CN104313035A - 茄子抗根结线虫相关基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茄子抗根结线虫相关基因及其应用，其具有Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。本发明根据Mi基因序列设计两个特异引物，采用RACE方法获得茄子Mi同源基因的全长序列，利用RT-PCR技术验证其功能，为茄子抗根结线虫分子育种奠定初步基础。

Description

茄子抗根结线虫相关基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和农业领域，具体的涉及一种茄子抗根结线虫相关基因及其应用。

背景技术

现在已经克隆的抗线虫基因主要集中于番茄、辣椒、甜菜、马铃薯和小麦，其中以番茄Mi基因研究的最为详细。抗线虫基因编码的蛋白大多含有保守的结构域，如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)等。第一个克隆到的抗线虫基因是Hs1^Pro-1，它来自甜菜，只有抗甜菜胞囊线虫的作用，其编码的蛋白有一个LRR结构域和一个TM结构域，但是其LRR结构域很小，序列与其它R基因编码的蛋白的LRR有明显差异。番茄Mi是利用图位克隆从秘鲁番茄Solanumperuvianum中分离到的，属于LZ-NBS-LRR家族。马铃薯抗线虫基因Gpa2、番茄的抗根腐线虫基因Hero A和小麦抗胞囊线虫基因Cre3等都属于NBS-LRR家族，只是在N端的连接序列不同。在不同植物上克隆出来的抗根结线虫基因大多属于NBS-LRR家族(除了Hs1^Pro-1)，对Gpa2、HeroA、Mi、Cre3进行序列分析发现，大多具有NBS-LRR保守序列，因此可以通过同源序列克隆抗根结线虫基因。陈儒钢等利用同源序列克隆的方法，分别从抗根结线虫的番茄和辣椒材料中克隆到抗根结线虫基因SlMi及CaMi，并利用农杆菌介导的遗传转化方法把辣椒的CaMi转入根结线虫敏感的番茄中，获得了抗根结线虫的番茄转基因株系并应用于育种中。张丽英等利用同源序列克隆的方法将克隆得到的SlMi基因通过农杆菌介导法转入到缺乏抗性的莴苣中，为莴苣抗根结线虫育种、为异源基因在莴苣中的成功应用奠定了基础。

近年来，人们除了对番茄、辣椒直接抗根结线虫基因克隆外，还对其相关的WRKY基因进行克隆。WRKY转录因子是一类转录调控因子，它参与抗病反应，同时影响植物的衰老、抗胁迫能力以及生长和发育。在辣椒上已成功克隆6个WRKY基因。李淑敏等从辣椒中分离到6个WRKY基因WRKY-a、WRKY-b、WRKY-c、WRKY1、CaWRKY1和CaWRKY2，这6个WRKY基因在接种根结线虫36h后的辣椒根尖、茎、叶片中都表达，而CaWRKY1基因在根结线虫接种36h后的辣椒根尖、叶片中表达，在茎中不表达，这表明辣椒WRKY-b、WRKY-c、CaWRKY1和WRKY1这4个基因在辣椒中表现为组成型表达，而WRKY-a、CaWRKY2基因是诱导型表达，CaWRKY1基因的表达具有组织特异性。郑井元等克隆出一个辣椒在早期应答南方根结线虫侵染时的抗性相关转录因子CaRKNIF2。实时荧光定量PCR分析表明该基因在线虫侵染3h后表达量即明显上升，到12h时，表达量达到最大，表明CaRKNIF2参与了辣椒与南方根结线虫的不亲和互作。在不同组织进行的实时荧光定量PCR分析显示，该基因在根尖组织中的表达量最高，具有组织特异性，表明其在参与根尖组织的应急反应中具有重要功能。

茄子在我国深受大众喜爱，经济效益较高，但同时也易受根结线虫的危害。根结线虫是一类寄生在植物根系，破坏植物正常生理代谢，造成植株死亡的病害。它们可以侵染很多种经济作物，给农业生产带来了严重危害。其中，南方根结线虫为优势种，能给许多园艺作物特别是蔬菜和果树带来毁灭性灾难。目前，控制根结线虫主要是通过轮作、土壤熏蒸^]和化学药物防治。但是，这些方法还不能完全控制根结线虫病的发生。例如土壤熏蒸，熏蒸剂严重破坏环境，并且很多熏蒸剂被限制使用。化学药剂防治根结线虫是不可取的，因为它不会成为一个高效和持久的控制方法。因此，克隆和验证抗性基因是实现转基因育种的一条高效途径。野生茄子种质资源丰富，具有许多优良性状，其中托鲁巴姆对根结线虫具有较高的抗性。因此，利用分子生物技术从托鲁巴姆中克隆抗根结线虫基因，对于了解茄子根结线虫病害的发生机制、抗病分子机理和抗病性育种有着非常重要的意义。

从不同物种里克隆出70多个R基因，其中大多数抗性基因的克隆都是根据NBS-LRR保守区域设计引物，采用PCR技术从植物DNA或cDNA中扩增得到同源片段，如咖啡、棉花、野生稻等。NBS即核苷酸结合位点，存在于真核生物的许多蛋白中，主要功能是负责ATP的水解和释放信号。NBS包含三个区域，kinase-1a区、kinase-2a区、kinase-3a区。LRR即富亮氨酸重复序列，是长度在24个氨基酸之内的多重重复，主要功能是决定寄主与病原的特异性识别。在园艺作物中已经克隆的抗线虫基因主要有甜菜抗胞囊线虫Hs1^Pro-1、马铃薯抗白线虫Gpa2、番茄的抗根腐线虫Hero、辣椒抗根结线虫CaMi、番茄抗根结线虫Mi，其中以Mi研究最为详细。番茄的Mi基因，它编码一个富亮氨酸重复序列并且对根结线虫、蚜虫、粉虱具有较高的抗性。Mi基因可以被转基因表达，转入到感病番茄和亲缘关系近的物种中对根结线虫具有明显抗性。但是，当烟草和拟南芥被侵染根结线虫后，Mi-1.2基因不表现抗性。目前，利用NBS-LRR保守区域设计引物，克隆得到的同源基因片段可以与分子标记相结合，借助遗传图谱将同源基因片段定位在染色体上，找到抗病基因。Qi等通过此方法将向日葵抗锈蚀病R4基因定位于向日葵的13号连锁群上。前人对茄子抗根结线虫基因的研究较少，茄子抗根结线虫的基因尚未被克隆。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茄子抗根结线虫相关基因，其具有Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。

本发明另一个目的是提供一种茄子抗根结线虫相关基因在茄子选育和抗根结线虫选育中的应用。

本发明根据已知抗线虫基因NBS-LRR保守结构域设计引物，以野生茄托姆巴鲁cDNA为模板克隆抗性基因同源片段，并分析这些序列的相关性，利用RT-PCR技术验证其功能，确定抗根结线虫基因片段；根据Mi基因序列设计两个特异引物，采用RACE方法获得茄子Mi同源基因的全长序列，利用RT-PCR技术验证其功能，为茄子抗根结线虫分子育种奠定初步基础。

附图说明

图1：茄子根系RNA完整性的琼脂糖凝胶电泳检测结果(1：根系RNA)；

图2：5’端和3’端RACE PCR扩增电泳结果(1：5’端RACE；2：3’端RACE)；

图3：重组质粒PCR检测结果(1：重组质粒的5’端PCR产物)；

图4：重组质粒PCR检测结果(1：重组质粒的3’端PCR产物)；

图5：根结线虫侵染前后茄子Mi同源基因在根、茎、叶中相对表达量。

具体实施方式

若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

1.1材料

1.1.1植物材料

实验材料为野生茄托鲁巴姆。

1.1.2南方根结线虫悬浮液

(1)取被侵染的茄子根系，洗去根表土，切成2-4mm长根放入1000ml烧瓶中。

(2)加入200ml 0.5％NaClO溶液于烧瓶，加盖，搅动3-5min。

(3)立即把碎片同溶液倒入200目和500目网筛组，用自来水充分洗下200目网筛上的卵。用自来水缓慢洗500目网筛内的卵5分钟，并集中于一处。

(4)500目网筛内的线虫收集于250ml烧杯内，定容至100ml。

(5)用吸管取0.5ml悬浮液移入盛有4.5ml自来水的小烧杯内，充分摇匀。

(6)立即取0.5ml稀释的悬浮液于计数皿上，用少许自来水滴入主数皿内，使幼虫随机落在计数皿底。

(7)在立体解剖镜下计1/4计数皿底上的虫数。

(8)从(4)步开始重复一次，两次记录虫数平均数乘以80，便得到原悬浮液每毫升所含幼虫数目。

1.1.3试剂盒

RNA提取试剂盒、PrimeScript^TM RT reagent Kit、pMD18-T Vector克隆试剂盒、凝胶回收试剂盒、TakaRaPreMix Ex Taq^TM。

1.1.4常用储液

X-Gal、IPTG、Amp、LB液体培养基、Tris缓冲液。

1.2方法

1.2.1材料的准备

(1)将托鲁巴姆种子播种于装有经热力消毒的砂壤土和粗砂土(1:1混合)的陶盆内，播完种子的陶盆置于20-25℃温室工作台上，培养42天，2-4真叶期进行接种。将南方根结线虫悬浮液(1000个/L)贴近植株倒入5ml于每盆中。

(2)分别取未接种前植株的叶片、茎段、根系和接种后6h、12h、24h植株的叶片、茎段、根系，经过液氮冷冻，-80℃保存。

1.2.2总RNA提取与cDNA的合成

以托鲁巴姆的嫩叶为材料，提取托鲁巴姆总RNA，总RNA的提取参照RNA提取试剂盒说明书上的操作步骤，cDNA的合成参照PrimeScript^TM RT reagent Kit说明书上的操作步骤，分装后直接用于PCR或置于-20℃冰箱保存。

(1)用液氮研磨适量的茄子叶片，并将磨好的样品移至2ml离心管中，装至2/3就可以。离心管一定提前用液氮预冷，操作要快，避免样品反复冻融；

(2)吸取1ml TakaRa RNAiso Reagent试剂加入样品中，枪头不能碰到离心管和样品，盖上离心管盖，并摇晃使混匀，静置5Min；

(3)12000r/Min4℃离心5Min，吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中；

(4)加入上清液体积1/5的氯仿，充分摇晃混匀呈浮浊色，静置5Min，12000r/Min4℃离心5Min；

(5)吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中，切忌吸出白色中间层，加入500ul氯仿混匀摇晃，静置5Min；

(6)12000r/Min4℃离心5Min，吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中；

(7)加入与上清等体积的异丙醇，室温静置10Min，12000r/Min4℃离心10Min，试管底部出现沉淀；

(8)小心弃去上清，尽量将上清去除干净，可将离心管盖子打开倒置于干净的纸上，缓慢沿离心管壁加入1ml75％乙醇，轻轻上下颠倒几下，洗涤沉淀；

(9)12000r/Min4℃离心5Min，小心弃去乙醇上清液，也需倒置，室温干燥沉淀2-5Min，加入适量DEPC水，溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待沉淀完全溶解后于-80℃保存。

利用核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，并保证A260/A280和A260/A230的值不小于1.8。使用TakaRa PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒进行反转录。

按下列组分配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)：

反应体系按所需量相应加大。反转录反应条件如下：

37℃   15Min*3(反转录反应)

85℃   5sec(反转录酶的失活反应)

