CN104297407B

CN104297407B - 小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法

Info

Publication number: CN104297407B
Application number: CN201410573382.7A
Authority: CN
Inventors: 何中虎; 李文爽; 夏先春
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2034-10-23
Also published as: CN104297407A

Abstract

本发明涉及一种小麦中类胡萝卜素含量的测定方法，包括如下步骤：1)标准样品的配制：将叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素标准品混合配制成一系列标准样品；2)待测液的配制：将提取得到的类胡萝卜素溶于甲醇：乙酸乙酯＝68:32的混合液，经离心，过油性滤膜即得；3)超高效液相色谱测试：在确定的色谱条件下测试；4)测试数据处理：绘制标准曲线，将已测的待测液的峰面积数据代入标准曲线即可得小麦中类胡萝卜素各组分含量。本测定方法中，提取小麦中类胡萝卜素的时间短，效率高，采用的超高效液相色谱具有快速、高效和分析灵敏度高等特点，叶黄素与玉米黄质能被彻底分开。可广泛用于小麦中类胡萝卜素含量的测定。

Description

小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明属于色谱检测领域，具体涉及小麦中类胡萝卜素含量的超高效液相色谱测定方法。

背景技术

我国是世界上最大的小麦生产国和消费国，每年种植面积约为2400万公顷，总产量约为1.1亿吨，在国民经济中占有重要的地位。随着经济的发展与人民生活水平的提高，消费者更加注重面制品营养品质和其外观品质。类胡萝卜素不仅是面粉及面制品颜色形成的重要因素，还对其营养价值有很大影响。因此，准确测定面粉中类胡萝卜素的含量对评价小麦营养价值及今后品质育种具有重大的指导意义。

现阶段，对小麦面粉及其面制品颜色的测定还仅局限于对其黄色素含量的测定。黄色素是小麦籽粒中最主要的天然色素，籽粒黄色素含量与面粉及面团黄度的相关系数高达0.8-0.9。利用分光光度计的方法测定面粉中黄色素的含量是评价面粉颜色的重要方法，鉴于人们对于黄色素的深入研究，该方法已经不能满足研究者的要求。类胡萝卜素是黄色素的主要组成部分，是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一大类萜类色素物质。要想深入研究黄色素对面粉颜色影响的机理，必须准确测定类胡萝卜素各组分的含量。目前，液相色谱法测定麦类作物中类胡萝卜素含量已有初步研究，但不同研究者方法不尽相同，色谱条件和提取方法是影响测定结果的重要原因。

高压液相色谱(HPLC)技术的进步已经使其成为在复杂的混合物中分离类胡萝卜素的最有效方法，其良好的重现性和灵敏度为分析人员提供了可靠和稳定的数据。用于类胡萝卜素HPLC分析和分离的固定相是多样的，类胡萝卜素分子的特征结构为多聚共轭双烯结构，这使得反相性较强的C₁₈柱成为分离和纯化类胡萝卜素的最具代表性的柱型，在高灵敏度的HPLC上，甚至可以测出样品中痕量类胡萝卜素及其几何异构体。尽管如此，C₁₈柱对类胡萝卜素顺反异构体的分离能力很有限，1994年Sander等应用自行设计的C₃₀柱，首次分离得到类胡萝卜素异构体，并达到非常好的分离效果。在相同的色谱条件下，与用作对照的两种传统的多聚和单聚C₁₈柱相比，C₃₀柱不仅近基线分离出更多的不同极性的类胡萝卜素，还进一步分离出对照柱中无法分开的顺反几何异构体。液相色谱法在蔬菜、水果及其制品中测定其类胡萝卜素含量应用已很广泛，然而，在麦类作物中，对类胡萝卜素含量的测定并没有统一的方法，Hidalgo等利用HPLC测定一粒小麦中叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，色谱柱为GRACE-Vydac201TP54C₁₈(250×4.6mm，5μm)，流动相选用甲醇：四氢呋喃(95:5，v/v)，此实验结果中叶黄素的峰形中出现杂峰，α-胡萝卜素与β-胡萝卜素两种物质的峰形没有完全分开。Konopka等利用色谱柱YMC-C₃₀(250×4.6mm,3μm)，流动相甲醇：甲叔丁基醚(89:11，v/v)测定波兰春小麦中的类胡萝卜素，其中叶黄素与玉米黄质的分离效果不好，且运行时间较长(1小时)。

