CN104357580A - 两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重rt-pcr方法及其专用引物组 - Google Patents

两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重rt-pcr方法及其专用引物组 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种两步法检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物，属植物保护领域。该方法包括第一步在一次PCR反应中检测葫芦科作物4种主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，第二步再在一次PCR反应中检测2种次要病毒(TMV和PRSV)。首先人工筛选合成适用于两步多重PCR的特异性引物；分析获得6种病毒单独侵染的病样，提取植株的总RNA；随机引物进行反转录，再分别整合4重和2重PCR的反应体系和条件，建立两步反应能够检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法。本方法具有操作简便、省时省力、节约成本、结果可靠等优点，对葫芦科作物病毒病的监测监控具有广泛的应用前景。

Description

两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物组
技术领域
本发明属于植物病毒学技术领域，尤其涉及到一种两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物组。
背景技术，
葫芦科作物是一种重要的世界性经济作物，其重要性仅次于禾本科、豆科和茄科作物，约118属825种，主要分布于热带和亚热带，作为栽培作物的主要有西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、丝瓜、冬瓜、瓠子等瓜类。我国有32属154种和35变种，主要分布在南部地区，特别在经济发达的东南部地区，瓜类栽培面积处于快速增长阶段，与大田作物相比，瓜类作物类型多、品种杂、单品种面积小、其病害的发生和危害程度也愈趋严重和广泛。病害的发生严重影响作物的生长和品质，使其产量受损或失去食用价值。其中病毒病害的发生最为严重，病毒种类繁杂、株系众多，不同病毒同时侵害引起的复合侵染现象普遍，病害发生年度间变化大，给防控和检测都带来很大难度，病毒病已经成为我国蔬菜生产主要制约因子之一。
江苏是农业大省，自种植结构调整发展高效农业以来，蔬菜种植面积发展迅速，目前复种面积已达2000万亩以上(含西甜瓜)，生产中病毒病是其主要病害问题之一。根据这一需求，前期我们已对江苏各市县葫芦科作物进行了连续两年的病毒病跟踪监测，发现侵染各葫芦科作物的病毒主要有西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus，ZYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)，偶尔检出的病毒有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)，而且在田间会经常发生复合感染的现象。针对我省葫芦科作物病毒病发生的特点，开发新型的简便、快捷、稳定、实用以及能够同时检测多个病毒的技术，并对生产上病毒病害发生动态进行长期有效的监测，对于葫芦科作物病毒病防控而言是至关重要的。
就目前而言，由于缺乏有效的治疗手段，葫芦科作物病毒病的检测在葫芦科疫病防治工作中尤为重要。伴随着生物学的发展，很多高通量、特异性强的检测手段相继问世，生物学检测、电镜检测、血清学检测、RT-PCR检测和核酸杂交检测等都是应用于葫芦科作物病毒检测的常用方法，其中生物学检测周期较长，电镜操作技能性较高且价格昂贵，而且工作都比较集中，不能够一次性处理大量样品，所以这两种方法在葫芦科作物病毒病的检测中都存在着很大的局限性。RT-PCR方法具备特异性好、敏感度高、操作简单快捷且成本低等特点，在基层检疫工作中受到广泛应用。但由于葫芦科病毒病的病原众多，感染情况复杂，针对单一病毒的RT-PCR检测已经远远不能满足检测工作的需求，所以迫切需要开发出一种适用于不同葫芦科作物的多种病毒同时检测的多重RT-PCR方法。
与别的检测手段相比，多重RT-PCR技术具有诸多不可比拟的优点，它能够在同一个PCR体系中同时扩增出多个目的基因，省时，省力，效率高，特别是节省昂贵的实验试剂和珍贵的实验样品。目前，在生命科学各个领域，如医学研究，遗传学研究，植物生物学研究等领域，多重RT-PCR都已经得到广泛应用，逐渐成为一项重要而成熟的研究手段。因此，针对江苏省葫芦科作物病毒病发生的种类和特点，我们发明了一种两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重RT-PCR方法，以期为葫芦科作物病毒病害的发生动态进行长期有效的监测，从而有针对性地采取防控措施。
发明内容
