CN104356205A

CN104356205A - 一种卡非佐米的纯化方法

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Publication number: CN104356205A
Application number: CN201410680367.2A
Authority: CN
Inventors: 李靖; 姚全兴; 喻威; 吴进
Original assignee: Chongqing Taihao Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chongqing Taihao Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2015-02-18

Abstract

本发明提供了一种卡非佐米的纯化方法，包括以下步骤：将卡非佐米粗品的溶液进行硅胶柱层析分离，得到层析液；所述硅胶柱层析分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，所述流动相B包括碳原子数为5～10的烷烃；将所述层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。本发明提供的方法将卡非佐米粗品依次进行硅胶柱层析和重结晶，在柱层析过程中以乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，以及碳原子数为5～10的烷烃为流动相，有利于卡非佐米粗品中杂质与卡非佐米的分离，再进行重结晶，提高了卡非佐米的纯度。而且本发明提供的方法简单、可操作性强，利于大规模工业生产。

Description

一种卡非佐米的纯化方法

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种卡非佐米的纯化方法。

背景技术

卡非佐米(Carfilzomib)，化学名称为(2S)-N-((S)-1-((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基氨基甲酰基)-2-苯乙基)-2–((S)-2-(2-吗啉乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-4-甲基戊酰胺，商品名为Kyprolis，分子式为C₄₀H₅₇N₅O₇，具有式I所示结构：

卡非佐米最早是由Onyx Pharmaceuticals公司生产的卡非佐米注射用冻干粉针剂，于2012年7月20日由美国食品药品监督管理局(FD)批准上市，用于治疗之前接受过至少2种药物，包括硼替佐米和免疫调节剂治疗的多发性骨髓瘤患者。Carfilzomib的获批，为那些经当前疗法治疗后复发的多发性骨髓瘤患者，提供了一种治疗选择。Carfilzomib药物的临床试验中，共有266名患者接受了试验，研究人员表示，患者在接受该药物的治疗之后，其中有23％的患者体内肿瘤状况得到改善。据Onyx制药公司称，与目前的血癌治疗药物相比，Carfilzomib的优势在于可以降低神经损害。Carfilzomib通过选择性的抑制细胞内的一种蛋白复合物发挥作用，从而使癌症细胞更易死亡。Onyx制药公司公布的II期临床研究资料显示，对其他治疗无效果的患者，服用Carfilzomib后有24％至少有一定疗效。

自2012年FDA批准卡非佐米上市以来，对卡非佐米的合成仿制研究便逐步展开。药品是特殊的商品，在药品的研发、仿制、申报和制备过程中对杂质含量、残留溶剂等的控制尤其重要。因此，开发残留溶剂低、杂质含量低且有利于工业化生产的纯化方法，得到符合药用标准的卡非佐米原料药具有重要的意义。但是目前关于卡非佐米的纯化方法的报道仍较少，报道出来的卡非佐米的纯化方法得到的卡非佐米纯品的纯度仍较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卡非佐米的纯化方法，本发明提供的方法得到的卡非佐米纯品具有较高的纯度。

本发明提供了一种卡非佐米的纯化方法，包括以下步骤：

将卡非佐米粗品的溶液进行硅胶柱层析分离，得到层析液；所述硅胶柱层析分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，所述流动相B包括碳原子数为5～10的烷烃；

将所述层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。

优选的，所述流动相B包括正己烷和/或正庚烷。

优选的，所述流动相A与所述流动相B的体积比为(1～10):1。

优选的，所述硅胶柱中填充硅胶的粒度为160目～300目。

优选的，所述硅胶柱中硅胶的装柱量为(5～80)g卡非佐米/kg硅胶。

优选的，所述重结晶具体为：

将所述层析液浓缩，得到卡非佐米固体；

将所述卡非佐米固体溶于第一溶剂中，得到卡非佐米溶液，所述第一溶剂包括丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或几种；