随着色谱技术的发展，2004年Waters公司研制出第一批超高效液相色谱(UPLC)，和HPLC相比，它具有更高的灵敏度、分离度和运行速度。Hung等在2011年采用色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC₁₈(100×2.1mm，1.7μm)，以含0.1％三氟乙酸的超纯水(A)和甲醇：乙腈：异丙醇＝54:44:2(v/v/v)(B)为流动相，利用UPLC测定硬粒小麦中的类胡萝卜素，包括叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素，在这个试验中并没有测定玉米黄质和α-胡萝卜素。

小麦中类胡萝卜素的提取方法并不统一，我国对小麦类胡萝卜素的研究几乎为零。很多实验室将黄色素分析与类胡萝卜素等同，参照AACC14-50，利用水饱和正丁醇提取，分光光度计检测，此方法只能测定面粉的黄度，并不能鉴定其组分。Hung等在对硬粒小麦类胡萝卜素含量的测定实验中，利用水饱和正丁醇提取，不仅提取时间长，而且水饱和正丁醇粘度大，与流动相相容难度大。因此，如何建立快速和高效地提取小麦面粉中类胡萝卜素方法，选取何种提取液，从而提高提取效率，显得尤为重要。

目前，利用UPLC测定类胡萝卜素的研究还很少，国内基本没有，更没有统一的行业测定标准。因此，选择怎样的UPLC的色谱条件才有利于保证实验的准确性和可重复性，需要进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦中类胡萝卜素的提取方法。

本发明所述小麦中类胡萝卜素的提取方法包括如下步骤：将正己烷和丙酮的混合液与小麦面粉混合，恒温振荡，最终提取得到小麦中类胡萝卜素，其中，所述正己烷和丙酮的提取液中含有0.01％～1％(w/v)的抗氧化剂，优选为0.1％。

上述提取方法中，所述正己烷和丙酮的混合液与小麦面粉的比例为(10ml～50ml)：(2g～10g)，优选为40ml：8g。

所述正己烷和丙酮的提取液中，正己烷和丙酮的体积比为(7～9)：(1～3)，优选为8:2。

所述抗氧化剂选自如下至少一种：2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、1,1,3-三(2-甲基-4羟基-5叔丁基苯基)丁烷、1,2,3-苯三酚和1,3,5-三甲基-2,4,6-三(3,5-二叔丁基-4羟基苄基)苯等，优选为26-二叔丁基对甲酚(BHT)。

所述恒温振荡是通过恒温振荡器来实施的，所述恒温为25℃～45℃，具体为35℃；所述恒温振荡器的转速为200rpm～400rpm，具体为300rpm；所述振荡的时间为0.5h～2h，具体为1h。

上述提取方法具体可通过如下步骤实施：将小麦面粉与正己烷和丙酮的提取液混合，恒温振荡，静置，离心收集上清液，氮气吹干，得小麦中类胡萝卜素。

所述静置的时间为1min-2min。

所述离心是在温度4℃以下进行的，防止高速离心过程中产生的热量对离心管造成影响。

所述离心的转速为20,000g～23,500g，具体为23,500g

所述离心的时间为5min～20min，具体为15min。

所述氮气吹干是通过氮吹仪来实施的，所述氮吹仪的加热温度为25℃～45℃，具体为35℃；

上述提取方法中，所述小麦面粉可通过将小麦籽粒磨粉过筛而制备得到，所述磨粉之前还包括对小麦籽粒进行如下操作步骤：首先测定小麦籽粒硬度值，并依据其硬度值，将硬质麦(硬度值>60)，混合麦(40≤硬度值≤60)和软质麦(<40)分别调至含水量16.5％、15.5％和14.5％，然后润麦16h～18h；所述磨粉是使用BrabenderQuandrmatJunior(BrabenderInc.,Duisberg,Germany)磨按AACC方法26-50(1995)磨粉，所述过筛的目数为60目。

