CN104381009A - 一种桑黄人工袋栽工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菌类的培育方法，特别涉及一种桑黄人工袋栽工艺，该工艺包括如下步骤：（1）从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种，桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；将桑黄原种接种到栽培种培养基上培养获得桑黄栽培种；（2）将桑黄栽培种接种到菌棒中进行出芝培养；（3）出芝管理。本发明的桑黄人工袋栽工艺经大量的培养实践证明，可实现真正桑黄的人工培养，并且单个子实体大小可以根据开口大小人为控制，桑黄人工袋栽，把野生稀缺资源、再生漫长的资源，人工短期再生。

Description

一种桑黄人工袋栽工艺

技术领域

本发明涉及一种菌类的培育方法，特别涉及一种桑黄人工袋栽工艺。

背景技术

桑黄，中药名，见《中药大辞典》。分类上属于真菌界(Fungi)、担子菌门(Basigiomycota)、刺革菌目(Hymenochaxtales)刺革菌目(Hymenochaxtaceae)，是硬质的多孔菌，为中、日、韩等地著名的药用真菌。现有的“桑黄”栽培方法出菇较难，人工培育生长情况不好，产率低。申请号200910077398.8、申请日2009-02-19的一种桑黄(Phellinus baumiiPilát)的人工栽培方法，包括：(1)从桑黄子实体上分离的菌株纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种；(2)桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；(3)将桑黄原种接种到栽培袋内的栽培种培养基中培养；(4)将长满菌丝的栽培袋转移至出菇室进行出菇培养；其中，所述的出菇培养是在空气相对湿度为85～90％，温度为22～25℃的环境条件下进行出菇培养。该方法提供了一种新的桑黄栽培方法，但是由于其过程较为复杂，不易在农户中推广使用，由于目前对桑黄大面积生产的迫切需要，需要对现有的栽培方法进行改良。

发明内容

本发明提供一种栽培相对简单，管理相对容易，出芝相对高产、可进行大面积大棚栽培的桑黄人工袋栽工艺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种桑黄人工袋栽工艺，该工艺包括如下步骤：

(1)从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种，桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；将桑黄原种接种到栽培种培养基上培养获得桑黄栽培种；

原种培养基和栽培种培养基主要是由桑枝木屑、麦皮、玉米粉和石膏粉混合而成；进一步优选的是，原种培养基和栽培种培养基的各原料组分的重量百分比为：麦皮10-12％，玉米粉10-12％，石膏粉1％，余量为桑枝木屑。麦皮也称麦麸。

(2)将桑黄栽培种接种到菌棒中进行出芝培养；

菌棒的制备：将桑枝木屑进行全面喷水预湿，湿度控制在60％-70％，充分预湿后加入麦皮、玉米粉和石膏粉进行拌料，混合均匀后装塑料袋，袋体直径为15-17cm，长度≤35cm，得到用于培养桑黄的菌棒；菌棒经灭菌后采用桑黄栽培种进行接种；接种后的菌棒放入培养室内避光培养，温度控制在20-30℃，湿度控制在40-50％，培养60-90天；

(3)出芝管理：

a、当桑黄菌棒开始转色变成黄色或者棕黄色时，移入大棚栽培，进行散射光培养，在移入前对大棚内放置菌棒处进行松土，松土深度10cm以上，松土后用石灰水进行消毒，然后将菌棒直立摆放，间距在10cm×10cm～15cm×15cm，大棚温度控制在15-32℃，湿度控制在80-90％；

b、培养10天以上，待菌棒完全转色成黄色或者棕黄色之后，将菌棒逐个进行封口切除工作(使菌棒顶部透气)，然后照原样直立放回土内；

c、继续培养4天后，待菌棒封口切口处的菌丝重新长满菌棒袋口，进行菌棒开口工作；首先，将菌棒封口朝下放置，每个菌棒外壁面开口3-4个，然后埋入土中，埋入深度3-4厘米；大棚每天通风2-3次，每次30-40分钟；培养60-90天后得到桑黄子实体。

作为优选，菌棒进行高压或常压灭菌，高压灭菌时压力为3-5个大气压，温度120℃，灭菌时间为6-8小时；常压灭菌时压力为1个大气压，温度100℃，灭菌时间为24-36小时；灭菌后冷却18小时以上至室温。