本发明针对江苏省葫芦科作物上病毒病发生的现状和特点，提供一种两步法检测葫芦科作物上多种病毒的多重RT-PCR方法，第一步在一次PCR反应中同时检测葫芦科作物中4种主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，第二步再在一次PCR反应中同时检测2种次要病毒(TMV和PRSV)。根据6种病毒基因组序列保守区域分别设计合成一对特异性引物，整合了影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、Mg2+浓度、r-Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等体系的优化，建立了两步法即可检测出葫芦科作物上多种病毒的方法，该方法的建立将为葫芦科病毒病的检测提供一种简便、快捷、高效且低成本的方法。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：首先甄别比对葫芦科作物病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV)基因组中的保守区域，人工合成筛选适用于两步实现的4种和2种病毒的多重RT-PCR的特异性引物；人工接种纯化获得以上6种病毒单独侵染的阳性样品；整合反转录和PCR反应所需的酶、缓冲液、dNTPs、引物等的浓度，通过退火温度、延伸温度、循环数等反应条件的优化，建立基于两步法检测葫芦科作物上多种病毒的多重RT-PCR方法。
具体步骤如下：
(1)6种病毒特异性核苷酸引物设计与合成
使用DNAMAN5.0软件，对Genbank中收录的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列进行比对，确定病毒序列中相对保守区域，在选定的保守区域内使用Oligo5.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物的特异性。由于多重PCR要求各引物对的退火温度尽量接近，扩增片段的大小在琼脂糖凝胶电泳能够显著区分的情况下尽量相近，故最终在两次PCR反应中选定6种病毒引物各一对，人工合成后用去RNase水溶解至工作浓度10μM备用。
WMV：上游引物(WMVF)5′-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3′
下游引物(WMVR)5′-TGCTGCGTCTGAGAAATG-3′
ZYMV：上游引物(ZYMVF)5′-AGCTCCATCATAGCTGAGCAG-3′
下游引物(ZYMVR)5′-TAGCTTGCGCTTGCAAACGAC-3′
CMV：上游引物(CMVF)5′-CACTATTCCCGACTTTGAGACCC-3′
下游引物(CMVR)5′-CTCATAAGCGGCATACTCTAACAT-3′
CGMMV：上游引物(CGMMVF)5′-CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG-3′
下游引物(CGMMVR)5′-TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT-3′
TMV：上游引物(TMVF)5′-TGGATCCGCCGACCCAATAGAGTTA-3′
下游引物(TMVR)5′-GTCGAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3′
PRSV：上游引物(PRSVF)5′-ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA-3′
下游引物(PRSVR)5′-GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA-3′
(2)葫芦科作物感染病毒样品总RNA的提取
首先用血清学诊断试剂盒分析病毒感染葫芦科作物样品，找到由WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV单独侵染的6种样品。分别取4种病毒(WMV、ZYMV、CMV和CGMMV)和2种病毒(TMV和PRSV)典型症状混合叶片0.1g，液氮下研磨成粉末，提取样品总RNA，最后溶于50μl无RNA酶污染的双蒸水中，-70℃保存备用。
(3)两步法多重RT-PCR方法检测体系的建立
应用购于Takara公司的引物Oligo(dT)18对提取的植物病毒RNA进行反转录制备cDNA模板，然后应用步骤(1)中合成备用的引物对进行4重和2重PCR反应，通过多个梯度性预实验，反复摸索和调整体系因素和反应条件，最终获得最佳条件并得到扩增产物。
(4)电泳检测
对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判断侵染葫芦科作物的病毒种类。
上述方法中还可包括如下步骤：
(5)结果分析
扩增的靶基因条带割胶回收，再与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，碱裂解法提取质粒并测序，结果与设计病毒扩增基因的大小进行比较，分析所得序列与参考序列的同源率，从而判定多重PCR结果的可靠性。
上述步骤中，步骤(2)中使用Agdia公司的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV诊断试剂盒PathoScreenR WMV、PathoScreenRZYMV、PathoScreenRCMV、PathoScreenRCGMMV、PathoScreenRTMV和PathoScreenRPRSV检测分析采集的葫芦科作物样品，通过血清学方法找到6种病毒单独侵染的样品；应用Trizol试剂盒提取这些样品的总RNA。
上述步骤中，步骤(3)中第-步4重PCR的4对引物浓度比例优选地为WMV引物：ZYMV引物：CMV引物：CGMMV引物＝3∶2∶3∶2；第二步2重PCR的2对引物浓度比例优选地为TMV引物：PRSV引物＝1∶1。
上述步骤中，步骤(3)中两步多重PCR反应体系都优选地r-Taq DNA聚合酶浓度为0.10U/μL，Mg2+浓度为3.0mmol/L，dNTPs浓度为0.25mmol/L。
上述步骤中，步骤(3)中两步多重PCR反应条件中优选地第一步4重PCR反应中扩增条件为退火温度53℃，延伸时间80s，循环次数35次；第二步2重PCR反应中扩增条件为退火温度55℃，延伸时间60s，循环次数30次。
