HvChlH)。可观察在FoMV-HvPDS侵染的大麦的第三片叶子上有很强的光漂白表型，在FoMV-HvChlH侵染的大麦的第三片叶子(从基部叶片算起)上有很强的褪绿表型(图3A)。
(5)分别收取上述表型叶片，通过Real-time RT-PCR检测沉默HvPDS的大麦植株(FoMV-HvPDS)体内的PDS、沉默HvChlH的大麦植株(FoMV-HvChlH)体内的ChlH和对照植株(pFoMV-sg)体内PDS和ChlH基因的mRNA水平。具体Real-time RT-PCR检测方法如下：
A、Trizol法分别提取对照植株(pFoMV-sg)，沉默HvPDS的大麦植株(FoMV-HvPDS)和沉默HvChlH的大麦植株(FoMV-HvChlH)的叶片；
B、分别取2μg提取的RNA进行反转录，得到cDNA；
C、以获得的cDNA为模板，采用F7/R7和F8/R8引物进行RT-PCR，得到扩增产物，即为目标基因HvPDS和HvChlH的mRNA，同时以18S rRNA为内参基因，内参基因的引物为F9/R9。引物序列如下：
F7：5’-GCTGCTTGGAAGGATGAAGATGG-3’；
R7：5’-GGCATGGCAAATATCATGGAGTGT-3’。
F8：5’-GAGGAGACATTGTCACTAAC-3’；
R8：5’-CTAGCCAAAGACTTCATAGAA-3’。
F9：5’-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3’；
R9：5’-GACACTAACGCGCCCGGTAT-3’。
具体方法如下：仪器Bio-Rad CFX96TM Real-Time PCR Detection System；试剂Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI，4367218)。
反应体系如下：
Figure BDA0001285203900000101
配好体系后，将样品置于伯乐Real-Time PCR仪(Bio-Rad CFX96TM Real-Time PCRDetection System)上扩增。扩增程序为：95℃预变性10min；循环条件为95℃15sec，60℃30sec，共40循环，检测样本的HvPDS和HvChlH的mRNA水平。
Real-time RT-PCR检测结果如图3B所示：与对照植株(pFoMV-sg)相比，沉默HvPDS的大麦植株(FoMV-HvPDS)体内的PDS表达量下调90％；沉默HvChlH的大麦植株(FoMV-HvChlH)体内的ChlH表达量下调75％。
上述试验结果表明，FoMV介导的VIGS载体成功沉默了大麦的PDS和ChlH基因，可用于大麦基因沉默。
二、FoMV介导的VIGS载体在谷子基因沉默中的应用
1、FoMV介导的VIGS载体在谷子上的基因沉默
(1)以谷子基因组cDNA为模板，采用引物F10和R10进行PCR扩增，扩增得到大小为60bp的谷子PDS基因(siPDS,nt 558-617,GenBank accession:XM004985406)，将其命名为DNA片段7；
以谷子基因组cDNA为模板，采用引物F11和R11进行PCR扩增，扩增得到大小为60bp的谷子CLA1基因(SiCLA1,nt1511-1570,GenBank accession:XM004962054)，将其命名为DNA片段8。
以谷子基因组cDNA为模板，采用引物F12和R12进行PCR扩增，扩增得到大小为60bp的谷子IspH(SiIspH,nt 364-423,GenBank accession:XM004981826)，将其命名为DNA片段9。引物序列如下：
F10：5’-ACTAGTGAACGCCCCAGTAAACCATTACAGGTCGTGATTGCTGGTGC-3’；
R10：5’-GGCGCGCCTGATAGACCAGCCAGTCCTGCACCAGCAATCACGACCTGTAA-3’。
F11：5’-ACTAGTATCCACGCGGCCATGGGCGGCGGCACGGGGCTCAACTACTTCC-3’；
R11：5’-GGCGCGCCGGTTGGGGAAGCGGCGGAGGAAGTAGTTGAGCCCCGTGCCGCC-3’。
F12：5’-ACTAGTCTCGAGCTCATGAGCCAGGAGTACACCAGCGATGTGATCAAG-3’；
R12：5’-GGCGCGCCGCCGTTCTCCTTGAGCGTCTTGATCACATCGCTGGTGTACTCC-3’。
(2)用限制性内切酶SpeI分别对DNA片段7、DNA片段8和DNA片段9进行酶切，分别将回收得到的DNA片段进行自连，分别回收得到DNA片段10、DNA片段11和DNA片段12。
(3)用限制性内切酶AscI分别对DNA片段10，DNA片段11和DNA片段12进行酶切，分别回收得到大小为126bp的DNA片段；用限制性内切酶AscI对pFoMV-sg载体进行单酶切，回收得到大小19215bp的骨架载体；
(4)将序列5所示的DNA片段10***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，得到FoMV-SiPDS载体；将序列6所述的DNA片段11***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，得到FoMV-SiCLA1载体；将序列7所述的DNA片段12***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，得到FoMV-SiIspH载体。并分别对FoMV-SiPDS、FoMV-SiCLA1和FoMV-SiIspH载体进行PCR及酶切鉴定。
用引物F2/F10和F3/F10对FoMV-SiPDS载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图4A中的泳道1和泳道2)；用SpeI和XbaI对FoMV-SiPDS载体进行双酶切，得到大小为1109bp的片段(图4B中的泳道7和泳道8)。
用引物F2/F11和F3/F11对FoMV-SiCLA1载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图4A中的泳道3和泳道4)；用SpeI和XbaI对FoMV-SiCLA1载体进行双酶切，得到大小为1109bp的片段(图4B中的泳道9和泳道10)。
用引物F2/F12和F3/F12对FoMV-SiISPH载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图4A中的泳道5和泳道6)；用SpeI和XbaI对FoMV-SiISPH载体进行双酶切，得到大小为1109bp的片段(图4B中的泳道11和泳道12)。
2、通过VIGS技术下调谷子的SiPDS、SiCLA1和SiIspH基因的表达
(1)分别将pFoMV-sg(对照)、FoMV-SiPDS、FoMV-SiCLA1和FoMV-SiIspH载体转化到农杆菌GV3101中；三天后挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mL Kan、30μg/mLRif和25μg/mL Gen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，分别得到pFoMV-sg/GV3101、FoMV-SiPDS/GV3101、FoMV-SiCLA1/GV3101和FoMV-SiIspH/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mM MgCl2、10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬。室温下放置4小时。
(2)选取6-8叶龄大的、生长良好的本生烟草，分别用pFoMV-sg/GV3101、FoMV-SiPDS/GV3101、FoMV-SiCLA1/GV3101和FoMV-SiIspH/GV3101重组菌对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养。
(3)取注射10天后的烟草接种叶片，研磨，将含有pFoMV-sg(对照)、FoMV-SiPDS、FoMV-SiCLA1和FoMV-SiIspH的烟草汁液，用摩擦接种法接种2叶期的谷子。
(4)接种24天后，分别得到对照植株(pFoMV-sg)、沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)、沉默SiCLA1的谷子和沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)。可观察在FoMV-SiPDS、FoMV-SiCLA1和FoMV-SiIspH侵染的谷子第七片叶子(从基部叶片算起)上有很强的光漂白表型和白化的表型(图5A)。