将所述卡非佐米溶液与第二溶剂混合，析晶，得到卡非佐米纯品，所述第二溶剂包括正己烷、正庚烷和甲醇中的一种或几种。

优选的，所述卡非佐米溶液的质量浓度为(0.05～0.1)g/mL。

优选的，所述第一溶剂与第二溶剂的体积比为1:(1～5)。

优选的，所述析晶的温度为0℃～60℃；

所述析晶的时间为0.5h～2h。

本发明提供了一种卡非佐米的纯化方法，包括以下步骤：将卡非佐米粗品的溶液进行硅胶柱层析分离，得到层析液；所述硅胶柱层析分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，所述流动相B包括碳原子数为5～10的烷烃；将所述层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。本发明提供的方法将卡非佐米粗品依次进行硅胶柱层析和重结晶，在柱层析过程中以乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，以及碳原子数为5～10的烷烃为流动相，有利于卡非佐米粗品中杂质与卡非佐米的分离，再进行重结晶，提高了卡非佐米的纯度。而且本发明提供的方法简单、可操作性强，利于大规模工业生产。实验结果表明，本发明制备得到的卡非佐米纯品的纯度大于99.5％，最大单个杂质含量小于0.1％。

附图说明

图1为本发明实施例1得到的卡非佐米纯品的HPLC图谱；

图2为本发明实施例2得到的卡非佐米纯品的HPLC图谱；

图3为本发明实施例3得到的卡非佐米纯品的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种卡非佐米的纯化方法，包括以下步骤：

将所述层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。

本发明提供的方法将卡非佐米粗品依次进行硅胶柱层析和重结晶，在柱层析过程中以乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，以及碳原子数为5～10的烷烃为流动相，有利于卡非佐米粗品中杂质与卡非佐米的分离，再进行重结晶，提高了卡非佐米的纯度。而且本发明提供的方法简单、可操作性强，利于大规模工业生产。

本发明提供的方法将卡非佐米粗品的溶液进行硅胶柱层析分离，得到层析液。本发明对所述卡非佐米粗品的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的卡非佐米即可，如可以为卡非佐米的市售商品，也可为本领域技术人员熟知的卡非佐米的制备方法自行制备得到的未经纯化或纯度较低的卡非佐米粗品。具体的，在本发明的实施例中，所述卡非佐米粗品可以由公开号为CN103641890A的中国专利公开的卡非佐米制备方法制备得到。

在本发明中，所述卡非佐米粗品的溶液中的溶剂优选为上述技术方案所述流动相；所述卡非佐米粗品的溶液的质量浓度优选为0.1g/mL～0.8g/mL，更优选为0.3g/mL～0.5g/mL。

在本发明中，所述硅胶柱层析分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，所述流动相B包括碳原子数为5～10的烷烃。本发明提供的方法以乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，以及碳原子数为5～10的烷烃为流动相，将卡非佐米粗品的溶液进行柱层析，上述流动相利于卡非佐米与其共存的杂质的分离，有利于提高卡非佐米的纯度。在本发明中，所述流动相A优选包括乙酸乙酯；所述流动相B优选包括正己烷和/或正庚烷，最优选为正己烷。在本发明中，所述流动相A与所述流动相B的体积比优选为(1～10):1，更优选为(2～8):1，最优选为(2～5):1。在本发明的实施例中，所述流动相A和流动相B的体积比可具体为2:1、3:1、4:1或5:1。在本发明中，所述流动相的流速优选为5mL/min～25mL/min，更优选为10mL/min～20mL/min。

在本发明中，所述硅胶柱中填充硅胶的粒度优选为160目～300目，更优选为180目～280目，最优选为200目～250目；所述硅胶在硅胶柱中的装柱量优选为(5～80)g卡非佐米/kg硅胶，更优选为(10～50)g卡非佐米/kg硅胶，最优选为(15～35)g卡非佐米/kg硅胶。本发明硅胶柱装柱的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的装柱技术方案即可，如可以为干法装柱或湿法装柱；在本发明中，所述装柱的方法优选为湿法装柱。