本发明提供了一种两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物组，根据生产上葫芦科作物易受多种病毒复合侵染的特点，选择性地对这些病毒进行了两步多重RT-PCR筛选鉴定，本发明较之单一RT-PCR具有节省时间、降低成本、提高效率等优点；较之以往报道的5重及以上RT-PCR方法在实际应用过程中干扰因素多、灵敏度和检出率低等缺陷，本方法更能够减少污染和反应中的影响因素，提高检测灵敏度，大大降低漏检几率。在葫芦科作物的生产上，实现对各类病毒的早期诊断，实现实验室内对病毒病害种类的快速、高效、低成本、大批量检测，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、病害的流行预测预报具有十分重要的意义。
附图说明
图1为6种病毒的单重、4重和2重PCR检测结果：M.100bp DNA Ladder；1为健康西葫芦(CK-)；2-5依次为CMV、WMV、CGMMV和ZYMV单独侵染的样品；6为CMV、WMV、CGMMV和ZYMV混合的样品；7-8依次为TMV和PRSV单独侵染的样品；9为TMV和PRSV混合的样品。
图2为第一步4重PCR检测田间样品的结果：M.Marker3；1为健康西葫芦(CK-)；2-16为江苏东台的西瓜、南京的西瓜、洪泽的西葫芦、姜堰的西葫芦、高邮的丝瓜、连云港的南瓜、徐州的南瓜、句容的香瓜、通州的瓠瓜、宿迁的西葫芦、苏州的丝瓜、金坛的甜瓜、东台的黄瓜、泰兴的西瓜和姜堰的南瓜样品。
图3为第二步2重PCR检测田间样品的结果：M.Marker3；1为健康西葫芦(CK-)；2-16同图2的样品。
具体实施方法
本发明结合以下实施例做进一步描述，但不限制本发明。
引物设计与制备
使用DNAMAN 5.0软件，对Genbank中收录的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列进行比对，确定病毒序列中相对保守区域，在选定的保守区域内使用Oligo5.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物的特异性。由于多重PCR要求各引物对的退火温度尽量接近，扩增片段的大小在琼脂糖凝胶电泳能够显著区分的情况下尽量相近，故最终在两次PCR反应中选定6种病毒引物各一对，人工合成后用去RNase水溶解至工作浓度10μM备用。每种引物的信息如表1所述：
表1两步多重RT-PCR扩增病毒的引物信息(SEQ ID NO.1-12)
上述引物由上海英俊有限公司合成。
本发明实施例中所用的实验材料如下：
WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV6种病毒的分离物于2012年从江苏南京、盐都、徐州、洪泽、淮安等地的发病甜瓜、西葫芦、西瓜、南瓜等上采集，通过6种病毒的血清学诊断试剂盒找到6种病毒单独侵染的样品，并在西葫芦上接种繁殖，样品保存于-70℃冰箱中；
总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，r-Taq DNA聚合酶、dNTP、BamH I、Sal I购自大连宝生物公司，反转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂购自Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、大肠杆菌(E.coli DH5)感受态细胞、pMD18-T载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司，血清学诊断试剂盒购自Agdia公司。
实施例1，单重RT-PCR
病毒总RNA提取
分别称取感染WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV6种病毒的样品病叶各0.1g，在冰浴条件下用液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的2.0mLEP管中，每管加入1mL Trizol Reagent，充分振荡1min，室温静置5min。加入0.2mL氯仿上下颠倒混匀，室温静置3min，4℃，12000×g离心15min。取上层液相加入另一新的1.5mL EP管中，加入0.5mL异丙醇，振荡混匀，-20℃静置30min，4℃，12000×g离心10min，弃上清。用1mL75％的乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤沉淀两次，每次4℃，7000×g离心5min，弃上清，自然干燥。最后溶于50μL去RNase的DEPC水中，-70℃保存备用。同时以健康西葫芦(标记为CK-)的总RNA为阴性对照，RNA提取方法同上。
反转录(RT)反应
以6种单一病毒和CK-的RNA为模板，oligodT18引物反转录得到cDNA第一链，反应程序参照M-MLV说明书，15μL反应体系如下：3μL RNA，1μLoligodT18(10μmol/L)，6μL DEPC水，65℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入2.5μL 5×RT buffer，0.5μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和0.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，短暂离心后DEPC水补足至15μL，42℃水浴1h，70℃灭活5min，置-20℃待用。
单重PCR反应