(5)分别收取上述表型叶片，通过Real-time RT-PCR检测沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)体内的PDS、沉默SiCLA1的谷子(FoMV-SiCLA1)体内的CLA1、沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)的体内IspH和对照植株(pFoMV-sg)体内PDS、CLA1和IspH的mRNA水平。具体Real-time RT-PCR检测方法如下：
A、Trizol法分别提取对照植株(pFoMV-sg)、沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)、沉默SiCLA1的谷子(FoMV-SiCLA1)和沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)的叶片；
B、分别取2μg提取的RNA进行反转录，得到cDNA；
C、以获得的cDNA为模板，分别采用F13/R13、F14/R14和F15/R15引物进行RT-PCR，得到扩增产物，即为目标基因SiPDS、SiCLA1和SiIspH的mRNA，同时以18S rRNA为内参基因，内参基因的引物为F16/R16。引物序列如下：
F13：5’-AGGAGTGGGTTGGTCGGAGTGA-3’；
R13：5’-TTGGAGAGGTCGGCAAGGTTCAC-3’；
F14：5’-CACAGTTCATGGCCCTCGAC-3’；
R14：5’-CCAGGACGTTGAACACCGTC-3’；
F15：5’-AGAAAGAGAACTGGTTACCCGC-3’；
R15：5’-TTTCCTGACGCTTGATCTCGAA-3’；
F16：5’-TGATTAATAGGGACAGTCGGGG-3’；
R16：5’-AGACTAGGACGGTATCTGATCG-3’。
具体方法如下：仪器Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR Detection System；试剂Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI，4367218)。
反应体系如下：
Figure BDA0001285203900000121
配好体系后，将样品置于伯乐Real-Time PCR仪(Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCRDetection System)上扩增。扩增程序为：95℃预变性10min；循环条件为95℃15sec，60℃30sec，共40循环，检测样本的SiPDS、SiCLA1和SiIspH的mRNA水平。
Real-time RT-PCR检测结果所示：与对照植株(pFoMV-sg)相比，沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)的植物体内的PDS表达量下调66-74％(图5B)；沉默SiCLA1的谷子(FoMV-SiCLA1)体内的CLA1表达量下调55-76％(图5D)；沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)体内的IspH表达量下调56-73％(图5F)。
(6)对对照植株(pFoMV-sg)、沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)、沉默SiCLA1的谷子(FoMV-SiCLA1)和沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)进行表型观察。结果发现：与对照植株(pFoMV-sg)相比，沉默沉默SiPDS的谷子(FoMV-SiPDS)、沉默SiCLA1的谷子(FoMV-SiCLA1)和沉默SiIspH的谷子(FoMV-SiIspH)的叶片，在侵染24天后有明显的光漂白和白化现象，继续观察发现到第39(10叶)(图5C)和第55天(13叶)(图5E)，表型依然可***扩散，而对照植株没有发生任何沉默表型。
上述试验结果表明，FoMV介导的VIGS载体成功沈默了谷子的PDS、CLA1和IspH，可用于谷子基因沉默。
三、FoMV介导的VIGS载体在小麦基因沉默中的应用
1、FoMV介导的VIGS载体在小麦上的基因沉默
(1)以小麦基因组cDNA为模板，采用引物F10/R10进行PCR扩增，扩增得到大小为60bp的小麦PDS基因(TaPDS,nt 423-482,GenBank accession:FJ517553)，将其命名为DNA片段13；
以小麦基因组cDNA为模板，采用引物F17/R11进行PCR扩增，扩增得到大小为60bp的小麦CLA1基因(TaCLA,nt 1428-1487,GenBank accession:AK335035)，将其命名为DNA片段14。引物序列如下：
F10：5’-ACTAGTGAACGCCCCAGTAAACCATTACAGGTCGTGATTGCTGGTGC-3’；
R10：5’-GGCGCGCCTGATAGACCAGCCAGTCCTGCACCAGCAATCACGACCTGTAA-3’。
F17：5’-ACTAGTATCCACGCGGCCATGGGGGGCGGCACGGGGCTCAACTACTTCC-3’；
R11：5’-GGCGCGCCGGTTGGGGAAGCGGCGGAGGAAGTAGTTGAGCCCCGTGCCGCC-3’。
(2)用限制性内切酶SpeI分别对DNA片段13和DNA片段14进行酶切，分别将回收得到的DNA片段进行自连，分别回收得到DNA片段15和DNA片段16。
(3)用限制性内切酶AscI分别将DNA片段15和DNA片段16进行酶切，分别回收得到大小为126bp的DNA片段；用限制性内切酶AscI对pFoMV-sg载体进行单酶切，回收得到大小19215bp的骨架载体；
(4)将序列8所示的DNA片段15***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，连接，得到FoMV-TaPDS载体；将序列9所示的DNA片段16***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，连接，得到FoMV-TaCLA1载体；
用引物F2/F10和F3/F10对FoMV-TaPDS载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图6A中的泳道1和泳道2)。用SpeI和XbaI对FoMV-TaPDS载体进行双酶切，得到大小为1109bp的片段(图6B的泳道5和泳道6)。
用引物F2/F17和F3/F17对FoMV-TaCLA1载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图6A中的泳道3和泳道4)。用SpeI和XbaI对FoMV-TaPDS载体进行双酶切，得到大小为1109bp的片段(图6B的泳道7和泳道8)。
2、通过VIGS技术下调小麦的TaPDS和TaCLA1基因的表达
(1)将pFoMV-sg(对照)、FoMV-TaPDS和FoMV-TaCLA1载体转化到农杆菌GV3101中；三天后挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mL Kan、30μg/mL Rif和25μg/mLGen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，分别得到pFoMV-sg/GV3101，FoMV-TaPDS/GV3101和FoMV-TaCLA1/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mM MgCl2、10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬。室温下放置4小时。
(2)选取6叶龄大的、生长良好的本生烟草，分别用pFoMV-sg/GV3101、FoMV-TaPDS/GV3101和FoMV-TaCLA1/GV3101重组菌对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养。
(3)取注射10天后的烟草接种叶片，研磨，将含有pFoMV-sg、FoMV-TaPDS和FoMV-TaCLA1的烟草汁液，用摩擦接种法接种2叶期的小麦。
(4)接种35天后，分别得到对照植株(pFoMV-sg)、沉默TaPDS的小麦植株(FoMV-TaPDS)和沉默TaCLA1的小麦植株(FoMV-TaCLA1)。可观察在FoMV-TaPDS和FoMV-TaCLA1侵染的小麦的第四片叶子(从基部叶片算起)上有很强的光漂白表型和白化的表型(图7A)。
(5)分别收取上述表型叶片，通过Real-time RT-PCR检测沉默TaPDS的小麦植株(FoMV-TaPDS)体内的PDS、沉默TaCLA1的小麦植株(FoMV-TaCLA1)体内的CLA1和对照植株(pFoMV-sg)体内PDS和ChlH的mRNA水平。具体Real-time RT-PCR检测方法如下：
A、Trizol法分别提取对照植株(pFoMV-sg)、沉默TaPDS的小麦植株(FoMV-TaPDS)和沉默TaCLA1的小麦植株(FoMV-TaCLA1)的叶片；
B、分别取2μg提取的RNA进行反转录，得到cDNA；
C、以获得的cDNA为模板，采用F18/R7和F19/R19引物进行RT-PCR，得到扩增产物，即为目标基因TaPDS和TaCLA1的mRNA，同时以18S rRNA为内参基因，内参基因的引物为F9/R20。引物序列如下：
F18：5’-GCTGCTTGGAAGGATGAAGATGG-3’；
R7：5’-GGCATGGCAAATATCATGGAGTGT-3’。
F19：5’-CCATCATGACGGTGCAGAATG-3’；
R19：5’-CCATGTACATCAACGTCAGTGC-3’。
F9：5’-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3’；
R20：5’-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3’。
具体方法如下：仪器Bio-Rad CFX96TM Real-Time PCR Detection System；试剂Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI，4367218)。
反应体系如下：
Figure BDA0001285203900000141
配好体系后，将样品置于伯乐Real-Time PCR仪(Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCRDetection System)上扩增。扩增程序为：95℃预变性10min；循环条件为95℃15sec，60℃30sec，共40循环，检测样本的TaPDS和TaCLA1的mRNA水平。
Real-time RT-PCR检测结果如图7B所示：与对照植株(pFoMV-sg)相比，沉默TaPDS的小麦植株(FoMV-TaPDS)体内的PDS和沉默TaCLA1的小麦植株(FoMV-TaCLA1)体内的CLA1表达量均下调75％左右。上述试验结果表明，FoMV介导的VIGS载体成功沈默了大麦的PDS和ChlH基因，可用于小麦基因沉默。
四、FoMV介导的VIGS载体在玉米基因沉默中的应用
1、FoMV介导的VIGS载体在玉米上的基因沉默
(1)以玉米基因组cDNA为模板，采用引物F21/R21进行PCR扩增，扩增得到大小为55bp的玉米PDS基因(ZmPDS,nt 2012-2026,GenBank accession:NM001111911)，将其命名为DNA片段17；
引物序列如下：
F21：5’-ACTAGTCGCACTCAGGAGCCAGAAAAGCCTACAATCAGGAGAAG-3’；
R21：5’-GGCGCGCCCTAAGATGGGACGGGAACTTCTCCTGATTGTAGGCTT-3’。
(2)用限制性内切酶SpeI对DNA片段17进行酶切，回收得到的DNA片段进行自连，回收得到DNA片段18。
(3)用限制性内切酶AscI对DNA片段18进行酶切，回收得到大小为126bp的DNA片段；用限制性内切酶AscI对pFoMV-sg载体进行单酶切，回收得到大小19215bp的骨架载体；
(4)将序列11所示的DNA片段17(请提供序列11)***大小为19215bp的骨架载体的AscI酶切位点间，连接，得到FoMV-ZmPDS载体。
用引物F2/F21和F3/F21对FoMV-ZmPDS载体进行PCR验证，分别扩增出大小为383bp和435bp的片段(图8A中的泳道1和泳道2)。用SpeI和XbaI对FoMV-ZmPDS载体进行双酶切，得到大小为1109bp的片段(图8B的泳道3和泳道4)。
2、通过VIGS技术下调玉米的ZmPDS基因的表达
(1)将pFoMV-sg(对照)和FoMV-ZmPDS载体转化到农杆菌GV3101中；三天后挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中(含50μg/mL Kan、30μg/mL Rif和25μg/mL Gen)，28℃，200rpm振荡培养过夜；次日收集菌体，分别得到pFoMV-sg/GV3101和FoMV-ZmPDS/GV3101重组菌，并用侵染悬浮液(10mM MgCl2、10mM MES和200μM乙酰丁香酮)重悬。室温下放置4小时。
(2)选取6叶龄大的、生长良好的本生烟草，分别用pFoMV-sg/GV3101和FoMV-ZmPDS/GV3101重组菌对其进行注射。将注射过的烟草置于光照/黑暗周期为16h/8h的温室中培养。
(3)取注射10天后的烟草接种叶片，研磨，将含有pFoMV-sg和FoMV-ZmPDS的烟草汁液，用摩擦接种法接种2叶期的玉米。
(4)接种21天后，分别得到对照植株(pFoMV-sg)和沉默ZmPDS的玉米植株(FoMV-ZmPDS)。可观察在FoMV-ZmPDS侵染的玉米的第四片叶子(从基部叶片算起)上有明显的光漂白表型(图9)。
序列表
<110> 清华大学
<120> 病毒介导的基因沉默的VIGS载体
<160> 11
<210> 1
<211> 6237bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gaaaactctt ccgaaaccga aactgactga aactacctcg accgacctta gaacccaaga 60
acccaacggg tgcggccact atgtctatcg aggcagtttt cgaccaggtt acagacccat 120
cgctccgcgc tgtgattcag gaggaagcgc acaaacagat caaagatttg tttaaggaaa 180
cgacgcgctg caatccctac tccataccgc aagctgggcg caaggttttg gaaaagtacg 240
ccatccccta caacccgtac tctctcaaac tacaccctca cgcagcctca aaagcgtttg 300
aagtgtcgct ctacgaggct gcgtctaact acctcccctc cacctcctca actcctgtca 360
cattcatgtt cacaaaaccg ggcaagctca gattctttag gcgccgaggt cacgtggaca 420
aattcgttaa tgctgacata gttccaagag acttggctag atacccacgc gacacagtct 480
acagttatct gcccgagatc accaccacac acgctttcat tggcgacacc ctacaccact 540
tcggtgagga ctttctcgtc gaggttttct ccaggtcacc gaaactagaa gtgcttctag 600
ccaccatggt attaccaccc gaggcctttt acagaatgga gtcccttcat ccctcggttt 660
acactctcct ctacagggac gaccgattcc tatacctgcc tggtggcctg cctggcggtg 720
agtacgaaca tcgctataag gacctaaact ggctaacatt tggcacagtt acgcacggcg 780
ggatcactat cacaggagaa cgcattgaga ctaaggccgc gaatcatctt ttcctcttca 840
gacgagggcg actagagaca ccaaaattcc gctcattcga catgcccgag cctatggtcc 900
tgcttcccaa ggttttccgc cccgcaaagt acaatgtaca gaagccaatt ccccgggaga 960
aagcaaacaa atggttgatg tacgttaaat ccatcggcaa tgccaccatt cgtgacgtat 1020
gggctaagct gaggcaaacc atagccaatg cagacattgg actcttctcg cccactgagc 1080
tcgtgcatct cacgaattac ttcctgctcc tgggccggct tgactcacac aactccttcg 1140