作为优选，步骤(2)中菌棒的接种过程如下：

a、在接种开始前，对接种箱进行清洗，然后把气雾消毒剂按照每立方米8克进行点燃消毒；

b、将灭菌冷却后的菌棒和桑黄栽培种放置在已消毒过的接种箱内，接种箱内用菌用气雾消毒剂8g进行消毒，气雾消失后进行接种；

c、打开栽培种和菌棒袋口，取栽培种直径3-4cm，厚度0.5-1cm放入菌棒袋口，用手捏紧菌棒袋口，将栽培种往菌棒袋中按结实，然后套上套环及套环盖封口。

作为优选，步骤(3)的c中，将菌棒的柱面分成四边，在相对的两边各开1个口，开口距地面6厘米，另外两边在距地面12厘米处开口，使4个开***错。

作为优选，所述的开口呈弧形口，弧形口的两端朝上。使子实体长成后成形美观。

作为优选，原种培养基和栽培种培养基的各原料组分的重量百分比为：麦皮10％，玉米粉10％，石膏粉1％，余量为桑枝木屑。进一步的，所述的玉米粉的粒度为0.1-0.5mm，桑枝木屑的粒度为0.5-1.0cm。

本发明的有益效果是：本发明的人工袋栽工艺经大量的培养实践证明，可实现真正桑黄的人工培养，并且单个子实体大小可以根据开口大小人为控制，桑黄人工袋栽，把野生稀缺资源、再生漫长的资源，人工短期再生。而且人工袋栽子实体成分含量跟野生桑黄成分含量相当。目前的培养规模约为35亩、25万袋，长成桑黄成扇形、马蹄形，子实层(子实体腹面)具有孔状结构、表面呈金黄色或棕黄色，老时变为黄棕色。菌肉黄色、棕色或具光泽的木色，在菌盖表面附近颜色较深。子实层为有光泽的木色至深棕色，常分为两层或多层。

附图说明

图1是多糖含量分析的葡萄糖标准曲线；

图2是12种不同来源桑黄的多糖的含量；

图3是水浸出物分析的氨基酸标准曲线图；

图4是各种来源桑黄的氨基酸含量图；

图5是本发明的菌棒处理过程的示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。

本发明所用的桑黄菌种(Inonotus Sanghuang)来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC NO：8854。

实施例1：

a、菌种的制作：

(1)、桑黄菌种按使用目的可以分为生产用菌种和保藏用菌种；按生产繁殖程序可分为母种(可称试管种、一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)3个级别。

(2)、母种是指通过孢子分离、组织分离并经过纯化、培养获得的桑黄菌丝纯培养。容器为试管，故又称为试管种或一级种。它既适于用试管斜面移植，再次扩大繁殖，供生产上使用，又适于纯种保藏。

本发明提供的桑黄菌Inonotus sanghuang Sheng H.Wu,T.Hatt.&Y.C.Dai来自浙江省淳安千岛湖桑都食用菌专业合作社，是从千岛湖桑树上寄生的野生桑黄子实体中经组织分离、传代复壮获得。该菌属担子菌门(Basidiomycota)、刺革菌目(Hymenochaetales)、刺革菌科(Hymenochaetaceae)。其生物学特征为：桑黄菌丝生长最适温度为28℃，最适pH值为6.5，母种生长最适培养基为PDA培养基，菌丝最适生长袋料培养基是桑树木屑培养基。以该菌体接种于桑树木屑培养基中栽培所得子实体形态为菌盖扇形、贝壳形、马蹄形，上表面无瘤状凸起和裂纹，菌盖呈金黄色或棕黄色。其它生理生化特征为：水分不得过10.0％；总灰分不得过6％；水溶性浸出物含量不得少于15％；多糖以无水葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计，不得少于2.60％。该菌株于2014年3月07日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No.8854。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。本发明保藏提供的生物材料为桑都1号，分类命名为：桑黄Inonotus sanghuang。

母种培养基配方(PDA培养基)：马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂20克，水1000毫升。

(3)、原种是由母种扩大培养而成的菌种，本发明的桑黄原种为固体原种。容器多为无色的750毫升小口径的菌种瓶或者聚乙烯塑料袋。此菌种必须要严格检查，无杂菌污染的纯菌种方可用于生产。