本发明的再一个目的是提供一种小麦中类胡萝卜素含量的测定方法。

本发明所述小麦中类胡萝卜素含量的测定方法包括如下步骤：

1)标准曲线的制备：

(a)将叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的标准品，在有机溶剂中混合配制成一系列类胡萝卜素标准样品；配制过程中应避免光照和高温；然后按如下色谱条件进行超高效液相色谱(UPLC)测试：

色谱柱：C₃₀高效液相色谱柱；

流动相：A相为乙腈、甲醇、水和三乙胺按体积比810:150:40:0.5混合所得混合液；

B相为甲醇、乙酸乙酯和三乙胺按体积比680:320:0.5混合所得混合液；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如下：

0-0.3min：流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

0.3-12min：流动相A的体积分数由100％降低至0，流动相B的体积分数由0增加至100％；

12-20min：流动相A的体积分数为0，流动相B的体积分数为100％；

20-22min：流动相A的体积分数由0增加至100％，流动相B的体积分数由100％降低至0；

22-25min：流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

(b)记录类胡萝卜素各组分中每个浓度叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素对应的峰面积；

以叶黄素的峰面积为纵坐标，以叶黄素的浓度为横坐标，制备叶黄素的线性回归方程；

以玉米黄质的峰面积为纵坐标，以玉米黄质的浓度为横坐标，制备玉米黄质的线性回归方程；

以α-胡萝卜素的峰面积为纵坐标，以α-胡萝卜素的浓度为横坐标，制备α-胡萝卜素的线性回归方程；

以β-胡萝卜素的峰面积为纵坐标，以β-胡萝卜素的浓度为横坐标，制备β-胡萝卜素的线性回归方程；

2)小麦中类胡萝卜素含量的测定：

(c)将按所述小麦中类胡萝卜素的提取方法提取得到的类胡萝卜素，溶解在有机溶剂中，离心，取上清液过油性滤膜，得到小麦中类胡萝卜素待测液，其中，甲醇和乙酸乙酯的混合液中含有0.01％～1％(w/v)的抗氧化剂；

(d)将所述小麦中类胡萝卜素待测液按步骤1)所述色谱条件进行超高效液相色谱(UPLC)测试，并分别记录叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素对应的峰面积；

将叶黄素的峰面积代入所述叶黄素的线性回归方程中，计算得到所述小麦中类胡萝卜素中叶黄素的含量；

将玉米黄质的峰面积代入所述玉米黄质的线性回归方程中，计算得到所述小麦中类胡萝卜素中玉米黄质的含量；

将α-胡萝卜素的峰面积代入所述α-胡萝卜素的线性回归方程中，计算得到所述小麦中类胡萝卜素中α-胡萝卜素的含量；

将β-胡萝卜素的峰面积代入所述β-胡萝卜素的线性回归方程中，计算得到所述小麦中类胡萝卜素中β-胡萝卜素的含量。

上述测定方法中，步骤1)的(a)中，所述叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素标准品的质量比为(3～8)：(1～4)：(1～4)：(1～3)，具体为8:2:4:3，此处四种标准品质量比的设定是依据普通小麦中的大致含量而设定的，目的在于使所述待测小麦中类胡萝卜素的峰面积在所述标准曲线内，以保证测定数据的准确性。

所述有机溶剂选自二氯甲烷和/或甲醇，所述有机溶剂在配制过程中，优选为先用二氯甲烷溶解所述标准品，再用甲醇定容到所需浓度。

所述色谱条件中，所述超高效液相色谱的仪器型号为WatersAcquityUPLC，二极管阵列检测器(PDA)的检测波长为450nm；所述色谱柱为YMC30CT99S03-1046WTC₃₀高效液相色谱柱，规格为4.6mm×100mm，填料直径为3μm；所述流动相的流速为0.4ml/min；所述高效液相色谱柱的柱温为35℃，样品室温度：18℃，进样体积为8μl。

上述测定方法中，步骤2)的(c)中，所述类胡萝卜素与有机溶剂的比例为(2μg～14μg)：(1.0ml～2.0ml)。

所述有机溶剂选自如下至少一种：甲醇和乙酸乙酯的混合液、正己烷、甲醇和二氯甲烷的混合液和乙酸乙酯，优选为甲醇和乙酸乙酯的混合液，其中，甲醇和乙酸乙酯的混合液中甲醇和乙酸乙酯的体积比为68:32，甲醇和二氯甲烷的混合液中甲醇和二氯甲烷的体积比为45：55。

所述抗氧化剂选自如下至少一种：2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、1,1,3-三(2-甲基-4羟基-5叔丁基苯基)丁烷、1,2,3-苯三酚和1,3,5-三甲基-2,4,6-三(3,5-二叔丁基-4羟基苄基)苯等，优选为2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)。

所述离心的转速为12,000g～16,000g，具体为15,000g，时间为5min～25min，具体为20min。

所述油性滤膜的膜孔为0.22μm～0.45μm，优选为0.22μm。

本发明中按所述小麦中类胡萝卜素的提取方法提取得到的类胡萝卜素，需在提取后的24小时内完成类胡萝卜素中各组分含量的测定工作。

小麦中类胡萝卜素前处理的好坏直接影响最后的测定结果，不同植物中类胡萝卜素提取的方法不同，在小麦中，没有统一的方法来提取小麦面粉中的类胡萝卜素，本发明通过对不同处理间试验结果比较，如：采用恒温振荡和超声波降解两种提取方法，通过比较类胡萝卜素的提取效率，最终选择使用提取效果较优的恒温振荡的提取方法，建立了适合实验室检测的类胡萝卜素提取方法。选取正己烷和丙酮的混合液作为提取溶剂，恒温振荡作为提取方法，这种方法与皂化提取相比更加简单，与一般的静置提取(16h-18h)相比大大减少提取时间，而且提取过程中超高速的离心使提取物质中杂质更少，也更加适合大量小麦样品类胡萝卜素的提取。这种提取小麦类胡萝卜素的的方法在国内是首例，提取时间短，效率高，且能够用于后续的UPLC分析，也能够在较短时间内测定大量样品。

与常规的液相色谱(HPLC)相比，本发明所采用的超高效液相色谱(UPLC)具有更快速、更高效的特点，其分析灵敏度高，节约溶剂，能够将在HPLC条件下分离度不好的叶黄素和玉米黄质两种类胡萝卜素组份分开，具有更高的分离能力，而且能够同时提高速度和分离度，可以在很宽的线速度、流速和高反压下进行高效的分离工作，以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，并获得优异的结果。

本发明通过超高效液相色谱仪确定了小麦中类胡萝卜素测定的色谱条件，25分钟之内就可以将小麦中含有的四种类胡萝卜素(叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素)分离，叶黄素保留时间12.173min，玉米黄质保留时间13.203min，α-胡萝卜素保留时间18.472min，β-胡萝卜素保留时间20.836min，叶黄素与玉米黄质被彻底分开，且每种物质峰与峰之间分离间隔较大，有利于鉴别样品中的类胡萝卜素。

色谱条件中利用乙酸乙酯作为B相的主要洗脱物质，相比于之前使用的甲叔丁基醚毒性小、粘度低，在A相中加入了4％的超纯水，可以使流动相在超高压环境下粘度不会被增加。进样体积为8μl，大大减少了提取样品的使用量。