本发明在所述硅胶柱层析分离的过程中，优选采用薄层色谱或高效液相色谱(HPLC)跟踪监测层析液的组成，以便收集含有卡非佐米纯品的层析液。本发明对所述薄层色谱和高效液相色谱检测的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的薄层色谱和高效液相色谱检测的技术方案即可。在本发明的实施例中，优选采用HPLC对层析过程进行跟踪监测；所述HPLC检测中的色谱柱优选为Agilent Extend-C18150mm×4.6mm、3.5μm；所述色谱柱的柱温优选为30℃；所述HPLC检测中的进样量优选为10μL；所述HPLC检测中的流速优选为1mL/min；所述HPLC检测中的流动相优选包括溶液A和溶液B，溶液A优选为摩尔浓度为0.02mol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钾缓冲溶液，溶液B优选为乙腈；

所述HPLC检测中的梯度洗脱程序优选为：

在20min内，所述流动相A与所述流动相B的体积比优选为50:50；

在20min～40min内，所述流动相A与所述流动相B的体积比优选为30:70；

在40min～50min内，所述流动相A与所述流动相B的体积比优选为30:70；

所述HPLC检测中的平衡时间优选为5min；在本发明中，当所述跟踪样品为层析液时，所述层析液直接进样进行检测，无需进行浓缩或稀释；所述HPLC检测中的检测波长优选为210nm。

完成所述硅胶柱层析分离后，本发明将得到的层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。在本发明中，所述重结晶优选具体为：

将所述的层析液浓缩，得到卡非佐米固体；

本发明在得到层析液后，优选将所述层析液浓缩，得到卡非佐米固体。本发明对所述浓缩的方法没有特殊的限制，能够除去溶剂得到卡非佐米固体即可。在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩；所述减压浓缩的真空度优选为0.03～0.1，更优选为0.05～0.08；所述减压蒸馏的温度优选为20℃～80℃，更优选为25℃～60℃，最优选为30℃～50℃。在本发明的实施例中，可在室温下进行所述减压蒸馏，在所述减压蒸馏过程中无需加热或降温。

得到所述卡非佐米固体后，本发明优选将所述卡非佐米固体溶于第一溶剂中，得到卡非佐米溶液，所述第一溶剂包括丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或几种。本发明对所述卡非佐米固体在第一溶剂中溶解的方法没有特殊的限制，能够将所述卡非佐米固体溶解即可。本发明优选在搅拌的条件下，将所述卡非佐米固体溶于第一溶剂中；本发明对所述搅拌的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的搅拌的技术方案即可。在本发明的实施例中，可根据第一溶剂的种类不同，选择常温搅拌或加热搅拌，能够将所述卡非佐米固体溶解在所述第一溶剂中即可；本发明对所述加热的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的加热溶解的技术方案即可。在本发明中，所述加热搅拌的温度优选为30℃～60℃，更优选为35℃～55℃，最优选为40℃～50℃；在本发明中，所述卡非佐米固体在所述第一溶剂中的质量浓度优选为(0.05～0.1)g/mL，更优选为(0.06～0.08)g/mL。

得到卡非佐米溶液后，本发明优选将所述卡非佐米溶液与第二溶剂混合，析晶，得到卡非佐米纯品，所述第二溶剂包括正己烷、正庚烷和甲醇中的一种或几种。本发明优选向所述卡非佐米溶液中加入所述第二溶剂，析晶，得到卡非佐米纯品。在本发明中所述第一溶剂与所述第二溶剂的体积比优选为1:(1～5)；在本发明的实施例中，所述第一溶剂与所述第二溶剂的体积比可具体为1:1,、1:2、1:3、1:4或1:5。

