CN104342432A - 一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解决上述技术问题的利用基因敲除技术把赤霉素真菌的ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因敲除,导致这种酶无法在赤霉素真菌内表达,从而避免ent-贝壳杉烯酸转换成赤霉素A12（GA12），进而把积累的ent-贝壳杉烯酸转换成甜菊醇的方法。本发明的应用和实施使其其显著的技术效果主要体现在：真菌发酵生产赤霉素已是成熟稳定的工艺,其菌株是赤霉素高产量的生产菌株，本发明思路新颖，巧妙地利用了已经成熟的赤霉素生产通路，以获得自然界产量极少的两种萜类化合物：甜菊醇及ent-贝壳杉烯酸，产量远高于国外同行报道，具有很高的应用价值。

Description

一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种赤霉素前体四环性双萜ent-贝壳杉烯酸的制备方法、及由ent-贝壳杉烯酸制备得到甜菊醇的方法，具体是涉及一种由基因工程改造的贝壳杉烯酸氧化酶参与的双萜ent-贝壳杉烯酸的制备方法、及由ent-贝壳杉烯酸制备得到甜菊醇的方法。

背景技术

甜菊糖甙、俗称甜菊糖、甜菊糖苷，是菊科草本植物甜叶菊提取物，其作为一种高甜度、低热值的非发酵性的天然甜味剂已在亚洲、北美、南美洲和欧盟各国广泛应用于食品、饮料、调味料的生产中。甜菊糖甙的甜度为蔗糖的200～300倍，而热量只有蔗糖的 l/300，可作为植物无热量的代糖品。

甜菊糖甙以二萜类化合物甜菊醇(Steviol)为糖苷非糖配基，根据13位上的羟基和19位上的羧基上以O-糖苷键相连的糖基种类及数最不同，已有至少8种糖苷被发现，其中以莱宝迪甙（Rebaudioside A）为主。早期甜菊糖甙的生产方法主要是直接从甜叶菊植物中提取得到甜菊糖甙, 而由该方法得到的甜菊糖甙产物经常会由于提取步骤工艺过程中的杂质引入而带有不良味道，其作为食物添加剂的安全性受到影响，且单纯由植物得到的方法严重限制于耕作条件影响的甜叶菊产量，因此，解决上述问题的甜菊糖甙及其前提甜菊醇的合成成为研究热点。

而赤霉素，一类化学结构属于二萜类酸的植物激素，已有研究表明甜菊糖甙生物合成过程与赤霉素生物合成密切相关。赤霉素主要是依靠赤霉菌(Gibberella fujikuroi)发酵工艺制得, 该工艺成熟、完善的工艺, 已有30年到40年的使用历史，其过程中的重要中间体贝壳杉烯酸同时也是甜菊糖甙的前体物质，如下述路线所示：

 发明内容

本发明人经过研究发现，既然真菌发酵生产赤霉素已是成熟稳定的工艺, 其菌株是赤霉素高产量的生产菌株，只需要利用基因工程修改现有用于生产赤霉素真菌的菌株,把赤霉菌拥有的ent-贝壳杉烯酸氧化酶(SEQ ID NO：1)功能彻底删除后，就会使ent-贝壳杉烯酸积累。然后再将甜叶菊的贝壳杉烯酸羟化酶（SEQ ID NO： 2）的功能***没有ent-贝壳杉烯酸氧化酶的功能的赤霉素菌株内，ent-贝壳杉烯酸氧化酶会将多余积累的ent-贝壳杉烯酸转换成甜菊醇，用于进一步制得甜菊糖甙，但如何解决异源性基因高效表达的问题，是解决问题的关键。

根据上述研究结果，本发明的目的是提供一种解决上述技术问题的利用基因敲除技术把赤霉素真菌的ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因敲除, 导致这种酶无法在赤霉素真菌内表达, 从而避免ent-贝壳杉烯酸转换成赤霉素A12（GA12），进而把积累的ent-贝壳杉烯酸转换成甜菊醇的方法。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，该方法包括：载体构建中包含ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因的敲除或/和优化后的ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因的***，所述的萜类化合物是ent-贝壳杉烯酸、甜菊醇、莱鲍迪甙A，莱鲍迪甙B，莱鲍迪甙C，莱鲍迪甙D，莱鲍迪甙E，莱鲍迪甙F或莱鲍迪甙M。其中，ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因的敲除是为了实现 ent-贝壳杉烯酸的积累，ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因的***是为了形成最终的目标萜类。

进一步地，优化后的ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述的利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其工程菌为大肠杆菌、酵母细胞、海藻细胞、植物细胞、革兰氏阳性菌或真菌中的任意一种。

进一步地，所述的酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomyces)细胞或亚罗酵母(Yarrowia)细胞。

进一步地，所述的革兰氏阳性菌为芽孢杆菌(Bacillus)细胞。

进一步地，所述的真菌为镰刀菌(Fusarium konzum), 甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari), 藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi), （木薯痂圆孢菌）Sphaceloma manihoticola, 暗球腔菌(Phaeosphaeria sp）。

一种基于基因工程改造酶制备ent-贝壳杉烯酸的方法，包括如下步骤：

（1）ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因敲除载体的构建

以藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）基因组DNA为模板，分别扩增左右同源臂，以pCambia1302为模板扩增潮霉素基因表达框，然后以同源重组的方法将3个片段连接至pAN7-1骨架中，测序验证后，获得正确的敲除载体；

（2）基因工程菌的获得 

将藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）接种到PDA固体培养上，27℃培养8天后，从新鲜斜面上取大小约0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液体培养基中，24℃，130r/min培养24小时后按1%的接种量(v/v)转种到上述新鲜液体培养基中继续培养15小时.菌丝用无菌水、1M的MgSO₄各洗涤一遍；取大约1g湿菌丝于10ml溶壁酶液中，37℃温育4小时，所述溶壁酶液配置方法为：10ml的1M MgSO₄中加入200mg溶壁酶，过滤除菌；悬浮液用3000rpm离心10min，弃去含菌丝体碎片的沉淀，上清用无菌水缓缓稀释至MgSO₄浓度为0.5M，3000rpm离心15min，沉淀原生质体用0.5M MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗涤一遍，最后原生质体悬浮于1M山梨醇溶液中，适当稀释后涂布于MYG固体再生培养基上，26℃培养2-3天，观察再生情况；

将原生质体的浓度调为6x10⁷个/ml，取0.4ml原生质体，加入10ug或20ug线性化的质粒DNA，混合后冰浴20min，加入100ul PEG8000溶液，混匀后冰浴20min.再加入2mlPEG 8000溶液，混匀后室温5min以上；用4ml山梨醇溶液稀释，3000rpm离心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液悬浮；取0.2ml 原生质体涂布于15ml的再生培养基上，26℃培养12小时后，覆盖10ml含潮霉素的软琼脂MYG，26℃继续培养6－7天后观察结果；

（3）转化子的检出

在对照没有生长的前提下，统计转化平板上的抗性菌落数；计算转化率；将转化子接种到含抗生素的平板上测定其抗性水平；分别用PCR扩增测序法及Soutern Blot的方法进行验证转化子；将阳性菌落转接到含抗生素的PDA培养基上，重复继代筛选6次，保存菌株；

（4）发酵产物的测定

所得赤霉工程菌在PDA培养基上培养7天后，接入种子培养基50ml中，在30℃、300rpm摇床培养48小时，然后以10％的接种量转入发酵培养基，250ml三角瓶装30ml发酵培养基，在30℃、300rpm发酵8天；发酵液经单层滤纸过滤后将滤液pH调至2.0，滤液经0.45um滤膜过滤，所得样品进行HPLC色谱分析。

一种由上述ent-贝壳杉烯酸制得甜菊醇的方法，包括如下步骤：

（1）ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因***载体的构建

将来自甜叶菊(Stevia Rebaudiana Bertoni)编码的ent-贝壳杉烯酸羟化酶（KAH，kaurenoic acid-13hydroxylase）的多核苷酸 (Genbank Accession Number: EU722415，SEQ ID NO：3)进行密码子优化后通过全基因合成的方式获得，以用于在藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）中表达；将优化后的编码ent-贝壳杉烯酸羟化酶的多核苷酸(SEQ ID NO：4)克隆到改进后的这pAN7-1表达载体中gpdA启动子的控制下，得到可以表达ent-贝壳杉烯酸羟化酶的质粒；所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F4:  5'  CTTTTCTCTTTCTTTTCCCAATGGAGGCTTCTTACCTCTACATCT  3'

R4:  5'  TCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTATTAGAGCTCAGAGAGGAGGTTG  3'

以Gibberella fujikuroi基因组DNA为模板，分别扩增左右同源臂；以pCambia1302为模板扩增潮霉素基因表达框，然后以同源重组的方法将4个片段连接至pAN7-1骨架中，测序验证后，获得正确的***载体；

（2）基因工程菌的获得 

将藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）接种到PDA固体培养上，27℃培养8天后，从新鲜斜面上取大小约0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液体培养基中，24℃，130rpm培养24小时后按1%的接种量(v/v)转种到上述新鲜液体培养基中继续培养15小时。菌丝用无菌水、1M的MgSO₄各洗涤一遍。取大约1g湿菌丝于10ml溶壁酶液中，37℃温育4小时，所述溶壁酶液配置方法为：10ml的1M MgSO₄中加入200mg溶壁酶，过滤除菌；悬浮液用3000rpm离心10min，弃去含菌丝体碎片的沉淀，上清用无菌水缓缓稀释至MgSO₄浓度为0.5 M，3000rpm离心15min，沉淀（原生质体）用0.5M MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗涤一遍，最后原生质体悬浮于1M山梨醇溶液中，适当稀释后涂布于MYG固体再生培养基上，26℃培养2-3天，观察再生情况；