附图说明

图1为标准样品中类胡萝卜素各组分色谱图。

图2为所绘制标准样品中各组分含量和峰面积关系的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中所用试剂：水为GB/T6682中规定的一级水；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，分析纯；丙酮(C₃H₆O)，分析纯；正己烷(C₆H₁₄)，分析纯；四氢呋喃(C₄H₈O)，分析纯；石油醚(C₆H₁₄)，分析纯；甲醇(CH₃OH)，色谱纯；乙腈(CH₃CN)，色谱纯；乙酸乙酯(C₄H₈O₂)，色谱纯；二氯甲烷(CH₂Cl₂，DCM)，色谱纯；N,N-二乙基乙胺，((C₂H₅)₃N)，俗称三乙胺，分析纯。

下述实施例中所用叶黄素标准品货号X6250，玉米黄质标准品货号14681，α-胡萝卜素标准品货号No.0007，β-胡萝卜素标准品货号C4582，其中叶黄素、玉米黄质和β-胡萝卜素标准品购自Sigma公司，α-胡萝卜素标准品购自CaroteNature公司。

本发明所述小麦中类胡萝卜素的提取方法中，所述提取液是按如下方法确定的：选用中麦175和中优206两个小麦品种为试验材料，选取5种提取液(正己烷：丙酮＝8：2，丙酮：甲醇＝7：3，丙酮：石油醚＝1：1，甲醇：四氢呋喃＝1：1，甲醇：二氯甲烷＝45：55，分别加入01％(w/v)的BHT作为抗氧化剂)，比较5种提取液对两个试验材料中叶黄素提取量的大小。2个样品，5种提取液，共10个处理，每个处理重复两次，提取叶黄素的含量用平均值±标准差表示。结果表明，5种提取液，其中甲醇：二氯甲烷＝45:55，提取叶黄素的量显著低于其他的4种提取液(P＝0.05)，其余4种提取液提取叶黄素含量间并没有显著差异(P＝0.05)，但是正己烷：丙酮＝8：2和丙酮：甲醇＝7：3提取的叶黄素的含量较高，因在离心过程中，正己烷：丙酮＝8：2提取液更容易与小麦面粉分离，粘度较低，所以最终选择正己烷：丙酮＝8：2作为小麦中类胡萝卜素的提取液，相应测试结果如下表2：

表1不同提取液提取小麦中叶黄素的含量

注：不同小写字母代表差异达P＝0.05水平。

实施例一：305份普通小麦中类胡萝卜素含量的测定

1)小麦中类胡萝卜素的提取：

(1)小麦籽粒收获后，晒干，用近红外(NIT)分析仪测其水分，SKCS单籽粒谷物特性测试仪(PertenInstrumentsNorthAmericaInc，Springfield，IL)测定硬度值，硬质麦(>60)，混合麦(40≤硬度值≤60)和软质麦(<40)分别调至含水量16.5％、15.5％和14.5％，然后润麦16个小时，最后用BrabenderQuandrmatJunior实验磨磨粉，并过60目筛。将磨好并过筛的粉状样品(即面粉)于-20℃条件下避光保存。

(2)称取8.0g粉状样品放入100ml蓝盖试剂瓶内，加入40.0ml正己烷：丙酮＝8:2的提取液(其中，含有0.1％BHT)，盖紧塞子，放在混旋器上混合，使粉状样品充分湿润。

(3)将混合后的粉状样品置于恒温振荡器中，300rpm，35℃，振荡1小时。

(4)振荡完成后，静置片刻，将上清液转移至50ml离心管中，23,500xg，4℃下离心15分钟。

(5)再将离心完后的上清液转入100ml烧杯中，置于氮吹仪中，35℃水温，用氮气吹干溶剂，即可提取得到小麦中类胡萝卜素。

2)小麦中类胡萝卜素含量的测定：

(a)将按所述提取方法从步骤(3)所述8.0g粉状样品中提取得到的类胡萝卜素溶解在1.5ml甲醇：乙酸乙酯＝68:32(其中，含有0.1％BHT)的混合液中，再转入2ml离心管中，置于-20℃冰箱中。