在本发明中，当所述第一溶剂包括丙酮时，所述第二溶剂优选包括正己烷和/或正庚烷；当所述第一溶剂包括二氯甲烷时，所述第二溶剂优选包括甲醇和/或正己烷；当所述第一溶剂包括乙酸乙酯时，所述第二溶剂优选包括正己烷。

在本发明中，所述析晶可以为静置析晶，也可以为搅拌析晶，本发明对此没有特殊的限制。在本发明中，所述析晶的温度优选为0℃～60℃，更优选为5℃～50℃，最优选为10℃～30℃；所述析晶的时间优选为0.5h～24h，最优选为1h～12h，最优选为2h～6h。在本发明的实施例中，所述析晶可在常温下进行，在所述析晶的过程中，无需对析晶体系进行加热或降温。

完成所述析晶过程后，本发明优选将析晶后的体系进行过滤，将得到的滤饼干燥，得到卡非佐米纯品。本发明对所述过滤和干燥的技术方案没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的过滤和干燥的技术方案即可。在本发明中，所述过滤优选为抽滤；所述干燥优选为减压干燥；所述加压干燥的真空度优选在0.08以上，更优选为0.08～0.1；所述减压干燥的温度优选为30℃～80℃，更优选为40℃～60℃，最优选为45℃～55℃。

得到卡非佐米纯品后，本发明采用上述技术方案所述HPLC的检测方法对所述卡非佐米纯品的纯度进行检测，在对所述卡非佐米纯品进行检测时，卡非佐米纯品优选采用HPLC检测中的流动相溶解，将得到的卡非佐米HPLC检测样品进行检测，所述卡非佐米HPLC检测样品的质量浓度优选为0.5mg/mL～2mg/mL，更优选为1mg/mL。结果显示，本发明提供的方法得到的卡非佐米纯品的纯度在99.5％以上，最大单个杂质含量小于0.1％，符合药用标准。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的卡非佐米的纯化方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将1g卡非佐米粗品溶于体积比为2:1的乙酸乙酯和正己烷的混合溶液中，将得到的浓度为0.4g/mL的卡非佐米粗品溶液加入到硅胶柱上，硅胶柱中填充硅胶的粒度为200目～250目，湿法装柱控制参数为15g卡非佐米/kg硅胶，用体积比为2:1的乙酸乙酯和正己烷的混合溶液作流动相，进行柱层析分离，流动相的流速为5mL/min，用HPLC跟踪，HPLC检测的参数为：

色谱柱为Agilent Extend-C18150mm×4.6mm、3.5μm；柱温为30℃；进样量为10μL；流速为1mL/min；流动相包括溶液A和溶液B，溶液A为摩尔浓度为0.02mol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钾缓冲溶液，溶液B为乙腈；梯度洗脱程序：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	50	50
20	50	50
			40	30	70
50	30	70

平衡时间为5min；层析液直接进样检测；检测波长为210nm；

收集层析液，在真空度为0.03和温度为30℃的条件下，真空浓缩，得到卡非佐米固体。

将得到的卡非佐米固体在40℃下加热搅拌溶解于10mL丙酮中，再向其中加入50mL正己烷混合均匀，室温下静置析晶2h，抽滤，滤饼减压干燥，得到卡非佐米纯品。

本发明采用HPLC检测得到的卡非佐米纯品的纯度，卡非佐米纯品HPLC检测样品的质量浓度为1mg/mL，检测结果如图1所示，图1为本发明实施例1得到的卡非佐米纯品的HPLC图谱，由图1可以看出，卡非佐米纯品的出峰位置在13.785min，杂质较少，本实施例得到的卡非佐米纯品的纯度≥99.71％，最大单个杂质含量小于0.1％。

实施例2

将1g卡非佐米粗品溶于体积比为4:1的乙酸乙酯和正己烷混合溶液中，将得到的浓度为0.3g/mL的卡非佐米粗品溶液加入到硅胶柱上，硅胶柱中填充硅胶的粒度为200目～300目，湿法装柱控制参数为20g卡非佐米/kg硅胶，用体积比为4:1的用乙酸乙酯和正己烷混合溶液作流动相，进行柱层析分离，柱层析分离中流动相的流速为10mL/min，用HPLC跟踪，HPLC跟踪监测的参数与实施例1中一致；

