CN104371034A - 一种炙甘草多糖的提取方法及其新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种炙甘草多糖的提取方法，包括以下步骤：（1）预处理，得到滤液与滤渣；（2）滤渣加入超纯水mL继续煎煮小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并；（3）将合并后溶液于蒸发至溶液剩余5%～15%，转移至烧杯，冷却至室温；（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌；（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在烘干，得到熟附子多糖粉末；所述炙甘草多糖具备良好的抗肿瘤活性，具有扶正祛邪、减毒的作用，用于制备抗肿瘤药物；本发明的炙甘草多糖的提取方法，该提取方法的预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，大大提高提取效率。

Description

一种炙甘草多糖的提取方法及其新用途

技术领域

本发明涉及一种多糖的提取方法及其新用途，尤其涉及一种炙甘草多糖的提取方法及其用于制备抗肿瘤药物的新用途，属于天然药物技术领域。

背景技术

甘草为豆科甘草属植物的根和根状茎,为我国重要的传统中草药,在我国始于《神农本草经》。甘草被誉为中草药之王,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药的功效（中国药典，2005,59）。由于具有强的生理活性和高的药用价值,甘草属植物中化学成分得到了广泛研究和应用。

甘草的主要化学成分有三萜、黄酮,另外还有多糖、氨基酸、生物碱等,现代药理表明甘草具有肾上腺皮质激素样作用、抗消化性溃疡、抗炎抗***反应、抗病毒、镇咳祛痰等作用（天然产物研究与开发, 2006, 18: 343-347）。

近年来，肿瘤已经成为威胁人类健康的第一大疾病，对于肿瘤的治疗仍然以传统的细胞毒类药物为主，中药具备毒副反应低的特点已被逐步重视。近年来，国家日益重视中药现代化的投入，在传统的重要煎熬等治疗手段的背景下，结合现代分离提取工艺，获得有效成分。药用多糖的研究始于20 世纪50 年代末对微生物多糖抗癌效果的发现。科学家们从大量的药理和临床研究发现从天然产物中分离出来的多糖往往是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞而对正常细胞没有毒副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视，这已成为新药研究的热点之一。

甘草多糖作为主要活性物质之一，研究人员对其作了大量的研究。甘草多糖对B 淋巴细胞的影响。甘草多糖对正常小鼠淋巴细胞影响的体外增殖实验表明甘草多糖对小鼠淋巴细胞的增殖有促进作用（中药材，2003，26（7）：507-509．）。刘霞等人通过动物细胞培养实验证明甘草多糖具有促进淋巴细胞增殖的作用（中国公共卫生，2004，20（5）：572-573．）。

本发明通过优化的炙甘草多糖提取方法，将获得的炙甘草多糖产物进行一系列鉴定，并通过药理实验对炙甘草多糖的毒性作用和抗肿瘤作用进行研究，证明其可以用于制备抗肿瘤药物。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种提取效率高的炙甘草多糖的提取方法及其用于制备抗肿瘤药物的新用途。

本发明的技术解决方案是这样实现的：一种炙甘草多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将炙甘草原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将原料粉碎到20～30目后，将粉碎后的粉末加入超纯水2000mL～2400 mL进行高温超声处理30～40分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水2000mL～2400 mL继续煎煮1.5～2.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于80℃～90℃蒸发至溶液剩余5%～15%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为75%～85%。 

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀24～26小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在55℃～65℃烘干，得到炙甘草多糖粉末。

优选的，所述炙甘草多糖具备良好的抗肿瘤活性，具有扶正祛邪、减毒的作用，用于制备抗肿瘤药物。

优选的，通过动物实验得出：炙甘草多糖给药组的KM小鼠在同一时间点体重与正常对照组无差异（P>0.05）。

优选的，通过动物实验得出：炙甘草多糖给药组的KM小鼠在解剖后的动物肝脏系数和脾脏系数与正常对照组无差异（P>0.05）。

优选的，通过动物实验得出：炙甘草多糖给药组的平均瘤重较模型组有显著降低（P<0.001）。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明的炙甘草多糖的提取方法，该提取方法的预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，将原料进行高速粉碎得到粉末后，再结合高温超声处理，有助于药材中的有效成分分离，大大提高提取效率。炙甘草多糖具备良好的抗肿瘤作用，具有良好的抗肿瘤活性，具有扶正祛邪、减毒的作用，因此可以用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明：