(b)上样前，将步骤(a)中的溶解有类胡萝卜素的溶液于15,000g，4℃条件下离心20min，离心完后，用1ml注射器吸取上清液，过0.22μm油性滤膜，置于2ml棕色离心管中。吸取200μl加入液相小瓶，用于UPLC分析。

(c)依据如下色谱条件进行超高效液相色谱(UPLC)测试：

仪器：WatersAcquityUPLC

色谱柱：YMC30CT99S03-1046WTC₃₀高效液相色谱柱(4.6mm×100mm，3μm)

流动相：A相乙腈：甲醇：水：三乙胺＝810:150:40:0.5

B相甲醇：乙酸乙酯：三乙胺＝680:320:0.5

柱温：35℃，样品室温度：18℃

二极管阵列检测器(PDA)：检测波长450nm

进样体积：8μl

流动相梯度如下表1：

表2流动相梯度

时间(min)	流动相A％	流动相B％	流速(ml/min)
				0	100	0	0.4
0.3	100	0	0.4
				12	0	100	0.4
20	0	100	0.4
				22	100	0	0.4
25	100	0	0.4

其中，表2中，0.3-12min：流动相A的体积分数由100％匀速降低至0，流动相B的体积分数由0匀速增加至100％；20-22min：流动相A的体积分数由0匀速增加至100％，流动相B的体积分数由100％匀速降低至0。

(d)测试数据处理：根据叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素标准样品的保留时间(如附图1所示)确定小麦中的类胡萝卜素组分的出峰时间，然后将步骤(c)中已测的305份小麦样品的的峰面积数据代入标准曲线(由标准样品中各组分含量和峰面积关系绘制得到，如附图2所示)中，即可得到类胡萝卜素中各组分(叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素)含量。

重复测定一个小麦样品的相关性为0.99，且各组分保留时间稳定。305份普通小麦中类胡萝卜素各组分含量分别为：叶黄素含量范围从20.63到102.54μg/100g，平均值为43.51μg/100g；玉米黄质含量范围从4.10到14.98μg/100g，平均值为7.49μg/100g；β-胡萝卜素含量范围从1.23到85.29μg/100g，平均值为19.26μg/100g；根据测定结果，我们并未检测到α-胡萝卜素，分析得知，α-胡萝卜素在普通小麦中的含量太低。

305份小麦样品中类胡萝卜素中各组分的含量如下表3、4和5所示，其中305份品种来自三个麦区(黄淮麦区166份，北部麦区90份，长江中下游麦区49份)，每个麦区两个地点，一个地点两次重复，每个品种类胡萝卜素含量取其平均值。

表3UPLC法检测黄淮麦区普通小麦类胡萝卜素组分含量

表4UPLC法检测北部麦区普通小麦类胡萝卜素组分含量

表5UPLC法检测长江中下游麦区普通小麦类胡萝卜素组分含量

Claims

1.一种小麦中类胡萝卜素含量的测定方法，包括如下步骤：

1)标准曲线的制备：

(a)将叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素标准品，在有机溶剂中混合配制成一系列类胡萝卜素标准样品；然后按如下色谱条件进行超高效液相色谱测试：

色谱柱：C₃₀高效液相色谱柱；

流动相：

A相为乙腈、甲醇、水和三乙胺按体积比810:150:40:0.5混合所得混合液；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如下：

2)小麦中类胡萝卜素含量的测定：

(c)将如下提取方法提取得到的类胡萝卜素，溶解在有机溶剂中，离心，取上清液过油性滤膜，得到小麦中类胡萝卜素待测液，其中，每100ml所述有机溶剂的混合液中含有0.01g～1g的抗氧化剂；