25μL PCR标准反应体系：15.75μL ddH2O，2.5μL10×PCR buffer(Mg2+free)，1.5μL MgCl2(25mmol/L)，2μL dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，lμL上游和下游引物混合物(各10μmol/L)，0.25μL r-Taq DNA聚合酶(5U/μL)和2μL cDNA模板。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像***进行观察分析。
电泳检测
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，120V稳压电泳30min，再经凝胶成像***观察记录结果，分别得到6条特异性条带，扩增条带的大小与引物预期条带大小基本一致，参见说明书附图的图1。
实施例2，多重RT-PCR
病毒总RNA提取
称取等量分别侵染6种病毒的叶片，WMV、ZYMV、CMV和CGMMV4种叶片充分混合(标记为H4)，TMV和PRSV2种叶片充分混合(标记为H2)，健康西葫芦叶片为阴性对照(标记为CK-)。H4、H2和CK-各取0.1g，在冰浴条件下用液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的2.0mL EP管中，每管加入1mLTrizol Reagent，充分振荡1min，室温静置5min。加入0.2mL氯仿上下颠倒混匀，室温静置3min，4℃，12000×g离心15min。取上层液相加入另-新的1.5mLEP管中，加入0.5mL异丙醇，振荡混匀，-20℃静置30min，4℃，12000×g离心10min，弃上清。用1mL75％的乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤沉淀两次，每次4℃，7000×g离心5min，弃上清，自然干燥。最后溶于50μL去RNase的DEPC水中，-70℃保存备用。
反转录(RT)反应
以3个样品(H4、H2和CK-)的RNA为模板，oligodT18引物反转录得到cDNA第一链，反应程序参照M-MLV说明书，15μL反应体系如下：3μLRNA，1μL oligodT18(10μmol/L)，6μL DEPC水，65℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入2.5μL 5×RT buffer；0.5μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μLRNase Inhibitor(40U/μL)和0.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，短暂离心后DEPC水补足至15μL，42℃水浴1h，70℃灭活5min，置-20℃待用
多重PCR反应及体系优化
4重和2重PCR反应的体系都在在上述25μL单重PCR标准反应体系基础上调整，4重PCR将正向和反向引物混合物(10μmol/L each)更换为4对特异性引物起初各0.5μL(10μmol/L each)，经过反复调整最终确定各引物比WMV：ZYMV：CMV：CGMMV＝3∶2∶3∶2，终引物混合物为4μL；2重PCR将正向和反向引物混合物(10μmol/L each)更换为2对特异性引物各0.5μL(10μmol/Leach)，经实验确定各引物比TMV：PRSV＝1∶1，终引物混合物为2μL。
然后在有效的多重RT-PCR条件下，考察影响多重PCR的主要因素，对某一因素进行考察时，其他因素不变。在实验过程中对r-Taq DNA聚合酶浓度分别设0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.12U/μL 6个处理；Mg2+浓度分别选择1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0mmol/L6个处理；dNTPs浓度分别设0.10、0.25、0.40、0.55、0.70和0.85mmol/L6个处理；退火温度分别选择48℃、51℃、53℃、55℃、58℃和60℃；延伸时间分别为50、60、70、80、90和100s；循环次数选择20、25、30、35、40和45个循环进行多重PCR体系的优化。最终得到两步多重PCR方法的最佳反应条件：4重和2重PCR反应体系中都优选地r-TaqDNA聚合酶浓度为0.10U/μL，Mg2+浓度为3.0mmol/L，dNTPs浓度为0.25mmol/L；第一步4重PCR反应中扩增条件为退火温度53℃，延伸时间80s，循环次数35次；第二步2重PCR反应中扩增条件为退火温度55℃，延伸时间60s，循环次数30次。
电泳检测
取5μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，120V稳压电泳30min，再经凝胶成像***观察记录结果，H4和H2都得到了较为清晰且特异的条带，扩增条带的大小与引物预期条带大小基本一致，参见说明书附图的图1。
PCR产物的克隆测序和序列分析
两步多重RT-PCR扩增的6条DNA靶片段采用Axygen柱式胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)回收，回收DNA溶于30μL的溶解液中。回收产物与pMD18-T载体连接(参见pMD18-T试剂盒说明书)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，碱裂解法提取质粒，经PCR及酶切鉴定筛选重组质粒。每个分离物挑选2个阳性克隆进行测序，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果表明，WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV的扩增产物序列分别由485、1100、389、660、410和325个核苷酸组成，与设计的PCR产物大小相同；序列同源率分析结果表明，所得序列与Genbank中参考序列的同源率分别达到98.25％、99.01％、99.93％、98.22％、98.30％和99.12％，证明了多重RT-PCR检测结果的可靠性。
实施例3，利用两步多重RT-PCR方法对田间样品进行检测
病毒总RNA提取
分别对采自江苏东台的西瓜、南京的西瓜、洪泽的西葫芦、姜堰的西葫芦、高邮的丝瓜、连云港的南瓜、徐州的南瓜、句容的香瓜、通州的瓠瓜、宿迁的西葫芦、苏州的丝瓜、金坛的甜瓜、东台的黄瓜、泰兴的西瓜、姜堰的南瓜(标记为2-16)，健康西葫芦叶片为阴性对照(标记为1)。样品各取0.1g，在冰浴条件下用液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的2.0mL EP管中，每管加入1mLTrizol Reagent，充分振荡1min，室温静置5min。加入0.2mL氯仿上下颠倒混匀，室温静置3min，4℃，12000×g离心15min。取上层液相加入另一新的1.5mLEP管中，加入0.5mL异丙醇，振荡混匀，-20℃静置30min，4℃，12000×g离心10min，弃上清。用1mL 75％的乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤沉淀两次，每次4℃，7000×g离心5min，弃上清，自然干燥。最后溶于50μL去RNase的DEPC水中，-70℃保存备用。
反转录(RT)反应
以16个样品的RNA为模板，oligodT18引物反转录得到cDNA第一链，反应程序参照M-MLV说明书，15μL反应体系如下：3μL RNA，1μLoligodT18(10μmol/L)，6μL DEPC水，65℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入2.5μL5×RT buffer，0.5μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和0.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，短暂离心后DEPC水补足至15μL，42℃水浴1h，70℃灭活5min，置-20℃待用
多重PCR反应
先用4重PCR确定的反应体系及条件进行PCR，25μL PCR标准反应体系：10.5μL ddH2O，2.5μL10×PCR buffer(Mg2+free)，3μL MgCl2(25mmol/L)，2.5μL dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，4对引物混合物为4μL：WMV和CMV上下游引物各0.6μL，ZYMV和CGMMV上下游引物各0.4μL(各10μmol/L)，0.5μL r-Taq DNA聚合酶(5U/μL)和2μL cDNA模板。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸80s，循环35次；72℃延伸10min。再用2重PCR确定的反应体系及条件进行PCR，25μL PCR标准反应体系：12.5μL ddH2O，2.5μL10×PCR buffer(Mg2+free)，3μL MgCl2(25mmol/L)，2.5μL dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，2对引物混合物为2μL：TMV和PRSV上下游引物各0.5μL(各10μmol/L)，0.5μL r-Taq DNA聚合酶(5U/μL)和2μL cDNA模板。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min。分别取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像***进行观察分析。
结果分析
分别取4重和2重PCR产物5μL经1％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，120V稳压电泳30min，再经凝胶成像***观察记录结果，结果都检测到了较为清晰且特异的条带，扩增条带的大小与待检病毒基因预期条带大小基本一致，其中可见采自江苏各市县葫芦科作物上的病毒复合侵染情况较为普遍，病毒种类以WMV、ZYMV、CMV和CGMMV为主，少数作物受TMV和PRSV侵染。参见说明书附图的图2和图3。
本发明的方法通过具体实施例进行了描述，主要服务于田间葫芦科作物病毒病的早期诊断和监测等工作。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说都是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。上述实施不以任何形式限定本发明。

Claims (4)

1.两步法检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物，其特征在于：第一步在一次PCR反应中同时检测葫芦科作物中4种主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，第二步再在一次PCR反应中同时检测2种次要病毒(TMV和PRSV)，包括如下步骤：
(1)甄别比对Genbank中收录的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列确定相对保守区域，在选定的保守区域内使用Oligo5.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物的特异性，筛选合成适用于两步多重RT-PCR反应的引物6对，所述引物序列如下：
WMV：上游引物(WMVF)5′-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3′