将原生质体的浓度调为6x10⁷个/ml，取0.4ml原生质体，加入10ug或20ug线性化的质粒DNA，混合后冰浴20min.加入100ul PEG8000溶液，混匀后冰浴20min.再加入2ml PEG 8000溶液，混匀后室温5min以上；用4ml山梨醇溶液稀释，3000rpm离心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液悬浮；取0.2ml 原生质体涂布于15ml的再生培养基上，26℃培养12小时后，覆盖10ml含潮霉素的软琼脂MYG；26℃继续培养6－7天后观察结果；

（3）转化子的检出

在对照没有生长的前提下，统计转化平板上的抗性菌落数；计算转化率；将转化子接种到含抗生素的平板上测定其抗性水平；分别用PCR扩增测序法及Soutern Blot的方法进行验证转化子；将阳性菌落转接到含抗生素的PDA培养基上，重复继代筛选6次，保存菌株；

（4）发酵产物的测定

所得赤霉工程菌在PDA培养基上培养7天后，接入种子培养基50ml中，在30℃、300rpm摇床培养48小时，然后以10％的接种量转入发酵培养基，250ml三角瓶装30ml发酵培养基，在30℃、300rpm发酵8天；发酵液经单层滤纸过滤后将滤液pH调至2.0，滤液经0.45um滤膜过滤，所得样品进行HPLC色谱分析。

本发明的应用和实施使其其显著的技术效果主要体现在：真菌发酵生产赤霉素已是成熟稳定的工艺, 其菌株是赤霉素高产量的生产菌株，本发明思路新颖，巧妙地利用了已经成熟的赤霉素生产通路，以获得自然界产量极少的两种萜类化合物：甜菊醇及ent-贝壳杉烯酸，产量远高于国外同行报道，具有很高的应用价值。

具体实施方式

实施例1.ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因敲除载体的构建

以藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）基因组DNA为模板，以下列引物分别扩增左右同源臂， F1: 5'  TGATGAGACTTGTGTCTGAGAGCTT  3'

R1: 5'  AAAGGTGAAGTCCCTCTTGGC  3'

F2: 5'  AGCACAGCTCGTGAGTGCCAC  3'

R2: 5'  GAATATTTGGAGAAATGGATGGGC  3'

用下列引物以pCambia1302为模板扩增潮霉素基因表达框，然后以同源重组的方法将3个片段连接至pAN7-1骨架中，测序验证后，获得正确的敲除载体。

F3: 5'  ATGGTGGAGCACGACACTCTC  3'

R3: 5'  TAATTCGGGGGATCTGGATTT  3' 

实施例2. ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因***载体的构建

来自甜叶菊(Stevia Rebaudiana Bertoni)编码的ent-贝壳杉烯酸羟化酶（KAH，kaurenoic acid-13hydroxylase）的多核苷酸 (Genbank Accession Number: EU722415，SEQ ID NO：3) 为源自于植物的DNA序列，与藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）的密码子偏好性有较大的差异。为实现该基因在藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）中的高表达，我们针对已经公布的源自藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）的表达框序列进行统计，得到了适用于藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）的高频率密码子表，并据此对编码ent-贝壳杉烯酸羟化酶的多核苷酸进行优化，最后通过全基因合成的方式获得，以用于在藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)中表达。将优化后的编码ent-贝壳杉烯酸羟化酶的多核苷酸(SEQ ID NO：4)克隆到pAN7-1表达载体中gpdA启动子的控制下，得到可以表达ent-贝壳杉烯酸羟化酶的质粒。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F4:  5'  CTTTTCTCTTTCTTTTCCCAATGGAGGCTTCTTACCTCTACATCT  3'

R4:  5'  TCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTATTAGAGCTCAGAGAGGAGGTTG  3'

以藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）基因组DNA为模板，以下列引物分别扩增左右同源臂，F1: 5'  TGATGAGACTTGTGTCTGAGAGCTT  3'

R1: 5'  AAAGGTGAAGTCCCTCTTGGC  3'

F2: 5'  AGCACAGCTCGTGAGTGCCAC  3'

R2: 5'  GAATATTTGGAGAAATGGATGGGC  3'

以下列引物从pCambia1302中扩增潮霉素基因表达框，然后以同源重组的方法将4个片段连接至pAN7-1骨架中，测序验证后，获得正确的***载体。

F3: 5'  ATGGTGGAGCACGACACTCTC  3'

R3: 5'  TAATTCGGGGGATCTGGATTT  3'

实施例3. 原生质体制备与再生

将藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）接种到PDA固体培养上，27℃培养8天后，从新鲜斜面上取大小约0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液体培养基中，24℃，130r/min培养24小时后按1%的接种量(v/v)转种到新鲜液体培养基中继续培养15小时.菌丝用无菌水、1M的MgSO₄各洗涤一遍。取大约1g湿菌丝于10ml溶壁酶液(10ml的1M MgSO₄中加入200mg溶壁酶，过滤除菌)中，37℃温育4小时。悬浮液用3000rpm离心10min，弃去含菌丝体碎片的沉淀，上清用无菌水缓缓稀释至MgSO₄浓度为0.5 M，3000rpm离心15min，沉淀（原生质体）用0.5M MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗涤一遍，最后原生质体悬浮于1M山梨醇溶液中，适当稀释后涂布于MYG固体再生培养基上，26℃培养2-3天，观察再生情况。

实施例4. DNA操作与真菌转化

将原生质体的浓度调为6x10⁷个/ml，取0.4ml原生质体，加入10ug或20ug实施例1或实施例2所制备的质粒载体DNA，混合后冰浴20min.加入100ul PEG8000溶液，混匀后冰浴20min.再加入2ml PEG 8000溶液，混匀后室温5min以上。用4ml山梨醇溶液稀释，3000rpm离心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液悬浮。取0.2ml 原生质体涂布于15ml的再生培养基上，26℃培养12小时后，覆盖10ml含潮霉素的软琼脂MYG。26℃继续培养6－7天后观察结果。

实施例5.转化子的检出

在对照没有生长的前提下，统计转化平板上的抗性菌落数。计算转化率。将转化子接种到含抗生素的平板上测定其抗性水平。分别用PCR扩增测序法及Soutern Blot的方法进行验证转化子。将阳性菌落转接到含抗生素的PDA培养基上，重复继代筛选6次，保存菌株。最终得到3株KO敲除突变体分别命名为K1,K2,K3；得到5株KAH***突变体，分别命名为I1,I2,I3,I4,I5。

实施例6.发酵产物的测定

将实施5所得赤霉工程菌K1及I1分别在PDA培养基上培养7天后，接入种子培养基50ml中，在30℃、300rpm摇床培养48小时，然后以10％的接种量转入发酵培养基，250ml三角瓶装30ml发酵培养基，在30℃、300rpm发酵8天。发酵液经单层滤纸过滤后将滤液pH调至2.0，滤液经0.45um滤膜过滤，所得样品进行HPLC色谱分析。

用反相高效液相色谱仪分析赤霉素GA3产量。流动相组成为：30%甲醇，0.01M磷酸，用氢氧化钾调节pH至3.检测波长206nm，流速1ml/min.用Sigma公司的赤霉素GA3作为标准品，标准样品溶于流动相，浓度为0.1, 0,5, 0,75, 1mg/ml。根据标准物色谱峰的保留时间定性。作峰面积－赤霉素浓度的标准曲线，根据标准曲线对样品中赤霉素进行定量。结果显示敲除突变体N1及***突变体I1均没有检测到GA3的产生。30ml敲除突变体N1发酵液中共得到165mg ent-贝壳杉烯酸，30ml***突变体I1发酵液中共得到97.5mg甜菊醇。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京诺云生物科技有限公司

 

<120>  一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法

 

<130>  2013

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  526

<212>  PRT

<213>  藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)

 

<400>  1

 

Met Ala Asn His Ser Ser Ser Tyr Tyr His Glu Phe Tyr Lys Asp His

1               5                   10                  15     

 

 

Ser His Thr Val Leu Thr Leu Met Ser Glu Lys Pro Val Ile Leu Pro

            20                  25                  30         

 

 

Ser Leu Ile Leu Gly Thr Cys Ala Val Leu Leu Cys Ile Gln Trp Leu

        35                  40                  45             

 

 

Lys Pro Gln Pro Leu Ile Met Val Asn Gly Arg Lys Phe Gly Glu Leu

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Asn Val Arg Ala Lys Arg Asp Phe Thr Phe Gly Ala Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80 

 

 

Leu Glu Lys Gly Leu Lys Met Ser Pro Asp Lys Pro Phe Arg Ile Met

                85                  90                  95     

 

 

Gly Asp Val Gly Glu Leu His Ile Leu Pro Pro Lys Tyr Ala Tyr Glu

            100                 105                 110        

 

 

Val Arg Asn Asn Glu Lys Leu Ser Phe Thr Met Ala Ala Phe Lys Trp

        115                 120                 125            

 

 

Phe Tyr Ala His Leu Pro Gly Phe Glu Gly Phe Arg Glu Gly Thr Asn

    130                 135                 140                

 

 

Glu Ser His Ile Met Lys Leu Val Ala Arg His Gln Leu Thr His Gln

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Thr Leu Val Thr Gly Ala Val Ser Glu Glu Cys Ala Leu Val Leu

                165                 170                 175    

 

 

Lys Asp Val Tyr Thr Asp Ser Pro Glu Trp His Asp Ile Thr Ala Lys

            180                 185                 190        

 

 

Asp Ala Asn Met Lys Leu Met Ala Arg Ile Thr Ser Arg Val Phe Leu

        195                 200                 205             

 

 

Gly Lys Glu Met Cys Arg Asn Pro Gln Trp Leu Arg Ile Thr Ser Thr

    210                 215                 220                

 

 

Tyr Ala Val Ile Ala Phe Arg Ala Val Glu Glu Leu Arg Leu Trp Pro

225                 230                 235                 240

 

 

Ser Trp Leu Arg Pro Val Val Gln Trp Phe Met Pro His Cys Thr Gln

                245                 250                 255    

 

 

Ser Arg Ala Leu Val Gln Glu Ala Arg Asp Leu Ile Asn Pro Leu Leu

            260                 265                 270        

 

 

Glu Arg Arg Arg Glu Glu Lys Ala Glu Ala Glu Arg Thr Gly Glu Lys

        275                 280                 285            

 

 

Val Thr Tyr Asn Asp Ala Val Glu Trp Leu Asp Asp Leu Ala Arg Glu

    290                 295                 300                

 

 

Lys Gly Val Gly Tyr Asp Pro Ala Cys Ala Gln Leu Ser Leu Ser Val

305                 310                 315                 320

 

 

Ala Ala Leu His Ser Thr Thr Asp Phe Phe Thr Gln Val Met Phe Asp

                325                 330                 335    

 

 

Ile Ala Gln Asn Pro Glu Leu Ile Glu Pro Leu Arg Glu Glu Ile Ile

            340                 345                 350        

 

 

Ala Val Leu Gly Lys Gln Gly Trp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Asn Leu

        355                 360                 365            

 

 

Lys Leu Met Asp Ser Val Leu Lys Glu Ser Gln Arg Leu Lys Pro Ile

    370                 375                 380                

 

 

Ala Ile Ala Ser Met Arg Arg Phe Thr Thr His Asn Val Lys Leu Ser

385                 390                 395                 400

 

 

Asp Gly Val Ile Leu Pro Lys Asn Lys Leu Thr Leu Val Ser Ala His

                405                 410                 415    

 

 

Gln His Trp Asp Pro Glu Tyr Tyr Lys Asp Pro Leu Lys Phe Asp Gly

            420                 425                 430        

 

 

Tyr Arg Phe Phe Asn Met Arg Arg Glu Pro Gly Lys Glu Ser Lys Ala

        435                 440                 445             

 

 

Gln Leu Val Ser Ala Thr Pro Asp His Met Gly Phe Gly Tyr Gly Leu

    450                 455                 460                

 

 

His Ala Cys Pro Gly Arg Phe Phe Ala Ser Glu Glu Ile Lys Ile Ala

465                 470                 475                 480

 

 

Leu Ser His Ile Leu Leu Lys Tyr Asp Phe Lys Pro Val Glu Gly Ser

                485                 490                 495    

 

 

Ser Met Glu Pro Arg Lys Tyr Gly Leu Asn Met Asn Ala Asn Pro Thr

            500                 505                 510        

 

 

Ala Lys Leu Ser Val Arg Arg Arg Lys Glu Glu Ile Ala Ile

        515                 520                 525    

 

 

<210>  2

<211>  476

<212>  PRT

<213>  甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)

 

<400>  2

 

Met Ile Gln Val Leu Thr Pro Ile Leu Leu Phe Leu Ile Phe Phe Val

1               5                   10                  15     

 

 

Phe Trp Lys Val Tyr Lys His Gln Lys Thr Lys Ile Asn Leu Pro Pro

            20                  25                  30          

 

 

Gly Ser Phe Gly Trp Pro Phe Leu Gly Glu Thr Leu Ala Leu Leu Arg

        35                  40                  45             

 

 

Ala Gly Trp Asp Ser Glu Pro Glu Arg Phe Val Arg Glu Arg Ile Lys

    50                  55                  60                  

 

 

Lys His Gly Ser Pro Leu Val Phe Lys Thr Ser Leu Phe Gly Asp Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Ala Val Leu Cys Gly Pro Ala Gly Asn Lys Phe Leu Phe Cys Asn

                85                  90                  95     

 

 

Glu Asn Lys Leu Val Ala Ser Trp Trp Pro Val Pro Val Arg Lys Leu

            100                 105                 110        

 

 

Phe Gly Lys Ser Leu Leu Thr Ile Arg Gly Asp Glu Ala Lys Trp Met

        115                 120                 125            

 

 

Arg Lys Met Leu Leu Ser Tyr Leu Gly Pro Asp Ala Phe Ala Thr His

    130                 135                 140                

 

 

Tyr Ala Val Thr Met Asp Val Val Thr Arg Arg His Ile Asp Val His

145                 150                 155                 160

 

 

Trp Arg Gly Lys Glu Glu Val Asn Val Phe Gln Thr Val Lys Leu Tyr

                165                 170                 175    

 

 

Ala Phe Glu Leu Ala Cys Arg Leu Phe Met Asn Leu Asp Asp Pro Asn

            180                 185                 190        

 

 

His Ile Ala Lys Leu Gly Ser Leu Phe Asn Ile Phe Leu Lys Gly Ile

        195                 200                 205            

 

 

Ile Glu Leu Pro Ile Asp Val Pro Gly Thr Arg Phe Tyr Ser Ser Lys

    210                 215                 220                

 

 

Lys Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ile Glu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Arg Lys Leu Glu Leu Lys Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ser Gln Asp Leu

                245                 250                 255    

 

 

Leu Ser His Leu Leu Thr Ser Pro Asp Glu Asn Gly Met Phe Leu Thr

            260                 265                 270        

 

 

Glu Glu Glu Ile Val Asp Asn Ile Leu Leu Leu Leu Phe Ala Gly His

        275                 280                 285            

 

 

Asp Thr Ser Ala Leu Ser Ile Thr Leu Leu Met Lys Thr Leu Gly Glu

    290                 295                 300                

 

 

His Ser Asp Val Tyr Asp Lys Val Leu Lys Glu Gln Leu Glu Ile Ser

305                 310                 315                 320

 

 

Lys Thr Lys Glu Ala Trp Glu Ser Leu Lys Trp Glu Asp Ile Gln Lys

                325                 330                 335    

 

 

Met Lys Tyr Ser Trp Ser Val Ile Cys Glu Val Met Arg Leu Asn Pro

            340                 345                 350        

 

 

Pro Val Ile Gly Thr Tyr Arg Glu Ala Leu Val Asp Ile Asp Tyr Ala

        355                 360                 365            

 

 

Gly Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu His Trp Ser Ala Val Ser

    370                 375                 380                

 

 

Thr Gln Arg Asp Glu Ala Asn Phe Glu Asp Val Thr Arg Phe Asp Pro

385                 390                 395                 400

 

 

Ser Arg Phe Glu Gly Ala Gly Pro Thr Pro Phe Thr Phe Val Pro Phe

                405                 410                 415    

 

 

Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Leu Gly Lys Glu Phe Ala Arg Leu Glu

            420                 425                 430        

 

 

Val Leu Ala Phe Leu His Asn Ile Val Thr Asn Phe Lys Trp Asp Leu

        435                 440                 445            

 

 

Leu Ile Pro Asp Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Pro Met Ala Thr Pro Ala

    450                 455                 460                

 

 

Lys Gly Leu Pro Ile Arg Leu His Pro His Gln Val

465                 470                 475    

 

 

<210>  3

<211>  1431

<212>  DNA

<213>  甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)

 

<400>  3

atgattcaag ttctaacacc gatccttctc ttcctcattt tcttcgtttt ctggaaggtt     60

 

tacaagcacc agaaaaccaa aatcaatctt ccaccgggaa gcttcggatg gccatttctg    120

 

ggcgaaactc tggcactcct acgtgcaggt tgggactcag agccggagag atttgttcgt    180

 

gaacggatca agaaacacgg aagtcctcta gtgtttaaga cgtcgttgtt tggcgaccgt    240

 

tttgcggtgt tgtgtggacc tgccggaaac aagttcctgt tctgcaacga gaacaagctg    300

 

gtggcgtcgt ggtggccggt tccggtgagg aagcttttcg gcaagtctct gctcacgatt    360

 

cgtggtgatg aagctaagtg gatgaggaag atgttgttat cgtatctcgg tcctgatgct    420

 

ttcgcaactc attatgccgt caccatggac gtcgtcaccc gtcggcatat cgacgttcat    480

 

tggcgaggga aggaagaggt gaacgtattc caaaccgtta agttatatgc ctttgagctt    540

 

gcatgtcgtt tattcatgaa cctagacgac ccaaaccaca ttgcaaaact cggttccttg    600

 

ttcaacattt tcttgaaagg catcattgag cttccaatcg acgtcccagg gacacgattt    660

 

tatagctcca aaaaagcagc agcagctatc aggattgaac taaaaaaatt gattaaagca    720

 

agaaaactgg aactgaaaga agggaaggca tcatcttcac aagacctctt atcacatttg    780

 

cttacatctc cagatgaaaa tggtatgttt ctaaccgaag aagagattgt agacaacatc    840

 

ttgttactac tctttgcggg tcatgatacc tcggctcttt caatcacttt gctcatgaag    900

 

actcttggcg aacattctga tgtttatgac aaggtgttaa aagagcaact agagatatcg    960

 

aagacgaaag aagcatggga gtccctgaaa tgggaggaca tacaaaagat gaaatactcc   1020

 

tggagtgtta tatgtgaagt catgagacta aatccacctg ttataggaac ctatagagag   1080

 

gcccttgtgg atattgatta tgcgggttat accatcccca aaggatggaa gctgcactgg   1140

 

agtgctgtat cgacacaaag ggacgaggct aactttgaag acgtaacacg ttttgaccca   1200

 

tcacggtttg aaggcgcagg accgactcca ttcacctttg ttccgtttgg aggggggcct   1260

 

agaatgtgtt tagggaaaga atttgctcga ttggaagtac ttgcgtttct tcacaatatt   1320

 

gtcaccaatt tcaaatggga cctgttgata cctgatgaga aaatagaata tgatcccatg   1380

 

gctaccccag caaaggggct tccaattcgt cttcatcccc atcaagtttg a            1431

 

 

