CN104351255A - 变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用 - Google Patents

变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104351255A
CN104351255A CN201410627779.XA CN201410627779A CN104351255A CN 104351255 A CN104351255 A CN 104351255A CN 201410627779 A CN201410627779 A CN 201410627779A CN 104351255 A CN104351255 A CN 104351255A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem
strain
noble dendrobium
klebsiella
klebsiella variicola
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410627779.XA
Other languages
English (en)
Inventor
赵明富
文国松
徐绍忠
李梦娇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Agricultural University
Original Assignee
Yunnan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Agricultural University filed Critical Yunnan Agricultural University
Priority to CN201410627779.XA priority Critical patent/CN104351255A/zh
Publication of CN104351255A publication Critical patent/CN104351255A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用，属中药材技术领域。本发明的生产菌株变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1，已于2013年8月8日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2013367。本发明的变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株，用利福平标记方法确定能在石斛上定殖，能够作为制备用于促进石斛生长的制剂中的应用。本发明的优点在于具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点；对石斛有显著促生长效果。

Description

变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用
技术领域：
本发明涉及变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用，属中药材技术领域。 
背景技术：
石斛为兰科石斛属植物，是一种名贵中草药，有一定解热镇痛作用，能促进胃液分泌，助消化。有增强新陈代谢、抗衰老等作用。属于多年生附生草本，高30～50厘米。茎丛生，多节，节间长2.5～3.5厘米。野生石斛多附生于高山岩石或森林中的树干上。喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。分布四川、贵州、云南、湖北、广西、台湾等地有栽培。全年均可采挖，但以秋后采挖者质量好。采回后如保存鲜用时，在春、秋季则应及时栽培于细砂石中，放置阴湿处，经常浇水使根部保持湿润。在冬天应平放于竹筐内，上盖蒲包，但应注意空气流通。 
关于栽培技术。由于石斛主要栽培于温室或大棚，其温度和湿度相对而言较易控制，所以用无性繁殖或试管苗快速繁殖技术已经很成熟，在选附主、繁殖、田间管理、防治病虫等方面的配套措施也很完善。然而在相同肥水管理条件下，通过使用微生物菌剂促进石斛生长健壮、根系发达、萌蘖多，对石斛安全生产及可持续性发展具有极大的应用前景，是有前途的方法。本发明涉及施用微生物菌剂促进石斛生长的应用。 
发明内容：
本发明的在于提供一种变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的 
应用。 
本发明的生产菌株变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1，已于2013年8月8日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2013367。保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心。 
本发明的变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株，用利福平标 记方法确定能在石斛上定殖，能够作为制备用于促进石斛生长的制剂中的应用。 
本发明的优点在于：具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点；对石斛有显著促生长效果。 
具体实施方式：
一、菌株的获得 
本发明菌株的获得方法为常规方法，具体如下： 