将反转录产物置于-20℃保存，备用。

1.2.3引物设计与PCR扩增

根据在NCBI上找到的抗线虫NBS-LRR保守区域kinase-1a区(GVGKTT)和GLPL区(GLPLAL)的核酸序列特征，运用Primer5软件设计1对简并引物R1(表1)。引物由上海生工合成。

PCR扩增的总反应体系为25ml。PCR程序为94℃，4Min预变性；94℃，40s；55℃，30s；72℃，40s共35个循环。72℃再延伸10Min。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4PCR产物的克隆、测序与序列分析

PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，利用凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收目的片段。将PCR产物连接到pMD18-T上。16℃连接反应30Min，转化到JM109感受态细胞中，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养，形成单菌落。随机挑选其中的白色菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基震荡过夜培养，利用载体通用引物M13(表1)进行PCR扩增，以确认T载体中***片段的有无及长度大小并将菌液送去英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1Min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。

注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2Min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。

(5)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5Min再离心。

重复操作步骤5。

(7)将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2Min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

(8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2Min。12000rpm离心2Min收集DNA溶液。

注意：洗脱体积不应小于30μl，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.0)洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2Min，12000rpm离心2Min，将DNA溶液收集到离心管中。

(9)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

(10)加入5μl(等量)的Solution I。

(11)16℃反应30分钟。

(12)全量(10μl)加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

(13)42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

(14)加入890μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

(15)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

(16)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中***片段的长度大小。

利用GenBank进行同源性搜索及分析。结合GenBank中搜索到的同源性较高的序列，进行***进化分析。

1.2.5根结线虫诱导表达分析

取未接种和接种根结线虫6h、12h、24h的叶片、茎段、根系进行诱导表达分析。分别提取托鲁巴姆叶片、茎段、根系RNA，RNA的提取参照RNA提取试剂盒说明书上的操作步骤，cDNA的合成参照PrimeScript^TM RT reagent Kit说明书上的操作步骤。

(1)用液氮分别研磨适量的茄子叶片、茎段、根系，并将磨好的样品移至2ml离心管中，装至2/3就可以。离心管一定提前用液氮预冷，操作要快，避免样品反复冻融；

(2)吸取1ml TakaRa RNAiso Reagent试剂加入样品中，枪头不能碰到离心管和样品，盖上离心管盖，并摇晃使混匀，静置5Min；

(3)12000r/Min4℃离心5Min，吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中；

(4)加入上清液体积1/5的氯仿，充分摇晃混匀呈浮浊色，静置5Min，12000r/Min4℃离心5Min；

(5)吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中，切忌吸出白色中间层，加入500ul氯仿混匀摇晃，静置5Min；

(6)12000r/Min4℃离心5Min，吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中；

(7)加入与上清等体积的异丙醇，室温静置10Min，12000r/Min4℃离心10Min，试管底部出现沉淀；

(8)小心弃去上清，尽量将上清去除干净，可将离心管盖子打开倒置于干净的纸上，缓慢沿离心管壁加入1ml 75％乙醇，轻轻上下颠倒几下，洗涤沉淀；

(9)12000r/Min4℃离心5Min，小心弃去乙醇上清液，也需倒置，室温干燥沉淀2-5Min，加入适量DEPC水，溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待沉淀完全溶解后于-80℃保存。

利用核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，并保证A260/A280和A260/A230的值不小于1.8，利用RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。在逆转录之前，对所提取的RNA浓度进行调整，使所要进行逆转录的RNA稀释到相同浓度。使用TakaRaPrimeScript RT Reagent Kit试剂盒进行反转录。

按下列组分配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)：

反应体系按所需量相应加大。反转录反应条件如下：

37℃   15Min*3(反转录反应)

85℃   5sec(反转录酶的失活反应)