菌种培养基各原料组分的重量百分比为：麦皮10％，玉米粉10％(粒度0.1-0.5mm)，石膏粉1％，余量为桑枝木屑(粒度0.5-1.0cm)。

(4)、栽培种是由原种扩大繁殖而成的菌种。培养基和容器与原种相同。

b、菌棒的制备：

菌棒的组成同原种培养基，将桑枝木屑进行全面喷水预湿，湿度控制在60％-70％；次日加入麦皮10％，玉米粉10％(粒度0.1-0.5mm)，石膏粉1％，进行拌料。培养基混合均匀后装聚乙烯袋(袋体直径为15-17cm，长度≤35cm)，得到用于培养桑黄的菌棒。

c、菌棒灭菌：

菌棒进行高压或常压灭菌，高压灭菌时压力为3-5个大气压，温度120℃，灭菌时间为6-8小时；常压灭菌时压力为1个大气压，温度100℃，灭菌时间为24-36小时；灭菌后冷却18小时以上至室温。

d、接种：

(1)、在接种开始前，要对接种箱进行清洗，然后把气雾消毒剂按照每立方米8克的点燃消毒。

(2)、将灭菌冷却后的菌棒、桑黄栽培种放置在已消毒过的接种箱内，接种箱内用菌用气雾消毒剂8g进行消毒，半小时左右，气雾消失后进行接种。

(3)、接种人员准备接种前，双手用清洁的水洗净，伸入接种箱内，用70％-75％的酒精棉擦洗双手，然后把医用不锈钢镊子进行酒精消毒灭菌。完毕后打开栽培种、菌棒袋口，用镊子取栽培种直径3-4cm，厚度0.5-1cm放入菌棒袋口，用手捏紧菌棒袋口，将栽培种往菌棒袋中按结实，然后套上套环及套环盖封口，逐个接种。

(4)、接种后的菌棒放入培养室内避光培养，温度控制在20-30℃，湿度控制在40-50％，培养60-90天。

e、出芝管理：

(1)、当接种了桑黄的菌棒开始转色变成黄色或者棕黄色时，移入大棚栽培，进行散射光培养。在移入前对大棚内放置菌棒处进行松土，松土深度10cm以上，松土后用石灰水进行消毒。在摆放时，应把菌棒直立摆放，菌棒的封口朝上放置，间距在10cm×10cm。大棚温度控制在15-32℃，湿度控制在80-90％。

(2)、培养10天左右，待菌棒完全转色成黄色或者棕黄色之后，将菌棒逐个进行封口切除工作，然后原样直立放回土上。即切除封口之后切除封口的部位朝上，见图5。

(3)、继续培养4天后，待菌棒切口处的菌丝重新长满菌棒袋口，进行菌棒开口工作。首先，将菌棒切口朝下，每个菌棒开口4个，将菌棒的柱面分成四边，在相对的两边各开1个口，开口距地面6厘米，见图5。另外相对两边在距地面12厘米处开口，使4个开口呈品字型交错。开口要求：对菌棒外塑料袋向上开弧形口，使子实体长成后成形美观。然后，将菌棒直立，菌棒切口处埋入土中，埋入深度3-4厘米。

(4)、大棚必须每天通风2-3次，每次30-40分钟。培养60天以上得到桑黄子实体。

根据本发明方法得到的桑黄子实体出现在桑黄培养口处，收货时横切面呈弧形口，成型美观。单个子实体的重量较大。长6-12厘米，厚3-6厘米，单个子实体重15克-50克。

桑黄子实体的栽培结果：鲜品子实体颜色金黄色，干品子实体颜色棕黄色，子实体无柄，形状呈扇形，少许呈马蹄形，每袋可产桑黄子实体干品15-30g。

采收时，随机取3个子实体进行测量：

子实体鲜品长为12cm，宽6cm，厚3cm，重量为30g。

子实体鲜品长为9cm，宽5cm，厚2.6cm，重量为24g。

子实体鲜品长为6cm，宽3.5cm，厚2cm，重量为15g。

实施例2：

具体方法同实施例2，不同之处在于，采用的原种培养基和栽培种培养基的各原料组分的重量百分比为：麦皮12％，玉米粉12％，石膏粉1％，余量为桑枝木屑。

本发明的人工袋栽工艺经大量的培养实践证明，可实现真正桑黄的人工培养，并且单个子实体大小可以根据开口大小人为控制，桑黄人工袋栽，把野生稀缺资源、再生漫长的资源，人工短期再生。而且人工袋栽子实体成分含量跟野生桑黄成分含量相当。目前的培养规模约为35亩、25万袋，长成桑黄成扇形、马蹄形，子实层(子实体腹面)具有孔状结构、表面呈金黄色或棕黄色，老时变为黄棕色。菌肉黄色、棕色或具光泽的木色，在菌盖表面附近颜色较深。子实层为有光泽的木色至深棕色，常分为两层或多层。

不同来源的桑黄有效成分分析

以下实验采用的是本发明栽培得到的桑黄子实体(简称为桑都1号)，其他品种的桑黄均购自市场，其中，金寨桑黄购自安徽省金寨县绍新食药用菌研究所，桑都2-4号为本发明人从千岛湖桑树上采集。

一、水分分析

样品预处理测定用的供试品，一般先破碎过80目筛。

水分测定法取供试品2～5g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm；疏松供试品不超过10mm；精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量(％)。结果如表1所示。

表1 五种不同来源桑黄中水分含量表

桑黄来源	桑都1号	千岛湖野生	云南野生	千岛湖杨树	金寨
						水分含量(％)	8.24	10.75	10.79	11.14	8.27

由表1可知，桑都1号的水分含量均低于其他菌种，更易于存储。

二、灰分分析

样品预处理测定用的供试品，一般先破碎过80目筛。

总灰分测定法测定用的供试品须粉碎，使能通过二号筛，混合均匀后，取供试品2～3g(如须测定酸不溶性灰分，可取供试品3～5g)，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量(准确至0.01g)，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量(％)。

如供试品不易灰化，可将坩埚放冷，加热水或10％硝酸铁溶液2ml，使残渣湿润，然后置水浴上蒸干，残渣照前法炽灼，至坩埚内容物完全灰化。

表2 五种不同来源桑黄中灰分含量表

桑黄来源	桑都1号	千岛湖野生	云南野生	千岛湖杨树	金寨
						灰分含量(％)	4.95	3.73	4.86	1.95	2.87

桑都1号的灰分含量相对较高，这说明桑都1号桑黄中无机盐成分含量更高，更富营养。

三、水浸出物分析

样品预处理测定用的供试品，一般先破碎过80目筛。

热浸法测定水浸出物测定方法取供试品约2～4g，精密称定，置100～250ml的锥形瓶中，精密加水50～100ml，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中、在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速籍密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。结果如表3所示。

表3 五种不同来源桑黄中水浸出物含量表

桑都1号的水浸出物含量高于其他菌种近190％，说明作为中草药进行传统的中药炮制(煮)时，有效物质更容易被分离出来，更利于人们利用。

四、多糖含量分析

样品预处理测定用的供试品，一般先破碎过80目筛。

对照品溶液的制备取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

标准曲线的制备标准曲线：吸取标准葡萄糖溶液0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mL于试管中并加水至0.5mL，再加入5％苯酚溶液0.5mL，摇匀，再迅速加入2.5mL浓硫酸，混匀后50摄氏度放置30min，于490nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

供试品溶液的制备取本品粉末约2g，精密称定，加水30ml，90摄氏度超声波辅助提取4小时，5000rpm 15min，取上清按标准曲线制备方法即得。如上述方法制得标准曲线，如图1所示。由图1可知，所得线性关系良好。以此为标准曲线，得12个样品中所含多糖含量如图2所示。其中：F代表：金寨桑黄  J代表：桑都1号  K代表：桑都3号L代表：桑都2号  M代表：桑都4号  N代表：桦树桑黄O代表：千岛湖野生桑黄  P代表：杨树桑黄  Q代表：云南桑树桑黄R代表：榆林柳桑黄  S代表：臭松树桑黄  T代表：暴马子树桑黄。

图2的数据说明，桑都1号的多糖含量较高，超出其他菌种约1倍以上，优势明显。

五、游离氨基酸含量测定

提取各种来源桑黄中游离氨基酸，准确吸取试液1mL,注入25mL的容量瓶中，加入0.5mL pH8.0磷酸盐缓冲液和0.5mL2％茚三酮溶液，在沸水浴中加热15min。待冷却后加水定容至25mL。放置10min后用5mm比色杯在570nm处，以试剂空白溶液做参比，测定吸光度(A)。

氨基酸标准曲线的制作

分别吸取0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL氨基酸工作液于一组25mL容量瓶中，各加水4mL、pH8.0磷酸盐缓冲液0.5mL和2％茚三酮溶液0.5mL，在沸水浴中加热15min，冷却后加水定容至25mL，测定吸光度(A570)。将测得的吸光度与对应的谷氨酸浓度绘制标准曲线。