新鲜铁皮石斛茎秆采自德宏，灭菌水洗净晾干后切成小段(1cm)，用70％乙醇表面消毒5min，然后灭菌水漂洗3次，采用无菌操作技术纵向剖开茎秆，将剖开的茎秆置于马铃薯葡萄糖液体培养基中30℃培养7天，取培养所得的菌液1mL，加到盛有9mL无菌水的试管中，30℃摇床振荡培养20min，制成样品悬浮液。取1mL悬浮液加入盛有9mL无菌水的试管中进行10倍系列稀释，选择10-5-10-7的稀释液分别取0.1mL，在PDA平板上采用稀释涂布法分离纯化，30℃培养12-24h，挑取菌落形态不同的单菌落于PDA培养基平板上培养并保存备用。 
筛选：将病原接种在PDA培养基平板中心，用已分离纯化出的细菌做成菌悬液，取100uL菌悬液置于中心四周，28℃培养观察对峙培养抑菌情况。将抑制效果明显的细菌进行形态、生理生化鉴定和16S rDNA分析。 
形态鉴定：LB固体培养基上纯化培养细菌，观察菌落形态、菌体形态。 
生理生化鉴定：参照常用细菌鉴定手册，采用吲哚试验、V-P试验、H2S试验等对分离出的细菌进行生理生化检测。 
16 S rDNA序列测定：采用CTAB/NaCl法提取SH-1基因组DNA。用于扩增的引物为16S rDNA扩增通用引物，27F：5′-AGAGTTTTATCNTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增所得PCR产物有上海生工测序，测得的序列与Genbank中已有的16S rDNA序列进行同源性比对。 
表1.SH-1菌株鉴定的形态及生理生化特征 
通过提取SH-1菌株基因组DNA，16S rRNA基因扩增及测序分析，SH-1的DNA序列与Klebsiella variicola strain ALK036(KC456523.1)、Klebsiella variicola strain ALK032(KC456522.1)、Klebsiella variicola strain h-8(KC139428.1)16S rRNA基因具有的99％同源性，结合生理生化试验，我们将该菌株鉴定为Klebsiella variicola SH-1。 
二、生防菌剂的制备 
生防菌剂的获得方法为常规方法，具体如下： 
1、将SH-1菌株接种到LB培养液中30℃培养200rpm振荡培养，12小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零； 
2、当培养至OD值在0.65～0.75之间时，将种子菌液以1：100体积比加入LB培养液中，30℃250rpm振荡培养24小时。然后6000rpm离心10min，每1000mL培养液获得约15g菌体，每克菌体含4×1013～1015个菌。取菌体与保藏液按1g：40ml配成菌剂。菌体保藏液为0.5％吐温-80生理盐水。 
上述生防菌剂用于促进石斛生长试验。 
三、实施方法 
(1)变栖克雷伯菌SH-1在盆栽石斛中的定殖测定 
选取长势一致的石斛组培苗移栽到到灭菌基质中，每盆4株，放在温室中培养，4～6叶期时供试验用。 
变栖克雷伯菌采用常规抗利福平标记法，经过继代培养，直至筛选出在含有0.30mg·mL-1的利福平平板上能稳定生长、菌落形态及对病原菌的防治效果和拮抗作用等保持不变的突变菌株。将标记菌株接种于装有含0.30mg.mL-1利福平的30mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中(250mL)，28℃、150r·min-1振荡培养48h。发酵液8000r·min-1离心10min，去掉上清液，用无菌蒸馏水离心洗涤3次，最后用灭菌蒸馏水稀释成108cfu·mL-1的菌悬液，选取长势一致4～6叶期的盆栽苗，用伤根法接入内生细菌，每盆接种量50mL。每处理12盆。分别于接种1、3、5、7、9、11、15、20、25、30、35和40d取出石斛苗，用剪刀将其分为根、茎和叶3部分，分别称重后，用75％乙醇处理1min，无菌水洗5次，1％NaC1O处理5min，无菌蒸馏水洗涤5次，取最后1次冲洗的0.20mL无菌水涂牛肉膏蛋白胨平板，若没有长出细菌，就证明消毒彻底。将清水洗净的根、茎和叶分别置于无菌的组织匀浆器中捣碎，再用无菌蒸馏水梯度稀释，每处理设3个重复。取10-1、10-2、10-3和10-4稀释梯度分别涂布于含0.30mg·mL-1利福平的牛肉膏蛋白胨平板，每梯度3个重复，于28℃培养72h后分别计数单菌落，统计其分布部位及数量。 
(2)变栖克雷伯的促生作用 
将变栖克雷伯菌用上述方法培养，制备的菌剂悬液用伤根法接入4～6叶期石斛苗，在接种150d后采样测定株高、鲜重、茎粗和分枝数等指标。茎长用米尺测量；植株茎中部附近最粗部位为茎粗(直径)，用游标卡尺测量直径后换算为茎围。每处理8株苗，3次重复，设清水及不含菌的液体培养基浇苗作对照。(3)数据统计与分析 
采用SPSS数据处理***进行统计分析。 
试验结果： 
(1)变栖克雷伯菌在盆栽石斛苗的定殖 
变栖克雷伯菌株在石斛中稳定定殖，定殖状态呈现“先增后减”的消长趋势，接种后35天定殖量处于相对稳定状态，根部为4.3×104cfu/g，茎部为为2.3×104cfu/g，叶中为1.6×104cfu/g。 
(2)SH-1菌株对石斛生长显示较好的促进效果。 
将变栖克雷伯菌用常规方法培养，制备的菌悬液用伤根法接入4～6叶期石斛苗，在接种80d后采样测定株高、鲜重、茎粗和分枝数等等指标，结果见下表。从表中看出施用变栖克雷伯菌剂后的处理茎长、鲜重、茎围、根和分枝数的指标均与两种对照差异极显显，表明通过使用微生物菌剂促进石斛生长健壮、根系发达、萌蘖多，对石斛具有显著的促进生长的作用。 
表1.施用菌剂后不同处理石斛生物学性状调查 
SEQUENCE LISTING
 