反转录后设计基因表达分析的引物P1-15和内参引物β-actin(表1)。采用天根PCRMix试剂，以反转录产物进行退火温度筛选。反应体系如下：

PCR反应35个循环，根据所使用的CFX96^TM Real Time PCR***要求，荧光定量PCR反应体系如下：

RT-PCR反应程序：采用两步法PCR扩增程序Stage1：95℃预变性3min；Stage2：95℃变性30sec；45-60℃退火30sec，循环40次。

1.2.6基因表达差异的分析方法

RT-PCR结果采用2^-△△Ct的分析方法。对于目的基因来说，PCR指数扩增的公式是：Rn＝R0×(1+Er)n，当循环数到达阈值的Ct时，荧光量为常数Kr，即Rt＝R0×(1+Er)Ct..r＝Kr。其中Er表示扩增效率，n表示循环数，Rn表示在n个循环后PCR产物的数量，Rt表示在Ct个循环后PCR产物的数量，R0为原始模板数量，Ct代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，Ct..r表示目的基因(相对于内参基因)扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，Kr为一常数，在这里指荧光量。对于内参基因而言，也具有同样的公式：Xt＝X0×(1+Ex)Ct.x＝Kx，两者相比得到：Rt/Xt＝R0×(1+Er)Ct.r/X0×(1+Ex)Ct.x＝Kr/Kx＝K。目的基因和内参基因经过Ct.r和Ct.x循环数后达到相同的荧光量，Kr和Kx相等，即K等于1。

假设目标序列与内参序列扩增效率相同，即Er＝Ex＝E，则(R0/X0)×(1+E)Ct.r-Ct.x＝K或RN×(1+E)Ct.r-Ct.x＝K。RN代表经过均一化处理过的初始目标分子量，△Ct表示目的基因和内参基因Ct值的差异(Ct.r-Ct.x)。整理上式可以得到：RN＝K×(1+E)-△Ct；最后用任一样品q的RN除以参照因子(calibrator,cb)的RN得到：RNq/XNb＝K×(1+E)-△Ct.q/K×(1+E)-△Ct.b＝(1+E)-△△Ct。在这里，-△△Ct＝-(-△Ct.q-△Ct.b)。在设计好引物，控制好扩增条件的基础上使扩增效率E接近于1。因此目的基因的表达量通过内参基因均一化处理之后相对于参照因子而言就是2^-△△Ct。

1.2.7实施例所用引物序列

引物列表如下：

表1引物碱基序列

2.1.1.3试剂盒

RNA提取试剂盒、PrimeScriptTM RT reagent Kit、pMD18-T Vector克隆试剂盒、凝胶回收试剂盒、TakaRaPreMix Ex TaqTM、BD SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)。

1.1.4常用储液

X-Gal、IPTG、Amp、LB液体培养基、Tris缓冲液

1.2方法

1.2.1总RNA提取

以接种根结线虫12h后托鲁巴姆的根系为材料，提取托鲁巴姆总RNA，总RNA的提取参照RNA提取试剂盒说明书上的操作步骤。

1.2.2RNA分析

反转录前，利用核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，并保证A260/A280和A260/A230的值不小于1.8，利用RNA琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

1.2.3cDNA第一链合成

在0.5ml微型离心管中加入下列试剂

(2)加入消毒水至终体积为5μl。

(3)混合并在小型离心机上短暂离心。

(4)70℃下温育2Min。

(5)迅速在冰上冷却2Min。

(6)短暂离心使成份聚集管底。

(7)在每个反应管内再加入下列试剂：

(8)小心混合管内的组分。

(9)短暂离心使成份聚集管底。

(10)42℃下温育1.5h

(11)使用Tricine-EDTA缓冲液来稀释反应产物

(12)72℃加热管7Min。

-20℃保存

1.2.4茄子Mi同源基因全长克隆

1.2.4.1引物设计与cDNA末端快速扩增(RACE)