下游引物(WMVR)5′-TGCTGCGTCTGAGAAATG-3′
ZYMV：上游引物(ZYMVF)5′-AGCTCCATCATAGCTGAGCAG-3′
下游引物(ZYMVR)5′-TAGCTTGCGCTTGCAAACGAC-3′
CMV：上游引物(CMVF)5′-CACTATTCCCGACTTTGAGACCC-3′
下游引物(CMVR)5′-CTCATAAGCGGCATACTCTAACAT-3′
CGMMV：上游引物(CGMMVF)5′-CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG-3′
下游引物(CGMMVR)5′-TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT-3′
TMV：上游引物(TMVF)5′-TGGATCCGCCGACCCAATAGAGTTA-3′
下游引物(TMVR)5′-GTCGAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3′
PRSV：上游引物(PRSVF)5′-ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA-3′
下游引物(PRSVR)5′-GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA-3′
(2)提取感染1-6种病毒的葫芦科作物叶片的总RNA，再进行反转录，所述反转录反应体系如下：3μL RNA，1μL oligodT18(10μmol/L)，6μL DEPC水，65℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入2.5μL5×RT buffer，0.5μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和0.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，短暂离心后DEPC水补足至15μL，42℃水浴1h，70℃灭活5min，置-20℃待用；
(3)应用步骤(1)中合成的引物对反转录产物分别进行4重和2重PCR反应；
(4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判断侵染葫芦科作物的病毒种类。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括如下步骤：
(5)结果分析
扩增的靶基因条带割胶回收，再与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，碱裂解法提取质粒并测序，结果与设计病毒扩增基因的大小进行比较，分析所得序列与参考序列的同源率，从而判定多重RT-PCR结果的可靠性。
3.根据权利要求1所述的4重和2重PCR方法，其特征在于，所述PCR反应体系均为25μL，包括2.5μL 10×PCR buffer(Mg2+free)，3μL MgCl2(25mmol/L)，2.5μL dNTP Mixture(各2.5mmol/L)，0.5μL r-Taq DNA聚合酶(5U/μL)，2μL cDNA模板，4重PCR引物混合物为4μL：WMV和CMV上下游引物各0.6μL，ZYMV和CGMMV上下游引物各0.4μL(各10μmol/L)；2重PCR引物混合物为2μL：TMV和PRSV上下游引物各0.5μL(各10μmol/L)，最后用ddH2O补足25μL。
4.根据权利要求1所述的4重和2重PCR方法，其特征在于，所述PCR反应程序：4重PCR为94℃预变性5min；94℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸80s，循环35次；72℃延伸10min；2重PCR为94℃预变性5min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331743A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 新疆农业科学院植物保护研究所 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
CN106048095A (zh) * 2016-08-14 2016-10-26 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 同步检测3种侵染瓜类的rna病毒的引物组、试剂盒及其应用
CN106702029A (zh) * 2017-03-16 2017-05-24 中国农业科学院植物保护研究所 一种同步检测5种西瓜病毒的多重rt‑pcr方法及其应用
CN108034771A (zh) * 2018-02-07 2018-05-15 沈阳农业大学 西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重pcr方法
CN109152346A (zh) * 2016-02-05 2019-01-04 瑞克斯旺种苗集团公司 西瓜中赋予对马铃薯y病毒属抗性的qtl
CN110923365A (zh) * 2019-12-27 2020-03-27 江苏省农业科学院 一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法
CN111455109A (zh) * 2020-04-15 2020-07-28 云南农业大学 一种同步检测zymv、prsv和ztmv的方法
CN116574851A (zh) * 2023-07-04 2023-08-11 广东省农业科学院植物保护研究所 一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒
CN116622917A (zh) * 2023-07-17 2023-08-22 青岛农业大学 一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101691614A (zh) * 2009-10-09 2010-04-07 江苏省农业科学院 一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法
CN102242224A (zh) * 2011-07-15 2011-11-16 中国烟草总公司郑州烟草研究院 三重一步法rt-pcr同时检测烟草上三种病毒的方法
CN103060476A (zh) * 2013-01-25 2013-04-24 张卫东 基于mp基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光pcr检测方法及探针和引物组合
CN103103288A (zh) * 2013-01-05 2013-05-15 江苏省农业科学院 一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101691614A (zh) * 2009-10-09 2010-04-07 江苏省农业科学院 一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法
CN102242224A (zh) * 2011-07-15 2011-11-16 中国烟草总公司郑州烟草研究院 三重一步法rt-pcr同时检测烟草上三种病毒的方法
CN103103288A (zh) * 2013-01-05 2013-05-15 江苏省农业科学院 一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法
CN103060476A (zh) * 2013-01-25 2013-04-24 张卫东 基于mp基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光pcr检测方法及探针和引物组合

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
古勤生 等: ""葫芦科作物病毒名录"", 《中国西瓜甜瓜》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331743A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 新疆农业科学院植物保护研究所 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
CN105331743B (zh) * 2015-11-20 2018-11-13 新疆农业科学院植物保护研究所 一步快速检测甜瓜多种病毒的试剂盒及其快速检测方法
CN109152346A (zh) * 2016-02-05 2019-01-04 瑞克斯旺种苗集团公司 西瓜中赋予对马铃薯y病毒属抗性的qtl
CN109152346B (zh) * 2016-02-05 2022-03-08 瑞克斯旺种苗集团公司 西瓜中赋予对马铃薯y病毒属抗性的qtl
CN106048095A (zh) * 2016-08-14 2016-10-26 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 同步检测3种侵染瓜类的rna病毒的引物组、试剂盒及其应用
CN106702029B (zh) * 2017-03-16 2020-01-17 中国农业科学院植物保护研究所 一种同步检测5种西瓜病毒的多重rt-pcr方法及其应用
CN106702029A (zh) * 2017-03-16 2017-05-24 中国农业科学院植物保护研究所 一种同步检测5种西瓜病毒的多重rt‑pcr方法及其应用
CN108034771A (zh) * 2018-02-07 2018-05-15 沈阳农业大学 西瓜血瓤病和果斑病诊断及病原物检测的多重pcr方法
CN110923365A (zh) * 2019-12-27 2020-03-27 江苏省农业科学院 一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法
CN111455109A (zh) * 2020-04-15 2020-07-28 云南农业大学 一种同步检测zymv、prsv和ztmv的方法
CN111455109B (zh) * 2020-04-15 2022-04-08 云南农业大学 一种同步检测zymv、prsv和ztmv的方法
CN116574851A (zh) * 2023-07-04 2023-08-11 广东省农业科学院植物保护研究所 一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒
CN116574851B (zh) * 2023-07-04 2023-10-31 广东省农业科学院植物保护研究所 一种多重pcr检测六种葫芦病毒的方法及试剂盒
CN116622917A (zh) * 2023-07-17 2023-08-22 青岛农业大学 一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒及应用
CN116622917B (zh) * 2023-07-17 2024-02-02 青岛农业大学 一种用于检测四种蔬菜病毒的rt-pcr试剂盒及应用

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