<210>  4

<211>  1431

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

atgatccagg tcctcacccc tatcctcctc ttcctcatct tcttcgtctt ctggaaggtc     60

 

tacaagcacc agaagaccaa gatcaacctc cctcctggct ctttcggctg gcctttcctc    120

 

ggcgagaccc tcgctctcct ccgcgctggc tgggactctg agcctgagcg cttcgtccgc    180

 

gagcgcatca agaagcacgg ctctcctctc gtcttcaaga cctctctctt cggcgaccgc    240

 

ttcgctgtcc tctgcggccc tgctggcaac aagttcctct tctgcaacga gaacaagctc    300

 

gtcgcttctt ggtggcctgt ccctgtccgc aagctcttcg gcaagtctct cctcaccatc    360

 

cgcggcgacg aggctaagtg gatgcgcaag atgctcctct cttacctcgg ccctgacgct    420

 

ttcgctaccc actacgctgt caccatggac gtcgtcaccc gccgccacat cgacgtccac    480

 

tggcgcggca aggaggaggt caacgtcttc cagaccgtca agctctacgc tttcgagctc    540

 

gcttgccgcc tcttcatgaa cctcgacgac cctaaccaca tcgctaagct cggctctctc    600

 

ttcaacatct tcctcaaggg catcatcgag ctccctatcg acgtccctgg cacccgcttc    660

 

tactcttcta agaaggctgc tgctgctatc cgcatcgagc tcaagaagct catcaaggct    720

 

cgcaagctcg agctcaagga gggcaaggct tcttcttctc aggacctcct ctctcacctc    780

 

ctcacctctc ctgacgagaa cggcatgttc ctcaccgagg aggagatcgt cgacaacatc    840

 

ctcctcctcc tcttcgctgg ccacgacacc tctgctctct ctatcaccct cctcatgaag    900

 

accctcggcg agcactctga cgtctacgac aaggtcctca aggagcagct cgagatctct    960

 

aagaccaagg aggcttggga gtctctcaag tgggaggaca tccagaagat gaagtactct   1020

 

tggtctgtca tctgcgaggt catgcgcctc aaccctcctg tcatcggcac ctaccgcgag   1080

 

gctctcgtcg acatcgacta cgctggctac accatcccta agggctggaa gctccactgg   1140

 

tctgctgtct ctacccagcg cgacgaggct aacttcgagg acgtcacccg cttcgaccct   1200

 

tctcgcttcg agggcgctgg ccctacccct ttcaccttcg tccctttcgg cggcggccct   1260

 

cgcatgtgcc tcggcaagga gttcgctcgc ctcgaggtcc tcgctttcct ccacaacatc   1320

 

gtcaccaact tcaagtggga cctcctcatc cctgacgaga agatcgagta cgaccctatg   1380

 

gctacccctg ctaagggcct ccctatccgc ctccaccctc accaggtctg a            1431

Claims (8)

1.一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，该方法包括：载体构建中包含ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因的敲除或/和优化后的ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因的***，所述的萜类化合物是ent-贝壳杉烯酸、甜菊醇、莱鲍迪甙A，莱鲍迪甙B，莱鲍迪甙C，莱鲍迪甙D，莱鲍迪甙E，莱鲍迪甙F或莱鲍迪甙M。

2.根据权利要求1所述的一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，优化后的ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，所述的利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其工程菌为大肠杆菌、酵母细胞、海藻细胞、植物细胞、革兰氏阳性菌或真菌中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，所述的酵母细胞为酿酒酵母细胞或亚罗酵母。

5.根据权利要求3所述的一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，所述的革兰氏阳性菌为芽孢杆菌细胞。

6.根据权利要求3所述的一种利用基因工程改造酶制备萜类化合物的方法，其特征在于，所述的真菌为镰刀菌, 甘蔗镰孢菌, 藤仓赤霉菌,木薯痂圆孢菌, 暗球腔菌。

7.一种基于基因工程改造酶制备ent-贝壳杉烯酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）ent-贝壳杉烯酸氧化酶基因敲除载体的构建

以藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）基因组DNA为模板，分别扩增左右同源臂，以pCambia1302为模板扩增潮霉素基因表达框，然后以同源重组的方法将3个片段连接至pAN7-1骨架中，测序验证后，获得正确的敲除载体；

（2）基因工程菌的获得 

将藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）接种到PDA固体培养上，27℃培养8天后，从新鲜斜面上取大小约0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液体培养基中，24℃，130r/min培养24小时后按1%的接种量(v/v)转种到上述新鲜液体培养基中继续培养15小时.菌丝用无菌水、1M的MgSO₄各洗涤一遍；取大约1g湿菌丝于10ml溶壁酶液中，37℃温育4小时，所述溶壁酶液配置方法为：10ml的1M MgSO₄中加入200mg溶壁酶，过滤除菌；悬浮液用3000rpm离心10min，弃去含菌丝体碎片的沉淀，上清用无菌水缓缓稀释至MgSO₄浓度为0.5M，3000rpm离心15min，沉淀原生质体用0.5M MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗涤一遍，最后原生质体悬浮于1M山梨醇溶液中，适当稀释后涂布于MYG固体再生培养基上，26℃培养2-3天，观察再生情况；