附图1为炙甘草多糖的红外光谱鉴定图；

附图2为炙甘草多糖对正常小鼠体重的影响的实验统计图；

附图3为炙甘草多糖对正常小鼠脏器系数的影响的实验统计图；

附图4为炙甘草多糖对荷瘤小鼠体重的影响的实验统计图；

附图5为炙甘草多糖抗肿瘤效果的实验统计图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明。

1、炙甘草多糖的提取方法

实施例1：一种炙甘草多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将炙甘草原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将原料粉碎到20目后，将粉碎后的粉末加入超纯水2000mL进行高温超声处理30～40分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水2000mL继续煎煮1.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于80℃蒸发至溶液剩余5%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为75%。 

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀24小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在5℃烘干，得到炙甘草多糖粉末。

实施例2：一种炙甘草多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将炙甘草原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将原料粉碎到25目后，将粉碎后的粉末加入超纯水2200mL进行高温超声处理35分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水2200 mL继续煎煮2小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于85℃蒸发至溶液剩余10%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为80%。 

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀25小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在60℃烘干，得到炙甘草多糖粉末。

实施例3：一种炙甘草多糖的提取方法，包括以下步骤：

（1）将炙甘草原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将原料粉碎到30目后，将粉碎后的粉末加入超纯水2400 mL进行高温超声处理40分钟，收集滤液。

（2）滤渣加入超纯水2400 mL继续煎煮2.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并。

（3）将合并后溶液于90℃蒸发至溶液剩余15%，转移至烧杯，冷却至室温。

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为85%。 

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀26小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在65℃烘干，得到炙甘草多糖粉末。

上述提取方法的实施例，预处理方法在传统的水浸沸煮的基础上进行了优化，将原料进行高速粉碎，将粉碎目数控制在20～30目，再结合高温超声处理，有助于药材中的有效成分分离，大大提高了提取效率。

2、炙甘草多糖总含量的测定

首先进行5%苯酚的配制，方法为称取12.5 g苯酚用超纯水定容至250 mL。然后进行标准溶液的配制，方法为准确称取100 mg葡萄糖，定容至100 mL，得到葡萄糖浓度为1000 mg/L的储备液。分别精密吸取储备液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL容量瓶中，得到浓度为10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的系列标准溶液。准备样品，方法为准确称取提取的多糖粉末10 mg，用超纯水定容至100 mL，80℃水浴溶解。进行样品含量测定，分别取系列标准溶液、样品溶液及空白（以超纯水作空白）1 mL，于具塞比色管中，加入1 mL 5%的苯酚，摇匀，垂直迅速加入3 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴15分钟。取出后迅速冷却。在490 nm波长下进行测定。以吸光度A对浓度C回归得方程：A = 0.00794C + 0.01559，r = 0.99。测得提取粉末总糖含量为57.8%。炙甘草多糖得率为12.5%。

3、炙甘草多糖的鉴定

借助红外光谱和紫外光谱测定技术，对炙甘草多糖成分进行鉴定。红外光谱鉴定借助Thermo NICOLET is10 FTIR进行。方法为取干燥后的粉末约1 mg与100 mg KBr固体粉末在玛瑙研钵中研磨均匀，压片后在400～4000cm-1区波数范围内进行红外光谱扫描。为了判断多糖中核酸和蛋白质杂质的成分，利用紫外光谱进行多糖的鉴定，借助贝克曼DU800紫外分光光度计对多糖样本进行检测。结果如图1和下表所示：