根据E7基因序列设计两个特异引物R2R，R3F(表3-1)即用于5'RACEPCR反义引物和用于3'RACEPCR正义引物。

(1)PCR反应混合液的准备

(2)漩涡混合，短暂离心

(3)5'RACE反应

在0.5ml PCR管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。

(4)3'RACE反应

在0.5mlPCR管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。

(5)PCR反应

Program1

·5cycles：

94℃ 30sec

72℃ 3Min*

·5cycles：

94℃ 30sec

70℃ 30sec

72℃ 3Min*

·20cycles(PolyA+RNA):

3'RACE和5'RACE扩增产物经1％琼脂糖凝胶检测，利用凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收目的片段。

1.2.4.2RACE产物的克隆和测序

将RACE产物连接到pMD18-T上。16℃连接反应30Min，转化到JM109感受态细胞中，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养，形成单菌落。随机挑选其中的白色菌落制作成菌液送去英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。将E7和两端序列进行拼接，得到茄子Mi基因cDNA全长。

1.2.5根结线虫诱导表达分析

根据3'RACE的基因序列设计特异引物qc(表3-1)和内参引物β-actin(表3-1)，取未接种和接种根结线虫6h、12h、24h根系、茎段、叶片进行诱导表达分析。荧光定量PCR反应总体系为20μL，含SYBR Premix Ex Taq(2X)10μL，PCR Forward Primer(10μM)0.4μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL，ROX Reference Dye II(50X)0.4μL，DNA模板2.0μL，ddH2O6.8μL。RT-PCR反应程序：采用两步法PCR扩增程序Stage1：95℃预变性3min；Stage2：95℃变性30sec；54℃退火30sec，循环40次。

2茄子Mi同源基因克隆与表达结果分析

2.1总RNA纯度与质量检测

总RNA浓度为3000μg/ml，纯度较高，A260/A280、A260/A230均在2.0以上。利用琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测，检测显示28S、18S条带明亮，28S比18S明亮，无5S条带，检测结果较好(图1)可以进行下一步实验。

2.25'RACE和3'RACE产物

通过cDNA末端快速扩增技术，分别在5'端和3'端获得了PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了2条大小为2000bp左右的条带(图2)。

2.3重组质粒PCR检测

将5'端和3'端获得了PCR产物回收后连接到载体pMD18-T上，转化到JM109感受态细胞中，进行PCR检测，鉴定***T载体中的片段及其长度。结果得到2条大小约为2000bp的条带(见图3，图4)。

2.4茄子Mi同源基因序列分析

通过测序、拼接，得到了茄子Mi同源基因序列全长，该基因全长4309bp(SEQID NO.1)。用GeneScan软件进行序列分析显示，开放阅读框为3773bp，编码1249个氨基酸。

2.5茄子Mi同源基因与番茄Mi基因的比较

将获得的Mi同源基因ORF与番茄Mi基因ORF以及茄子Mi氨基酸序列和番茄Mi氨基酸序列分别通过DNAMAN进行比对，从同源性比对的结果来它们同源性非常高，分别达到了97％和87％，从而可以推测茄子Mi在功能上很有可能具有与番茄Mi类似的功能。

茄子Mi与番茄Mi基因的ORF比对结果

茄子Mi与番茄Mi翻译的氨基酸序列比对

2.6茄子Mi同源基因表达结果如图5所示

在获得茄子Mi同源基因全长的基础上，利用荧光定量技术检测了该基因在根结线虫诱导前后茄子不同器官中表达状况。结果显示，在托鲁巴姆接种前不同组织器官中(根、茎、叶)，茄子Mi同源基因在根中基本不表达，在茎、叶中表达量很低；在接种后的12h，在根、茎、叶中表达量显著提高，其中根部位表达量最高；在接种后的24h，在根、茎中表达量有所降低。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种茄子抗根结线虫相关基因，其具有Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。

2.一种载体，其特征在于含有上述基因。

3.一种茄子抗根结线虫相关基因在茄子选育和抗根结线虫茄子选育中的应用。