收集层析液，在真空度为0.1和温度为40℃的条件下，真空浓缩，得到卡非佐米固体。

在室温下，将得到的卡非佐米固体搅拌溶解于18mL丙酮中，再向其中加入20mL正己烷混合均匀，室温下静置析晶4h，抽滤，滤饼减压干燥，得到卡非佐米纯品。

采用实施例1中的HPLC检测参数对得到的卡非佐米纯品进行检测，结果如图2所示，图2为本发明实施例2得到的卡非佐米纯品的HPLC图谱，由图2可以看出，卡非佐米纯品的出峰位置在14.060min，杂质较少，本实施例得到的卡非佐米纯品的纯度≥99.78％，最大单个杂质含量小于0.1％。

实施例3

将1g卡非佐米粗品溶于体积比为5:1的乙酸乙酯和正己烷混合溶液，将得到的浓度为0.5g/mL的卡非佐米粗品溶液加入到硅胶柱上，硅胶柱中填充硅胶的粒度为250目～300目，湿法装柱控制参数为35g卡非佐米/kg硅胶，用体积比为5:1的乙酸乙酯和正己烷混合溶液作流动相，进行柱层析分离，柱层析分离中流动相的流速为25mL/min，用HPLC跟踪，HPLC跟踪监测的参数与实施例1中一致；

收集层析液，在真空度为0.05和温度为50℃的条件下，真空浓缩，得到卡非佐米固体。

在室温条件下，将得到的卡非佐米固体搅拌溶解于15mL丙酮中，再向其中加入45mL正己烷混合均匀，将得到的混合溶液冷却至0℃静置析晶6h，抽滤，滤饼减压干燥，得到卡非佐米纯品。

采用实施例1中的HPLC检测参数对得到的卡非佐米纯品进行检测，结果如图3所示，图3为本发明实施例3得到的卡非佐米纯品的HPLC图谱，由图3可以看出，卡非佐米纯品的出峰位置在14.180min，杂质较少，本实施例得到的卡非佐米纯品的纯度≥99.83％，最大单个杂质含量小于0.1％。

由以上实施例可知，本发明提供了一种卡非佐米的纯化方法，包括以下步骤：将卡非佐米粗品的溶液进行硅胶柱层析分离，得到层析液；所述硅胶柱层析分离的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，所述流动相B包括碳原子数为5～10的烷烃；将所述层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。本发明提供的方法将卡非佐米粗品依次进行硅胶柱层析和重结晶，在柱层析过程中以乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷中的一种或几种，以及碳原子数为5～10的烷烃为流动相，有利于卡非佐米粗品中杂质与卡非佐米的分离，再进行重结晶，提高了卡非佐米的纯度。而且本发明提供的方法简单、可操作性强，利于大规模工业生产。实验结果表明，本发明制备得到的卡非佐米纯品的纯度大于99.5％，最大单个杂质含量小于0.1％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种卡非佐米的纯化方法，包括以下步骤：

将所述层析液进行重结晶，得到卡非佐米纯品。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相B包括正己烷和/或正庚烷。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相A与所述流动相B的体积比为(1～10):1。

4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述硅胶柱中填充硅胶的粒度为160目～300目。

5.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述硅胶柱中硅胶的装柱量为(5～80)g卡非佐米/kg硅胶。

6.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述重结晶具体为：

将所述层析液浓缩，得到卡非佐米固体；

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述卡非佐米溶液的质量浓度为(0.05～0.1)g/mL。

8.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述第一溶剂与第二溶剂的体积比为1:(1～5)。

9.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述析晶的温度为0℃～60℃。

10.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述析晶的时间为0.5h～2h。