4、炙甘草多糖对小鼠毒性试验

选择KM小鼠24只，基于体重随机化区层分组（分组之日记做day0），分为2组：阴性对照组、炙甘草多糖（2g/kg）；每组12只，雌、雄各半。采用单次口服给药，给药体积为20mL/kg，给药后观察7天。期间测体重及记录临床症状等指标，观察结束后解剖动物，称量肝脏重量和脾脏重量，计算肝脏系数和脾脏系数。图2中可以看出，多糖给药组动物在同一时间点体重与正常对照组无差异（P＞0.05），说明炙甘草多糖以2g/kg高剂量给药对动物体重没有影响，结合图3进一步判断，各给药组在解剖后对动物肝脏系数和脾脏系数均无差异（P＞0.05），这充分说明了炙甘草多糖对小鼠无毒副作用。

5、炙甘草多糖的抗肿瘤作用

为了研究炙甘草多糖的抗肿瘤作用，将炙甘草多糖以1000mg/kg剂量给药。阳性对照药物选择阿霉素。

小鼠肿瘤模型利用肝癌H22接种获得，首先从液氮中复苏H22腹水瘤细胞，将0.5 mL细胞注射至生长状况良好的KM小鼠腹腔。1周后取腹水生长良好的小鼠，安乐死后抽取腹水，腹水无血方可用于接种实验。选择80只KM小鼠，雌雄各半，动物经体重随机化区层分为3组后，将0.1mL腹水瘤源细胞接种至小鼠腋窝处皮下，并开始给药，每日观察荷瘤鼠生存状况和瘤子大小情况。连续给药7-10后动物进行安乐死，剥离肿瘤并称重拍照，计算抑瘤率。计算公式IR%=1-T/C%，T为治疗组平均瘤重，C为模型组平均瘤重。

图4可以看出，阿霉素给药组荷瘤动物体重在给药后期出现体重下降的现象，说明阿霉素毒性作用较强，这是由于细胞毒类抗肿瘤药物的严重毒性反应所致；而炙甘草多糖组和阴性对照组动物体重增长趋势基本一致。图5可以看出，与模型组比较，各给药组平均瘤重均显著低于模型组平均瘤重（P<0.001），炙甘草抗肿瘤作用明显。

综上所述，炙甘草多糖具备良好的抗肿瘤作用，具有良好的抗肿瘤活性，具有扶正祛邪、减毒的作用，因此可以用于制备抗肿瘤药物。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种炙甘草多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将炙甘草原料100g，使用药用机械粉碎机进行高速粉碎，将原料粉碎到20～30目后，将粉碎后的粉末加入超纯水2000mL～2400 mL进行高温超声处理30～40分钟，收集滤液；

（2）滤渣加入超纯水2000mL～2400 mL继续煎煮1.5～2.5小时后，与步骤（1）中收集的滤液合并；

（3）将合并后溶液于80℃～90℃蒸发至溶液剩余5%～15%，转移至烧杯，冷却至室温；

（4）加入95%的乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终乙醇含量约为75%～85%；

（5）将步骤（4）的溶液静置沉淀24～26小时后，抽滤，弃去滤液，收集滤渣；

滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在55℃～65℃烘干，得到炙甘草多糖粉末。

2.一种炙甘草多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：所述炙甘草多糖具备良好的抗肿瘤活性，具有扶正祛邪、减毒的作用，用于制备抗肿瘤药物。

3.根据权利要求2所述的炙甘草多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过动物实验得出：炙甘草多糖给药组的KM小鼠在同一时间点体重与正常对照组无差异（P>0.05）。

4.据权利要求2所述的炙甘草多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过动物实验得出：炙甘草多糖给药组的KM小鼠在解剖后的动物肝脏系数和脾脏系数与正常对照组无差异（P>0.05）。

5.据权利要求2所述的炙甘草多糖用于制备抗肿瘤药物的新用途，其特征在于：通过动物实验得出：炙甘草多糖给药组的平均瘤重较模型组有显著降低（P<0.001）。