所述提取方法，包括如下步骤：将正己烷和丙酮的混合液与小麦面粉混合，恒温振荡，最终提取得到小麦中类胡萝卜素，其中，每100ml所述正己烷和丙酮的混合液中含有0.01g～1g的抗氧化剂；

所述正己烷和丙酮的混合液中，正己烷和丙酮的体积比为(7～9)：(1～3)；

(d)将所述小麦中类胡萝卜素待测液按步骤1)所述色谱条件进行超高效液相色谱测试，并分别记录叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素对应的峰面积；

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤1)的(a)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷和/或甲醇。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：步骤1)的(a)中，所述色谱条件中，所述超高效液相色谱的仪器型号为WatersAcquityUPLC，二极管阵列检测器的检测波长为450nm；

所述色谱柱为YMC30CT99S03-1046WTC₃₀高效液相色谱柱，规格为4.6mm×100mm，填料直径为3μm；

所述流动相的流速为0.4ml/min；

所述高效液相色谱柱的柱温为35℃，样品室温度：18℃，进样体积为8μl。

4.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：步骤2)的(c)中，所述有机溶剂选自如下至少一种：甲醇和乙酸乙酯的混合液、正己烷、甲醇和二氯甲烷的混合液和乙酸乙酯，其中，甲醇和乙酸乙酯的混合液中甲醇和乙酸乙酯的体积比为68:32，甲醇和二氯甲烷的混合液中甲醇和二氯甲烷的体积比为45：55；

所述类胡萝卜素与甲醇和乙酸乙酯的混合液的比例为(2μg～14μg)：(1.0ml～2.0ml)；

所述抗氧化剂选自如下至少一种：2,6-二叔丁基对甲酚、1,1,3-三(2-甲基-4羟基-5叔丁基苯基)丁烷、1,2,3-苯三酚和1,3,5-三甲基-2,4,6-三(3,5-二叔丁基-4羟基苄基)苯；

所述离心的转速为12,000g～16,000g，时间为5min～25min；

所述油性滤膜的膜孔为0.22μm～0.45μm。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述正己烷和丙酮的混合液与小麦面粉的比例为(10ml～50ml)：(2g～10g)；

所述正己烷和丙酮的混合液中，正己烷和丙酮的体积比为8:2；

所述抗氧化剂选自如下至少一种：2,6-二叔丁基对甲酚、1,1,3-三(2-甲基-4羟基-5叔丁基苯基)丁烷、1,2,3-苯三酚和1,3,5-三甲基-2,4,6-三(3,5-二叔丁基-4羟基苄基)苯。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述恒温振荡是通过恒温振荡器来实施的，所述恒温为25℃～45℃；

所述恒温振荡器的转速为200rpm～400rpm；

所述振荡的时间为0.5h～2h。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：将小麦面粉与正己烷和丙酮的提取液混合，恒温振荡，静置，离心收集上清液，氮气吹干，得小麦中类胡萝卜素。

8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于：所述静置的时间为1min～2min；

所述离心是在温度4℃以下进行的；

所述离心的转速为20,000g～23,500g；

所述离心的时间为5min～20min；

所述氮气吹干是通过氮吹仪来实施的，所述氮吹仪的加热温度为25℃～45℃。

9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述小麦面粉通过将小麦籽粒磨粉过筛而制备得到；

所述磨粉之前还包括对小麦籽粒进行如下操作步骤：首先测定小麦籽粒硬度值，并依据其硬度值，将硬质麦，混合麦和软质麦分别调至含水量16.5％、15.5％和14.5％，然后润麦16h～18h；

所述硬质麦的硬度值大于60；

所述混合麦的硬度值为40≤硬度值≤60；

所述软质麦的硬度值为小于40；

所述过筛的目数为60目。