结果计算

桑黄中游离氨基酸含量以干态质量分数表示，计算式如下

游离氨基酸总量(谷氨酸计)(％)＝[(C/1000)*(L1/L2)]*100/M0*m

L1——试液总量，mL；

L2——测定用试液量，mL；

M0——试样量，g；

C——根据测定的吸光度从标准曲线上查得的谷氨酸的毫克数；

m——试样干物质含量。

按照此法制备氨基酸标准曲线，结果如图3所示。进而进行各种来源桑黄中氨基酸的测定，结果如图4所示。图中的仿生桑黄即本发明的桑都1号，可以看出桑都1号的氨基酸含量较为突出，是其他菌种的5倍左右。

以上所述实例仅为本发明的一种较佳的方案，但本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (8)

1.一种桑黄人工袋栽工艺，其特征在于该工艺包括如下步骤：

（1）从野生桑黄子实体上分离的菌株经纯化后接种到母种培养基中培养获得桑黄母种，桑黄母种接种到原种培养基上培养获得桑黄原种；将桑黄原种接种到栽培种培养基上培养获得桑黄栽培种；原种培养基和栽培种培养基主要是由桑枝木屑、麦皮、玉米粉和石膏粉混合而成；

（2）将桑黄栽培种接种到菌棒中进行出芝培养；

菌棒的制备：菌棒的组成同原种培养基，将桑枝木屑进行全面喷水预湿，湿度控制在60%-70%，充分预湿后加入麦皮、玉米粉和石膏粉进行拌料，混合均匀后装塑料袋，袋体直径为15-17cm，长度≤35cm，得到用于培养桑黄的菌棒；菌棒经灭菌后采用桑黄栽培种进行接种；接种后的菌棒放入培养室内避光培养，温度控制在20-30℃，湿度控制在40-50%，培养60-90天；

（3）出芝管理：

a、当桑黄菌棒开始转色变成黄色或者棕黄色时，移入大棚栽培，进行散射光培养，在移入前对大棚内放置菌棒处进行松土，松土深度10cm以上，松土后用石灰水进行消毒，然后将菌棒直立摆放，间距在10cm×10cm～15cm×15cm，大棚温度控制在15-32℃，湿度控制在80-90%；

b、培养10天以上，待菌棒完全转色成黄色或者棕黄色之后，将菌棒逐个进行封口切除工作，然后照原样直立放回土内；

c、继续培养4天后，待菌棒封口切口处的菌丝重新长满菌棒袋口，进行菌棒开口工作；首先，将菌棒封口朝下放置，每个菌棒外壁面开口3-4个，然后埋入土中，埋入深度3-4厘米；大棚每天通风2-3次，每次30-40分钟；培养60-90天后得到桑黄子实体。

2.根据权利要求1所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：菌棒进行高压或常压灭菌，高压灭菌时压力为3-5个大气压，温度120℃，灭菌时间为6-8小时；常压灭菌时压力为1个大气压，温度100℃，灭菌时间为24-36小时；灭菌后冷却18小时以上至室温。

3.根据权利要求1或2所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：步骤（2）中菌棒的接种过程如下：

a、在接种开始前，对接种箱进行清洗，然后把气雾消毒剂按照每立方米8克进行点燃消毒；

b、将灭菌冷却后的菌棒和桑黄栽培种放置在已消毒过的接种箱内，接种箱内用菌用气雾消毒剂8g进行消毒，气雾消失后进行接种；

c、打开栽培种和菌棒袋口，取栽培种直径3-4cm，厚度0.5-1cm放入菌棒袋口，用手捏紧菌棒袋口，将栽培种往菌棒袋中按结实，然后套上套环及套环盖封口。

4.根据权利要求1或2所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：步骤（3）的c中，将菌棒的柱面分成四边，在相对的两边各开1个口，开口距地面6厘米，另外两边在距地面12厘米处开口，使4个开***错。

5.根据权利要求4所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：所述的开口呈弧形口，弧形口的两端朝上。

6.根据权利要求1或2所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：原种培养基和栽培种培养基的各原料组分的重量百分比为：麦皮10-12%，玉米粉10-12%，石膏粉1%，余量为桑枝木屑。

7.根据权利要求6所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：原种培养基和栽培种培养基的各原料组分的重量百分比为：麦皮10%，玉米粉10%，石膏粉1%，余量为桑枝木屑。

8.根据权利要求6所述的桑黄人工袋栽工艺，其特征在于：所述的玉米粉的粒度为0.1-0.5mm，桑枝木屑的粒度为0.5-1.0 cm。