accaagtact ggccgacagt gtgctgaaag catggttcag accaatggtc gcaaagcttc 1200
aggagatcaa gcacaaactc atggggcaga cccaattcat gcaactctgc caagcgctag 1260
agatgacgga ggtggacctc gtttttgagg tccgggactc caagactccc cacaaacaag 1320
ctgtgccgtt ggaccgtgaa attgaaaacg ttttgttgga aggagtctca tcggagccaa 1380
cttacacgga aaccgaaggc gttgctgata gtccacttcc ccccccaatg caaactgcag 1440
ccgagccgtc cgcgacctca gacgagcccg agagctctag ctcgcgtgaa attgagcacc 1500
aaccggcgcc tgagatcacg cttgacgagg aagaacctca gcgagacgat ctgccttggg 1560
acgcttggag aacacaatta agggcgcttg gctttgaggc ctctgaaagg cagtatgacc 1620
cggacggtga actgatctct cctatcctga gcacccgaag gttacctaag actcccatag 1680
acacaacact ctacgccacg ctagacaaga ttgcacgctg cccaactttc tacaagcctg 1740
acacagatcg cgcgcagact tacgctcgcg atgtcatggc ggggaaaacc ggtgccattc 1800
tcaagcaaca accctttgag tggaaaacca cgctcaaacg caagactaaa gaggaaccga 1860
aggaaattca ccttgcggtg ttgcatggtg cgggcgggtc gggcaaatcc tacgcactgc 1920
aggaatttat gcggaacaac tctgacacac cgattacggt catcctgccg actaacgagc 1980
tcagggccga ctggaagaaa aaattgcccg cccacgacaa agacacattt atgacatacg 2040
aaaacgcgct cttgtgccct cgtggagaca tcttcattat ggacgattac acaaaattgc 2100
ccaggggcta cattgaggct ttcgtgcaga atgcacctgc cctctcactt ctgatactca 2160
ccggtgaccc caaccaagcc gaacactttg agaccactga ggacaatgaa attaacagcc 2220
tcgcccccgc ctcagtggtc ttcggcaagt tctctaggta ccacataaat gccacacacc 2280
gcaaccccag aaacttggca aacgccctcg gtgtttactc cgagacgccc ggggaggtta 2340
aagtgcttta cacgaggaac atcaagaccg gttatcacaa tctcgtgccc tcacaaatga 2400
agatgagaaa ctacgcctca ctcgggcagc gagcgtccac ctatgcgggt tgtcagggga 2460
tcactgcgcc ccgcgttcaa atcatcctag actccgacac accccggtgc accaggcaag 2520
tcatgtacac tgcgctttca agggccacga cggaagtggt gctctgcaac acgatgccgg 2580
atgagaaaag ctttttccag aaggttgaag caacaccgta cctcaaagcc atcctcaacc 2640
tcaacaaaga gattaaagtc actgagggtg acttgacaga agaaccgccg agggagcccg 2700
ctcctcccac cacacacctg cctgttgaaa acagaattat tcttaatgag gccctagtcg 2760
aaccgctgcc cgacaaacat gaccgcgaga tctactccaa ctccactggc ttttcaaact 2820
gcatacagac tcaagacccg tacatccaag ccttccaaca tcagcaagcc aaggacgaga 2880
cattgttctg ggcaaccgtc gagaagaggc tcgcagcatc cacgccgaag gacaactgga 2940
cagaattcaa gaccaagaga cctctgggtg acgtgctttg gctcgcgtac aagcgggcga 3000
tgatgctccc agatgagccc atcaaattta acccagagct ctggtgggca tgtgcagatg 3060
aggtgcaaaa gacctacctc tccaagccca tacacgcgct caagaacgga attcttcggc 3120
aatcacccga ctttgactgg aacaaactgc agattttcct caagtcacag tgggttaaga 3180
aaattgacaa aatcgggaaa attgacgtca acgctggaca gacgattgcc gccttttacc 3240
aaccaaccgt tatgctgttt ggaaccatgg cgagatacat gcgccgcatc cgcgacactt 3300
atcaacccgg cgaaatactc atcaattgcg agaagaacca gaagcacatt tcgaagtggg 3360
tcgagagcaa ttggaaccac cgcctacccg cttacaccaa tgacttcact gcttacgacc 3420
aaagccagga cggggctatg ttacagtttg aggtactgaa agccctgcac catgatatcc 3480
ctcatgaggt tgtggaagcc tacgtagccc ttaaactcaa ctcaaaaatg tttctgggca 3540
cactggcgat tatgagatta actggtgagg gacccacctt cgacgctaac acagagtgca 3600
acattgctta cacacacgcc cggttcgaga tcccaaagaa cgtggcgcaa atgtacgcgg 3660
gtgacgactg tgcgctcaac tgcaggcccg ttgaacggca gtccttcttg cctcttgtgg 3720
agaaattcac cctgaaatca aaacccaaag tatttgagca aaaagttggg tcatggcctg 3780
agttctgcgg caatctgatc accccacggg gctacctcaa ggatcccatg aagctacaac 3840
actgcctgca actggcacag aggaagaaac catccgaacc tgggtcgctc aaagacgttg 3900
ctgagaacta cgctatggac ttgctaccca catacgagct aggtgatgca ctctacgaaa 3960
tcttcgacga gagacaaatg aacgcgcact atcagtcggt caggacgctt atcacatgcg 4020
cccacaccaa agtcctccga gtggcacagg cacttcagga agactgcacc ttctttagct 4080
ccatctaaca ggttttgagt taggctaact ccactgacga attaaataac aatggatagt 4140
gaaatagttg aacgactaac aaagcttggt ttcgtcaaga cttcacacac gcacatcgct 4200
ggcgagcccc tcgtgattca cgccgttgct ggggccggta aaaccaccct ccttcggtcc 4260
ttacttgaat taccgggcgt ggaagtcttc acaggcgggg agcacgatcc tccaaatttg 4320
tcagggaaat atatccgctg cgctgcaccc cctgtggccg gtgcatacaa cattctcgac 4380
gagtaccccg cgtacccaaa ttggcgatcg caaccctgga acgtcctaat cgccgacaac 4440
ctacaataca aagaacccac agctcgcgcc cactacacat gcaatcgcac tcaccgcctg 4500
gggcagctca ctgtcgacgc tttgcgtagg gttggtttcg acatcacctt tgccggcacg 4560
cagactgaag actacggatt ccaggaaggc catctctaca ccagtcaatt ttacggacag 4620
gtcatttcac ttgacacgca ggcccataag atcgctgtgc gccacggact tgcacccctg 4680
tccgctttag aaacccgggg gctggaattt gatgagacca ctgtgataac gactaaaacc 4740
tcgctggagg aagtgaagga taggcacatg gtctatgtcg ctctcacacg gcacaggcgc 4800
acctgccatc tctacaccgc tcactttgcg ccctccgcct gacaacacga aagccatact 4860
aactatagct ataggaatag ccgcctccct cgtctttttc atgctcacac gcaacaatct 4920
gccacacgtc ggtgataaca tccactcact accccacgga ggaagttaca ttgacggtac 4980
caagtccatc aactaccgcc cacctgcgtc acgctacccc tcatctaact tactcgcttt 5040
cgctccacca atactcgccg cagtgctctt tttcctcaca cagccatatc tagctaccag 5100
acgatccagg tgcgttcggt gcttcgttgt ccacggcgca tgcacgaatc acacctagtt 5160
gttatattag cgctgttact tttagctctg tggtgtctta gcactcgacc cgttcaacca 5220
tcgtgccatg tcgaaatcaa cggccactcc atcatcgtca ccggaaactg ctggcactcc 5280
actcaacgac cgcattgagg gtgttagggt aaccaacatc agtgaagaga aacaacccac 5340
ctcgagtgtg acctcatcat ttcaggacac aatggcacca caagatgccg acgtcactga 5400
tgcgacggac tacaagaaac cgcctgctga aactgagcag aaggcactca ccattcaacc 5460
acggtcaaac aaggcgccca gtgacgagga gttggtacgc atcatcaacg cggcgcagaa 5520
gcgaggcctc acacccgcgg actatagctg cttgaacaaa ggcttcacca tggaatccat 5580
ggacaagggc gccaccgact ccacgatttt cacgggaaaa tacaacactt tcccaatgaa 5640
aagtctggcg ctagcttgca aagatgctgg cgtgcccgtg cacaaacttt gctacttcta 5700
taccaagccg gcttacgcga accgtagggt cgccaaccag ccgcctgctc gctggaccaa 5760
cgagaatgtg cccaaagcta acaagtgggc ggctttcgac accttcgacg cacttctcga 5820
cccatacgta gtcccatcct ctgtaccgta cgatgagccc acgccagagg atcgccaagt 5880
caatgagatt ttcaagaagg acaatttgag tcaggcagca tccagaaacc aactcctagg 5940
aacgcaagcc tccatcacgc gcgggagact caacggcgca ccagcactac caaacaacgg 6000
gcagtacttc atcgaggcac ctcagtgatc agtagtatga taccaataaa taaatcgggc 6060
gaatccgcgc ctcctgacta tgggcaggtt tacggaccaa gctgtatcga gatacgacct 6120
aacagtaacg cagctaaggg gtgaatgcac acatcgctta taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6180
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atctaga 6237
<210> 2
<211> 1620bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gtcgacgctt tgcgtagggt tggtttcgac atcacctttg ccggcacgca gactgaagac 60
tacggattcc aggaaggcca tctctacacc agtcaatttt acggacaggt catttcactt 120
gacacgcagg cccataagat cgctgtgcgc cacggacttg cacccctgtc cgctttagaa 180
acccgggggc tggaatttga tgagaccact gtgataacga ctaaaacctc gctggaggaa 240
gtgaaggata ggcacatggt ctatgtcgct ctcacacggc acaggcgcac ctgccatctc 300
tacaccgctc actttgcgcc ctccgcctga caacacgaaa gccatactaa ctatagctat 360
aggaatagcc gcctccctcg tctttttcat gctcacacgc aacaatctgc cacacgtcgg 420
tgataacatc cactcactac cccacggagg aagttacatt gacggtacca agtccatcaa 480
ctaccgccca cctgcgtcac gctacccctc atctaactta ctcgctttcg ctccaccaat 540
actcgccgca gtgctctttt tcctcacaca gccatatcta gctaccagac gatccaggtg 600
cgttcggtgc ttcgttgtcc acggcgcatg cacgaatcac acctagttgt tatattagcg 660
ctgttacttt tagctctgtg gtgtcttagc actcgacccg ttcaaccatc gtgccatgtc 720
gaaatcaacg gccactccat catcgtcacc ggaaactgct ggcactccac tcaacgaccg 780
cattgagggt gttagggtaa ccaacatcag tgaagagaaa caacccacct cgagtgtgac 840
ctcatcattt caggacacag ttaacgcgtc tcgaggcgcg ccactcgacc cgttcaacca 900
tcgtgccatg tcgaaatcaa cggccactcc atcatcgtca ccggaaactg ctggcactcc 960
actcaacgac cgcattgagg gtgttagggt aaccaacatc agtgaagaga aacaacccac 1020
ctcgagtgtg acctcatcat ttcaggacac aatggcacca caagatgccg acgtcactga 1080
tgcgacggac tacaagaaac cgcctgctga aactgagcag aaggcactca ccattcaacc 1140
acggtcaaac aaggcgccca gtgacgagga gttggtacgc atcatcaacg cggcgcagaa 1200
gcgaggcctc acacccgcgg cctttgttca agcagctata gtcttcacca tggaatccat 1260
ggacaagggc gccaccgact ccacgatttt cacgggaaaa tacaacactt tcccaatgaa 1320
aagtctggcg ctagcttgca aagatgctgg cgtgcccgtg cacaaacttt gctacttcta 1380