<110>  云南农业大学
 
<120>  变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）SH-1菌株的应用
 
<130>  PatentIn version 3.5
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  1441
<212>  DNA
<213>  Klebsiella variicola
 
 
<220>
<221>  rRNA
<222>  (1)..(1441)
<223>  16S rRNA gene
 
<400>  1
ttgcggcggc ctaccatgca gtcgagcggt agcacagaga gcttgctctc gggtgacgag       60
 
cggcggacgg gtgagtaatg tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa      120
 
cggtagctaa taccgcataa cgtcgcaaga ccaaagtggg ggaccttcgg gcctcatgcc      180
 
atcagatgtg cccagatggg attagctggt aggtggggta acggctcacc taggcgacga      240
 
tccctagctg gtctgagagg atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc      300
 
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg      360
 
cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa gcactttcag cggggaggaa ggcggtgagg      420
 
ttaataacct catcgattga cgttacccgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc      480
 
agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc      540
 
aggcggtctg tcaagtcgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcgaaa      600
 
ctggcaggct agagtcttgt agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta      660
 
gagatctgga ggaataccgg tggcgaaggc ggccccctgg acaaagactg acgctcaggt      720
 
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt      780
 
cgatttggag gttgtgccct tgaggcgtgg cttccggagc taacgcgtta aatcgaccgc      840
 
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg      900
 
tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctggtctt gacatccaca      960
 
gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaactgtga gacaggtgct gcatggctgt     1020
 
cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt     1080
 
tgttgccagc ggtcaggccg ggaactcaaa ggagactgcc agtgataaac tggaggaagg     1140
 
tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg     1200
 
catatacaaa gagaagcgac ctcgcgagag caagcggacc tcataaagta tgtcgtagtc     1260
 
cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga     1320
 
atgctacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg     1380
 
gttgcaaaag aagtaggtag cttaaccttc gggagggcgc taccactttt attattggtc     1440
 
g                                                                     1441

Claims (1)

1.变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株在制备石斛生长制剂中的应用。
CN201410627779.XA 2014-11-10 2014-11-10 变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用 Pending CN104351255A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410627779.XA CN104351255A (zh) 2014-11-10 2014-11-10 变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410627779.XA CN104351255A (zh) 2014-11-10 2014-11-10 变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104351255A true CN104351255A (zh) 2015-02-18

Family

ID=52518648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410627779.XA Pending CN104351255A (zh) 2014-11-10 2014-11-10 变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104351255A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117004540A (zh) * 2023-09-28 2023-11-07 北京量维生物科技研究院有限公司 变栖克雷伯氏固氮菌的筛选及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102690767A (zh) * 2012-05-31 2012-09-26 黑龙江省科学院微生物研究所 一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌
CN102965296A (zh) * 2012-02-10 2013-03-13 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所 一株对草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其应用
CN103484399A (zh) * 2013-08-29 2014-01-01 云南省烟草公司曲靖市公司 一株植物内生细菌sh-1及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102965296A (zh) * 2012-02-10 2013-03-13 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所 一株对草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其应用
CN102690767A (zh) * 2012-05-31 2012-09-26 黑龙江省科学院微生物研究所 一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌
CN103484399A (zh) * 2013-08-29 2014-01-01 云南省烟草公司曲靖市公司 一株植物内生细菌sh-1及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
魏春燕等: "接种变栖克雷伯氏菌DX120E对不同甘蔗品种的促生效应", 《应用生态学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117004540A (zh) * 2023-09-28 2023-11-07 北京量维生物科技研究院有限公司 变栖克雷伯氏固氮菌的筛选及其应用
CN117004540B (zh) * 2023-09-28 2023-12-15 北京量维生物科技研究院有限公司 变栖克雷伯氏固氮菌的筛选及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kalia et al. Biotechnological interventions in sea buckthorn (Hippophae L.): current status and future prospects
Ralphs et al. Transmission of the locoweed endophyte to the next generation of plants
CN107858304B (zh) 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其液体制剂和应用
Calvo-Alvarado et al. Early growth performance of native and introduced fast growing tree species in wet to sub-humid climates of the Southern region of Costa Rica
CN110669691B (zh) 一种防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌及其应用
Steiner et al. Can co-inoculation of Rhizobium tropici and Azospirillum brasilense increase common bean nodulation and grain yield?
CN108841748B (zh) 中华根瘤固氮菌株系h6及其应用
CN106472568B (zh) 五种根际促生菌在改善植物的农艺性状方面的应用
Rhie et al. Seed dormancy and germination of Epimedium koreanum Nakai
CN107475133B (zh) 一种淡紫紫孢菌及其在促进白芨生长中的应用
CN109105262A (zh) 一种野生金果榄组培快繁方法
CN104351255A (zh) 变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)SH-1菌株的应用
CN103484399B (zh) 一株植物内生细菌sh-1及其应用
CN103270860B (zh) 一种铁皮石斛的种植方法
CN107217016B (zh) 一株具有抑制水稻纹枯病的内生芽孢杆菌菌株zy122及其应用
CN101810148A (zh) 牙鲆优良品种的杂交育种方法
CN103881928A (zh) 一种被孢霉属菌根真菌在铁皮石斛组培苗培养中的应用
Sridhar et al. New disease and first report of marasmioid fungus, Marasmius palmivorus (Sharples), causing white root rot in Arachis hypogaea L.
CN105002111A (zh) 一种防治黄瓜霜霉病的菌株tdjn1及其应用
Tlili et al. Phylogenetic placement, floral anatomy, and morphological characterization of the North African pastoral halophyte Atriplex mollis Desf.(Amaranthaceae)
CN107236689B (zh) 一株荧光假单胞菌pf27及其在植物促生中的应用
CN103865825B (zh) 防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、菌剂及其应用
CN105075698A (zh) 一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法
Glatzle et al. Symbiotic incompatibility between two forage species of Hedysarum, grown in Morocco, and their homologous rhizobia
CN104560797A (zh) 分离获得的放线菌属细菌wzw03菌株及其在缓解西瓜连作障碍方面的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150218

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication