CN104365478A - 可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法。其步骤包括：1)选择外植体；2)将洗净的新梢保留其长度，剪去顶芽和叶片，同时保留叶柄；整根杀菌；杀菌完成后，先剪去新梢两端受损部分，再将其余部分分段剪成长1～1.5cm带茎段和叶柄的单个腋芽备用，以作为茶树初代培养的外植体；3)初代培养。本发明操作简便，可实现在利用茶树器官或组织进行离体培养时，同时的降低外植体褐化度和污染度，茶树腋芽离体培养的成功率和效率可得到显著提升。

Description

可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法。

背景技术

茶是世界三大无酒精饮料之一，富含具药理和保健功能的次级代谢产物如儿茶素、茶氨酸、茶多糖和咖啡碱等。

茶自交不亲和，结实率低，给育种研究带来很大困难。茶树育种至今仍以单株选育为主，造成茶育种工作费时费力，难度大，效率低。目前生产上茶树繁育常用的是短穗扦插，然而短穗扦插易受季节限制、占地面积大、土壤消毒难等因素影响。目前茶树种质资源保存方法多是建立种质资源圃，然而此方法存在占地面积大、管理成本高、品种适应性等问题。利用组培技术可以克服上述缺陷，在较短的时间内进行茶树的快速、大量地繁殖，不改变原品种的特性。因此，建立茶树腋芽离体培养方法，可以提高茶树育种、繁育、种质资源保存等工作的效率。

目前，茶树腋芽离体培养方式中，茶树外植体消毒是其中至关重要的步骤。传统茶树外植体消毒方式，多在取用新梢后，直接将新梢剪成1cm短段，再放至0.1％氯化汞溶液中浸泡消毒，这在公告号为CN102422810A的发明名称为“一种茶树无性系离体再生培养的方法”的中国发明专利申请中有所描述。然而，随着试验的逐步深入，人们发现，汞离子在杀灭微生物的同时，也会同步的对试验中的茶树外植体造成损伤。而为保证消毒效果，减少外植体污染程度，其消毒又往往必须满足指定时间。消毒时间越长，外植体污染程度清除的越彻底，但是，随之带来的就是外植体损伤越重，新梢段褐化率反而愈高。如何在外植体褐化程度和污染程度间寻求一个平衡点，以在利用茶树器官或组织进行离体培养时，能够同步的降低外植体褐化度和污染度，以提升茶树腋芽离体培养的成功率和效率，为本领域近年来所亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的为克服上述现有技术的不足，提供一种可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，其可实现在利用茶树器官或组织进行离体培养时，同时降低外植体褐化度和污染度，茶树腋芽离体培养的成功率和效率可得到显著提升。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，包括以下步骤：

1)、选择外植体

选用茶树的未木质化健壮新梢，用洁净流水冲洗表面杂物；

2)、杀灭表面菌

将洗净的新梢保留其长度，剪去顶芽和叶片，同时保留叶柄；在超净台中，将该裁剪后新梢整根的放入消毒后的透明试剂瓶中；先使用浓度70％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水漂洗3次；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的氯化汞溶液中，在摇床中以100-120rpm的转速浸泡9min，最后用无菌水冲洗干净残留的氯化汞；杀菌完成后，先剪去新梢两端浸泡受损部分，再将其余部分分段剪成长1～1.5cm带茎段和叶柄的单个腋芽备用，以作为茶树初代培养的外植体；

3)、初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于10℃下避光培养48h，接着在25℃、光照时间16h/d、光照强度1200-2000lx条件下进行培养；所述初代培养基为：1/4MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L培养基。