taccaagccg gcttacgcga accgtagggt cgccaaccag ccgcctgctc gctggaccaa 1440
cgagaatgtg cccaaagcta acaagtgggc ggctttcgac accttcgacg cacttctcga 1500
cccatacgta gtcccatcct ctgtaccgta cgatgagccc acgccagagg atcgccaagt 1560
caatgagatt ttcaagaagg acaatttgag tcaggcagca tccagaaacc aactcctagg 1620
<210> 3
<211> 126bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
cgaagattct taaataccat gttgtgaaga caccaaggtc tgtttacaag accgtcccga 60
actagttcgg gacggtcttg taaacagacc ttggtgtctt cacaacatgg tatttaagaa 120
tcttcg 126
<210> 4
<211> 116bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
cctgctgctc aacgtcatcg accccaagat cggcggcgtc atgatcatgg gcgacactag 60
tgtcgcccat gatcatgacg ccgccgatct tggggtcgat gacgttgagc agcagg 116
<210> 5
<211> 126bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gaacgcccca gtaaaccatt acaggtcgtg attgctggtg caggactggc tggtctatca 60
actagttgat agaccagcca gtcctgcacc agcaatcacg acctgtaatg gtttactggg 120
gcgttc 126
<210> 6
<211> 126bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
atccacgcgg ccatgggcgg cggcacgggg ctcaactact tcctccgccg cttccccaac 60
actagtgttg gggaagcggc ggaggaagta gttgagcccc gtgccgccgc ccatggccgc 120
gtggat 126
<210> 7
<211> 126bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ctcgagctca tgagccagga gtacaccagc gatgtgatca agacgctcaa ggagaacggc 60
actagtgccg ttctccttga gcgtcttgat cacatcgctg gtgtactcct ggctcatgag 120
ctcgag 126
<210> 8
<211> 126bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
gaacgcccca gtaaaccatt acaggtcgtg attgctggtg caggactggc tggtctatca 60
actagttgat agaccagcca gtcctgcacc agcaatcacg acctgtaatg gtttactggg 120
gcgttc 126
<210> 9
<211> 126bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
atccacgcgg ccatgggggg cggcacgggg ctcaactact tcctccgccg cttccccaac 60
actagtgttg gggaagcggc ggaggaagta gttgagcccc gtgccgcccc ccatggccgc 120
gtggat 126
<210> 10
<211> 6429bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
gaaaactctt ccgaaaccga aactgactga aactacctcg accgacctta gaacccaaga 60
acccaacggg tgcggccact atgtctatcg aggcagtttt cgaccaggtt acagacccat 120
cgctccgcgc tgtgattcag gaggaagcgc acaaacagat caaagatttg tttaaggaaa 180
cgacgcgctg caatccctac tccataccgc aagctgggcg caaggttttg gaaaagtacg 240
ccatccccta caacccgtac tctctcaaac tacaccctca cgcagcctca aaagcgtttg 300
aagtgtcgct ctacgaggct gcgtctaact acctcccctc cacctcctca actcctgtca 360
cattcatgtt cacaaaaccg ggcaagctca gattctttag gcgccgaggt cacgtggaca 420
aattcgttaa tgctgacata gttccaagag acttggctag atacccacgc gacacagtct 480
acagttatct gcccgagatc accaccacac acgctttcat tggcgacacc ctacaccact 540
tcggtgagga ctttctcgtc gaggttttct ccaggtcacc gaaactagaa gtgcttctag 600
ccaccatggt attaccaccc gaggcctttt acagaatgga gtcccttcat ccctcggttt 660
acactctcct ctacagggac gaccgattcc tatacctgcc tggtggcctg cctggcggtg 720
agtacgaaca tcgctataag gacctaaact ggctaacatt tggcacagtt acgcacggcg 780
ggatcactat cacaggagaa cgcattgaga ctaaggccgc gaatcatctt ttcctcttca 840
gacgagggcg actagagaca ccaaaattcc gctcattcga catgcccgag cctatggtcc 900
tgcttcccaa ggttttccgc cccgcaaagt acaatgtaca gaagccaatt ccccgggaga 960
aagcaaacaa atggttgatg tacgttaaat ccatcggcaa tgccaccatt cgtgacgtat 1020
gggctaagct gaggcaaacc atagccaatg cagacattgg actcttctcg cccactgagc 1080
tcgtgcatct cacgaattac ttcctgctcc tgggccggct tgactcacac aactccttcg 1140
accaagtact ggccgacagt gtgctgaaag catggttcag accaatggtc gcaaagcttc 1200
aggagatcaa gcacaaactc atggggcaga cccaattcat gcaactctgc caagcgctag 1260
agatgacgga ggtggacctc gtttttgagg tccgggactc caagactccc cacaaacaag 1320
ctgtgccgtt ggaccgtgaa attgaaaacg ttttgttgga aggagtctca tcggagccaa 1380
cttacacgga aaccgaaggc gttgctgata gtccacttcc ccccccaatg caaactgcag 1440
ccgagccgtc cgcgacctca gacgagcccg agagctctag ctcgcgtgaa attgagcacc 1500
aaccggcgcc tgagatcacg cttgacgagg aagaacctca gcgagacgat ctgccttggg 1560
acgcttggag aacacaatta agggcgcttg gctttgaggc ctctgaaagg cagtatgacc 1620
cggacggtga actgatctct cctatcctga gcacccgaag gttacctaag actcccatag 1680
acacaacact ctacgccacg ctagacaaga ttgcacgctg cccaactttc tacaagcctg 1740
acacagatcg cgcgcagact tacgctcgcg atgtcatggc ggggaaaacc ggtgccattc 1800
tcaagcaaca accctttgag tggaaaacca cgctcaaacg caagactaaa gaggaaccga 1860
aggaaattca ccttgcggtg ttgcatggtg cgggcgggtc gggcaaatcc tacgcactgc 1920
aggaatttat gcggaacaac tctgacacac cgattacggt catcctgccg actaacgagc 1980
tcagggccga ctggaagaaa aaattgcccg cccacgacaa agacacattt atgacatacg 2040
aaaacgcgct cttgtgccct cgtggagaca tcttcattat ggacgattac acaaaattgc 2100
ccaggggcta cattgaggct ttcgtgcaga atgcacctgc cctctcactt ctgatactca 2160
ccggtgaccc caaccaagcc gaacactttg agaccactga ggacaatgaa attaacagcc 2220
tcgcccccgc ctcagtggtc ttcggcaagt tctctaggta ccacataaat gccacacacc 2280
gcaaccccag aaacttggca aacgccctcg gtgtttactc cgagacgccc ggggaggtta 2340
aagtgcttta cacgaggaac atcaagaccg gttatcacaa tctcgtgccc tcacaaatga 2400
agatgagaaa ctacgcctca ctcgggcagc gagcgtccac ctatgcgggt tgtcagggga 2460
tcactgcgcc ccgcgttcaa atcatcctag actccgacac accccggtgc accaggcaag 2520
tcatgtacac tgcgctttca agggccacga cggaagtggt gctctgcaac acgatgccgg 2580
atgagaaaag ctttttccag aaggttgaag caacaccgta cctcaaagcc atcctcaacc 2640
tcaacaaaga gattaaagtc actgagggtg acttgacaga agaaccgccg agggagcccg 2700
ctcctcccac cacacacctg cctgttgaaa acagaattat tcttaatgag gccctagtcg 2760
aaccgctgcc cgacaaacat gaccgcgaga tctactccaa ctccactggc ttttcaaact 2820
gcatacagac tcaagacccg tacatccaag ccttccaaca tcagcaagcc aaggacgaga 2880
cattgttctg ggcaaccgtc gagaagaggc tcgcagcatc cacgccgaag gacaactgga 2940
cagaattcaa gaccaagaga cctctgggtg acgtgctttg gctcgcgtac aagcgggcga 3000
tgatgctccc agatgagccc atcaaattta acccagagct ctggtgggca tgtgcagatg 3060
aggtgcaaaa gacctacctc tccaagccca tacacgcgct caagaacgga attcttcggc 3120
aatcacccga ctttgactgg aacaaactgc agattttcct caagtcacag tgggttaaga 3180
aaattgacaa aatcgggaaa attgacgtca acgctggaca gacgattgcc gccttttacc 3240
aaccaaccgt tatgctgttt ggaaccatgg cgagatacat gcgccgcatc cgcgacactt 3300
atcaacccgg cgaaatactc atcaattgcg agaagaacca gaagcacatt tcgaagtggg 3360
tcgagagcaa ttggaaccac cgcctacccg cttacaccaa tgacttcact gcttacgacc 3420
aaagccagga cggggctatg ttacagtttg aggtactgaa agccctgcac catgatatcc 3480
ctcatgaggt tgtggaagcc tacgtagccc ttaaactcaa ctcaaaaatg tttctgggca 3540
cactggcgat tatgagatta actggtgagg gacccacctt cgacgctaac acagagtgca 3600
acattgctta cacacacgcc cggttcgaga tcccaaagaa cgtggcgcaa atgtacgcgg 3660
gtgacgactg tgcgctcaac tgcaggcccg ttgaacggca gtccttcttg cctcttgtgg 3720
agaaattcac cctgaaatca aaacccaaag tatttgagca aaaagttggg tcatggcctg 3780
agttctgcgg caatctgatc accccacggg gctacctcaa ggatcccatg aagctacaac 3840
actgcctgca actggcacag aggaagaaac catccgaacc tgggtcgctc aaagacgttg 3900
ctgagaacta cgctatggac ttgctaccca catacgagct aggtgatgca ctctacgaaa 3960
tcttcgacga gagacaaatg aacgcgcact atcagtcggt caggacgctt atcacatgcg 4020
cccacaccaa agtcctccga gtggcacagg cacttcagga agactgcacc ttctttagct 4080
ccatctaaca ggttttgagt taggctaact ccactgacga attaaataac aatggatagt 4140
gaaatagttg aacgactaac aaagcttggt ttcgtcaaga cttcacacac gcacatcgct 4200
ggcgagcccc tcgtgattca cgccgttgct ggggccggta aaaccaccct ccttcggtcc 4260
ttacttgaat taccgggcgt ggaagtcttc acaggcgggg agcacgatcc tccaaatttg 4320
tcagggaaat atatccgctg cgctgcaccc cctgtggccg gtgcatacaa cattctcgac 4380
gagtaccccg cgtacccaaa ttggcgatcg caaccctgga acgtcctaat cgccgacaac 4440
ctacaataca aagaacccac agctcgcgcc cactacacat gcaatcgcac tcaccgcctg 4500
gggcagctca ctgtcgacgc tttgcgtagg gttggtttcg acatcacctt tgccggcacg 4560
cagactgaag actacggatt ccaggaaggc catctctaca ccagtcaatt ttacggacag 4620
gtcatttcac ttgacacgca ggcccataag atcgctgtgc gccacggact tgcacccctg 4680
tccgctttag aaacccgggg gctggaattt gatgagacca ctgtgataac gactaaaacc 4740
tcgctggagg aagtgaagga taggcacatg gtctatgtcg ctctcacacg gcacaggcgc 4800
acctgccatc tctacaccgc tcactttgcg ccctccgcct gacaacacga aagccatact 4860
aactatagct ataggaatag ccgcctccct cgtctttttc atgctcacac gcaacaatct 4920
gccacacgtc ggtgataaca tccactcact accccacgga ggaagttaca ttgacggtac 4980
caagtccatc aactaccgcc cacctgcgtc acgctacccc tcatctaact tactcgcttt 5040
cgctccacca atactcgccg cagtgctctt tttcctcaca cagccatatc tagctaccag 5100
acgatccagg tgcgttcggt gcttcgttgt ccacggcgca tgcacgaatc acacctagtt 5160
gttatattag cgctgttact tttagctctg tggtgtctta gcactcgacc cgttcaacca 5220
tcgtgccatg tcgaaatcaa cggccactcc atcatcgtca ccggaaactg ctggcactcc 5280
actcaacgac cgcattgagg gtgttagggt aaccaacatc agtgaagaga aacaacccac 5340
ctcgagtgtg acctcatcat ttcaggacac agttaacgcg tctcgaggcg cgccactcga 5400
cccgttcaac catcgtgcca tgtcgaaatc aacggccact ccatcatcgt caccggaaac 5460
tgctggcact ccactcaacg accgcattga gggtgttagg gtaaccaaca tcagtgaaga 5520
gaaacaaccc acctcgagtg tgacctcatc atttcaggac acaatggcac cacaagatgc 5580
cgacgtcact gatgcgacgg actacaagaa accgcctgct gaaactgagc agaaggcact 5640
caccattcaa ccacggtcaa acaaggcgcc cagtgacgag gagttggtac gcatcatcaa 5700
cgcggcgcag aagcgaggcc tcacacccgc ggcctttgtt caagcagcta tagtcttcac 5760
catggaatcc atggacaagg gcgccaccga ctccacgatt ttcacgggaa aatacaacac 5820
tttcccaatg aaaagtctgg cgctagcttg caaagatgct ggcgtgcccg tgcacaaact 5880
ttgctacttc tataccaagc cggcttacgc gaaccgtagg gtcgccaacc agccgcctgc 5940
tcgctggacc aacgagaatg tgcccaaagc taacaagtgg gcggctttcg acaccttcga 6000
cgcacttctc gacccatacg tagtcccatc ctctgtaccg tacgatgagc ccacgccaga 6060
ggatcgccaa gtcaatgaga ttttcaagaa ggacaatttg agtcaggcag catccagaaa 6120
ccaactccta ggaacgcaag cctccatcac gcgcgggaga ctcaacggcg caccagcact 6180
accaaacaac gggcagtact tcatcgaggc acctcagtga tcagtagtat gataccaata 6240
aataaatcgg gcgaatccgc gcctcctgac tatgggcagg tttacggacc aagctgtatc 6300
gagatacgac ctaacagtaa cgcagctaag gggtgaatgc acacatcgct tataaaaaaa 6360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6420
aaatctaga 6429
<210> 11
<211> 116bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
cgcactcagg agccagaaaa gcctacaatc aggagaagtt cccgtcccat cttagactag 60
tctaagatgg gacgggaact tctcctgatt gtaggctttt ctggctcctg agtgcg 116

Claims (13)

1.一种病毒介导的基因沉默载体，包括可转移的核苷酸序列和允许所述可转移的核苷酸序列转入植物基因组中的边界序列；
所述可转移的核苷酸序列包括启动子、重组FoMV的cDNA序列和终止子；
所述重组FoMV的cDNA序列包含FoMV RNA依赖的RNA聚合酶的基因编码序列、FoMV三基因盒的基因编码序列、FoMV外壳蛋白CP的基因编码序列和两个FoMV外壳蛋白CP亚基因组启动子；
将所述两个FoMV外壳蛋白CP亚基因组启动子分别命名为第一个CP亚基因组启动子和第二个CP亚基因组启动子；所述第一个CP亚基因组启动子用于启动外源核苷酸序列的转录；所述第二个CP亚基因组启动子用于启动FoMV外壳蛋白CP基因编码序列的转录；
所述第一个CP亚基因组启动子位于所述FoMV三基因盒的基因编码序列的3’端；
所述第二个CP亚基因组启动子位于所述FoMV外壳蛋白CP的基因编码序列的5’端；
所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子包含相同的序列；
所述第一个亚基因组启动子为序列1第5202-5371位所示的核苷酸序列；
所述外源核苷酸序列位于所述第二个CP亚基因组启动子的5’端；
所述边界序列为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T-DNA的左边界和右边界序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或含有双增强子的CaMV 35S启动子；
或，所述终止子为Nos终止子；
所述载体还包括poly-A序列，其位于所述Nos终止子的5’端；
或，所述外源核苷酸序列通过多克隆位点***所述载体；
或，所述多克隆位点位于所述第一个CP亚基因组启动子和所述第二个CP亚基因组启动子之间。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：
所述载体为FoMV-sg，其为将序列10所示的DNA分子***pYL44载体的StuI和XbaI酶切位点间，且保持pYL44载体的其他序列不变得到的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：
所述外源核苷酸序列是对应于植物靶基因或靶基因家族的保守序列的一段序列；
或，所述外源核苷酸序列是与靶基因反向互补的序列；
或，所述外源核苷酸序列的大小为100-300bp；
或，所述外源核苷酸序列是靶基因的反向重复序列，所述反向重复序列转录后形成发卡结构；
或，所述反向重复序列由靶基因的正向序列和靶基因的反向互补序列组成；所述靶基因的正向序列和所述靶基因的反向互补序列的大小均为40-70bp；
或，所述靶基因为与植物生长、发育、植物抗病或植物非生物胁迫途径相关的基因。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述载体包含所述FoMV-sg和***到多克隆位点中的对应于植物靶基因或靶基因家族的保守序列的一段序列。
6.权利要求4或5所述的载体的构建方法，其包括将所述外源核苷酸序列即靶序列克隆到所述载体的多克隆位点中的步骤。
7.一种用VIGS技术沉默植物组织中靶基因的方法，其包括将权利要求4或5所述的载体转入植物组织中的步骤；
所述方法导致植物组织中对应的靶基因的mRNA 50％以上被沉默；
所述植物组织为处于2-3叶期的植物组织；
所述载体通过农杆菌介导T-DNA转入所述植物组织中；
所述植物为单子叶植物。
8.一种分析靶基因特性或研究靶基因功能的方法，包括如下步骤：
1)用权利要求7所述的方法在植物、植物的一部分或在植物生长发育某一阶段沉默靶基因；
2)观察所述靶基因被沉默后的植物表型。
9.来源于权利要求1-5中任一所述的载体的RNA转录物。
10.含有来源于权利要求1-5中任一所述的载体的RNA转录物的病毒或病毒颗粒。
11.含有权利要求1-5中任一所述的载体的试剂盒。
12.权利要求1-5中任一所述载体在沉默植物目的基因中的应用；所述植物为单子叶植物。
13.权利要求1-5中任一所述载体在分析单子叶植物靶基因特性或研究单子叶植物靶基因功能中的应用。
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