将原生质体的浓度调为6x10⁷个/ml，取0.4ml原生质体，加入10ug或20ug线性化的质粒DNA，混合后冰浴20min，加入100ul PEG8000溶液，混匀后冰浴20min.再加入2mlPEG 8000溶液，混匀后室温5min以上；用4ml山梨醇溶液稀释，3000rpm离心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液悬浮；取0.2ml 原生质体涂布于15ml的再生培养基上，26℃培养12小时后，覆盖10ml含潮霉素的软琼脂MYG，26℃继续培养6－7天后观察结果；

（3）转化子的检出

在对照没有生长的前提下，统计转化平板上的抗性菌落数；计算转化率；将转化子接种到含抗生素的平板上测定其抗性水平；分别用PCR扩增测序法及Soutern Blot的方法进行验证转化子；将阳性菌落转接到含抗生素的PDA培养基上，重复继代筛选6次，保存菌株；

（4）发酵产物的测定

所得赤霉工程菌在PDA培养基上培养7天后，接入种子培养基50ml中，在30℃、300rpm摇床培养48小时，然后以10％的接种量转入发酵培养基，250ml三角瓶装30ml发酵培养基，在30℃、300rpm发酵8天；发酵液经单层滤纸过滤后将滤液pH调至2.0，滤液经0.45um滤膜过滤，所得样品进行HPLC色谱分析。

8.一种由上述ent-贝壳杉烯酸制得甜菊醇的方法，包括如下步骤：

（1）ent-贝壳杉烯酸羟化酶基因***载体的构建

将来自甜叶菊(Stevia Rebaudiana Bertoni)编码的ent-贝壳杉烯酸羟化酶（KAH，kaurenoic acid-13hydroxylase）的多核苷酸 (Genbank Accession Number: EU722415，SEQ ID NO：3)进行密码子优化后通过全基因合成的方式获得，以用于在藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)中表达；将优化后的编码ent-贝壳杉烯酸羟化酶的多核苷酸(SEQ ID NO：4)克隆到改进后的这pAN7-1表达载体中gpdA启动子的控制下，得到可以表达ent-贝壳杉烯酸羟化酶的质粒；所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F4:  5'  CTTTTCTCTTTCTTTTCCCAATGGAGGCTTCTTACCTCTACATCT  3'

R4:  5'  TCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTATTAGAGCTCAGAGAGGAGGTTG  3'

以Gibberella fujikuroi基因组DNA为模板，分别扩增左右同源臂；以pCambia1302为模板扩增潮霉素基因表达框，然后以同源重组的方法将4个片段连接至pAN7-1骨架中，测序验证后，获得正确的***载体；

（2）基因工程菌的获得 

将藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi）接种到PDA固体培养上，27℃培养8天后，从新鲜斜面上取大小约0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml MYG液体培养基中，24℃，130rpm培养24小时后按1%的接种量(v/v)转种到上述新鲜液体培养基中继续培养15小时；菌丝用无菌水、1M的MgSO₄各洗涤一遍；取大约1g湿菌丝于10ml溶壁酶液中，37℃温育4小时，所述溶壁酶液配置方法为：10ml的1M MgSO₄中加入200mg溶壁酶，过滤除菌；悬浮液用3000rpm离心10min，弃去含菌丝体碎片的沉淀，上清用无菌水缓缓稀释至MgSO₄浓度为0.5 M，3000rpm离心15min，沉淀（原生质体）用0.5M MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗涤一遍，最后原生质体悬浮于1M山梨醇溶液中，适当稀释后涂布于MYG固体再生培养基上，26℃培养2-3天，观察再生情况；

将原生质体的浓度调为6x10⁷个/ml，取0.4ml原生质体，加入10ug或20ug线性化的质粒DNA，混合后冰浴20min.加入100ul PEG8000溶液，混匀后冰浴20min.再加入2ml PEG 8000溶液，混匀后室温5min以上；用4ml山梨醇溶液稀释，3000rpm离心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液悬浮；取0.2ml 原生质体涂布于15ml的再生培养基上，26℃培养12小时后，覆盖10ml含潮霉素的软琼脂MYG；26℃继续培养6－7天后观察结果；

（3）转化子的检出

在对照没有生长的前提下，统计转化平板上的抗性菌落数；计算转化率；将转化子接种到含抗生素的平板上测定其抗性水平；分别用PCR扩增测序法及Soutern Blot的方法进行验证转化子；将阳性菌落转接到含抗生素的PDA培养基上，重复继代筛选6次，保存菌株；

（4）发酵产物的测定

所得赤霉工程菌在PDA培养基上培养7天后，接入种子培养基50ml中，在30℃、300rpm摇床培养48小时，然后以10％的接种量转入发酵培养基，250ml三角瓶装30ml发酵培养基，在30℃、300rpm发酵8天；发酵液经单层滤纸过滤后将滤液pH调至2.0，滤液经0.45um滤膜过滤，所得样品进行HPLC色谱分析。