所述步骤1)中，未木质化健壮新梢的采集时间在4月至5月上旬。

所述步骤2)中，透明试剂瓶为容积是250ml或500ml的可耐115℃下15min高温灭菌的圆形玻璃广口瓶，瓶体高度大于15cm。

所述步骤3)中，初代培养基使用前需将其调节pH至5.8，于121℃下灭菌20min。

所述步骤1)中，所述洁净流水选用自来水。

本发明的主要优点在于：

1)、本发明不再沿用传统的分段浸泡消毒的方式，而是走出了常年人们的操作误区，另辟蹊径的直接对整根新梢进行后续消毒步骤。实际上，通过申请人投入大量精力，而获得的试验数据表明，茶树新梢的整根浸泡灭菌和传统的分段式灭菌方式其所达到的灭菌效果几乎是完全等同的。而与此同时，整根浸泡消毒方式，带来的不仅仅是上述符合要求的灭菌效果，同时减少了外植体伤口面积，利用了茶树新梢表面所覆盖的表皮，能够在新梢整根浸泡时，有效的隔离汞离子，减轻汞离子对于该外植体的损伤性，这就直接性的达到了降低外植体褐化程度的目的，这也是导致本发明的操作方式明显优于传统处理方式的其中一个根源所在。同时，在摇床上进行植物材料的消毒操作，也可以提高消毒效果，降低外植体污染率，降低外植体起始培养温度能钝化多酚氧化酶的活性，减少多酚类物质的氧化量，其也可对外植体褐化的降低起到有利影响。考虑到未被表皮及鳞片覆盖的茶树新梢的根部有伤口的存在，常常褐化程度较高，在后期选用时即可完全弃之不用，从而保证每一根待用的外植体，其伤口均未受到氯化汞损伤，最终达到有效提高茶树腋芽离体培养的成功率和效率的效果。外植体在培养基中起始培养温度选择10℃低温，更能有效的钝化多酚氧化酶的活性，减少多酚类物质的氧化量，以达到进一步减轻外植体褐化的目的。

通过上述方案，本发明可实现在利用茶树器官或组织进行离体培养时，同时降低外植体褐化度和污染度，茶树腋芽离体培养的成功率和效率可得到显著提升。

附图说明

图表1为实施例1的本发明的处理方式和传统的处理方式的实验结果对比表；

图表2为实施例2的本发明的处理方式和传统的处理方式的实验结果对比表；

图表3为实施例3的本发明的处理方式和传统的处理方式的实验结果对比表。

具体实施方式

为便于理解，此处结合附图，以具体实施例对本发明的技术方案作以下进一步阐述：

实施例1

试验茶树品种：“凫早2号”；

采集地点：安徽省农业科学院茶叶研究所品种园；

采集时间：2012年4月16日；

试验材料：田间采集的未木质化的健壮新梢；

试验过程：

1)、选择外植体

取作为试验材料的未木质化健壮新梢，经自来水冲洗干净。

2)、杀灭表面菌

取上述整根的洗净的新梢，剪去顶芽和叶片，保留叶柄；保留其整根形状，在超净台中放入消毒后的塑料试剂瓶中，先使用浓度70％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水漂洗3次；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的氯化汞溶液中，在摇床中以100rpm的转速浸泡消毒8min，无菌水清洗干净，最后将新梢去除两端，剪成长1.2cm带茎段和叶柄的单个腋芽，作为茶树初代培养的外植体。

3)、初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于10℃下避光培养48h，接着在25℃、光照时间16h/d、光照强度1200-2000lx条件下进行培养；所述初代培养基为：1/4MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L培养基中。

4)、获得数据

以上述本发明的处理方式和传统的处理方式分别接种50个外植体，重复3次，培养7d后统计污染率和褐化率，获得表1的试验结果。

如图表1所示的试验结果表明：与传统外植体消毒方法相比，采用本发明的整根枝条消毒方式，其外植体的污染率和褐化率均有不同程度的下降。尤其是外植体污染率下降了25.34％，达到了显著性差异，褐化率差别达到4.67％，各项数据均具备显著进步，完全达到了预期要求。

实施例2

试验茶树品种：“凫早2号”；

采集地点：安徽省农业科学院茶叶研究所品种园；

采集时间：2012年4月26日；

试验材料：田间采集的未木质化的健壮新梢；

试验过程：

1)、选择外植体

取作为试验材料的未木质化健壮新梢，经自来水冲洗干净。

2)、杀灭表面菌

取上述整根的洗净的新梢，剪去顶芽和叶片，保留叶柄；保留其整根形状，在超净台中放入消毒后的塑料试剂瓶中，先使用浓度70％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水漂洗3次；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的氯化汞溶液中，在摇床中以110rpm的转速浸泡消毒9min，无菌水清洗干净，最后将新梢去除两端，剪成长1cm带茎段和叶柄的单个腋芽，作为茶树初代培养的外植体。

3)、初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于10℃下避光培养48h，接着在25℃、光照时间16h/d、光照强度1200-2000lx条件下进行培养；所述初代培养基为：1/4MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L培养基中。

4)、获得数据

以上述本发明的处理方式和传统的处理方式分别接种50个外植体，重复3次，培养7d后统计污染率和褐化率，获得表1的试验结果。

如图表2所示的试验结果表明，与传统外植体消毒方法相比，采用本发明的整根枝条消毒方式，其外植体的污染率和褐化率均有不同程度的下降。尤其是外植体污染率下降了26.78％，达到了显著性差异，褐化率也仅有3.98％，满足预期要求。

实施例3

试验茶树品种：“凫早2号”；

采集地点：安徽省农业科学院茶叶研究所品种园；

采集时间：2012年5月1日；

试验材料：田间采集的未木质化的健壮新梢；

试验过程：

1)、选择外植体

取作为试验材料的未木质化健壮新梢，经自来水冲洗干净。

2)、杀灭表面菌

取上述整根的洗净的新梢，剪去顶芽和叶片，保留叶柄；保留其整根形状，在超净台中放入消毒后的塑料试剂瓶中，先使用浓度70％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水漂洗3次；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的氯化汞溶液中，在摇床中以120rpm的转速浸泡消毒10min，无菌水清洗干净，最后将新梢去除两端，剪成长1.5cm带茎段和叶柄的单个腋芽，作为茶树初代培养的外植体。

3)、初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于10℃下避光培养48h，接着在25℃、光照时间16h/d、光照强度1200-2000lx条件下进行培养；所述初代培养基为：1/4MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L培养基中。

4)、获得数据

以上述本发明的处理方式和传统的处理方式分别接种50个外植体，重复3次，培养7d后统计污染率和褐化率，获得表1的试验结果。

如图表3所示的试验结果表明，与传统外植体消毒方法相比，采用本发明的整根枝条消毒方式，其外植体的污染率和褐化率均有不同程度的下降。尤其是外植体污染率下降了25.68％，达到了显著性差异，褐化率也仅有4.12％，与传统的实验步骤所达到的8.76％存在巨大差别。

通过上述试验可知，本发明具备了在利用茶树器官或组织进行离体培养时，能够同时降低外植体褐化度和污染度的目的。其整个试验过程中，依靠新梢的整取整用，突破了现有技术枷锁，而使受试验的外植体损伤性达到了最低化；最终实现了有效提高茶树腋芽离体培养的成功率和效率的设计初衷，更为加快茶树腋芽离体培养应用于育种、繁育、种质资源保存、快繁体系的建立等工作奠定了坚实基础，其市场前景广阔。

Claims (5)

1.可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、选择外植体

选用茶树的未木质化健壮新梢，用洁净流水冲洗表面杂物；

2)、杀灭表面菌

将洗净的新梢保留其长度，剪去顶芽和叶片，同时保留叶柄；在超净台中，将该裁剪后新梢整根的放入消毒后的透明试剂瓶中；先使用浓度70％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水漂洗3次；接着置于含有0.1％吐温的浓度0.1％的氯化汞溶液中，在摇床中以100-120rpm的转速浸泡9min，最后用无菌水冲洗干净残留的氯化汞；杀菌完成后，先剪去新梢两端浸泡受损部分，再将其余部分分段剪成长1～1.5cm带茎段和叶柄的单个腋芽备用，以作为茶树初代培养的外植体；

3)、初代培养

将上述外植体接种在初代培养基上，置于10℃下避光培养48h，接着在25℃、光照时间16h/d、光照强度1200-2000lx条件下进行培养；所述初代培养基为：1/4MS+BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L培养基。

2.根据权利要求1所述的可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，其特征在于：所述步骤1)中，未木质化健壮新梢的采集时间在4月至5月上旬。

3.根据权利要求1所述的可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，透明试剂瓶为容积是250ml或500ml的可耐115℃下15min高温灭菌的圆形玻璃广口瓶，瓶体高度大于15cm。

4.根据权利要求1所述的可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，其特征在于：所述步骤3)中，初代培养基使用前需将其调节pH至5.8，于121℃下灭菌20min。

5.根据权利要求1所述的可同时降低茶树腋芽褐化和污染的初代培养方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述洁净流水选用自来水。