CN115078567B - 一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法。该方法首先提取样品中的叶黄素酯和玉米黄质酯，然后利用酶解将叶黄素酯和玉米黄质酯转换为叶黄素和玉米黄质，最后利用高效液相色谱测定叶黄素和玉米黄质的含量并折算成叶黄素酯和玉米黄质酯。本发明采用酶解法和液相色谱技术相结合能够准确测定叶黄素酯和玉米黄质酯的含量，该方法广泛适用于软糖、片剂、胶囊剂等产品。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品、食品或药品的功效成分检测领域，尤其涉及片剂、胶囊、粉剂、软糖等制剂中叶黄素酯和玉米黄质酯功效成分含量的检测方法。
背景技术
叶黄素酯和玉米黄质酯是一种重要的类胡萝卜素脂肪酸酯，互为同分异构体，它广泛存在于万寿菊花、南瓜等植物体内，叶黄素酯在万寿菊花中含量最为丰富，高达30％至40％。在万寿菊花和其它植物中，叶黄素一般与脂肪酸(如月桂酸、棕桐酸等)结合成酯的形式存在。
叶黄素酯和玉米黄质酯的检测方法目前没有相关法规标准，已公开的发明专利如内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司的发明专利《测定叶黄素酯产品中叶黄素二棕榈酸酯含量的方法》(申请号201610189029.8)，该方法利用分光光度计进行测定，只能适用于原料，对于添加了多种其他成分的食品或保健食品，该方法无法准确测定。因此需要开发高效液相色谱法来准确测定食品或保健食品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服以上现有技术存在的缺陷，提供一种准确测定食品或保健食品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法，包括以下步骤：
步骤(1)：标准溶液的配置
分别称取适量叶黄素和玉米黄质对照品，用乙醇溶解，制成每1ml分别含0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug的标准溶液；
步骤(2)：酶溶液的制备
称取适量酶用水溶解，使溶液的酶活力浓度为2～10U/ml；
步骤(3)：样品溶液的制备
称取1.0～5.0g样品于50ml离心管中，分别加入5～10ml水、0.1～0.5g胰酶和0.1～0.5g果胶酶，在40～60℃恒温水浴中振摇溶解后，加入1～5g氯化钠和15～25ml溶剂Ⅰ继续在40～60℃恒温水浴中振摇10min，冷却至室温，加入10ml萃取剂振摇2min后离心，移取上清液层至50ml容量瓶中，重复萃取3～4次，用萃取剂定容至50ml；
精密吸取上述溶液1～5ml至25ml容量瓶中，氮气吹干，加入2～5ml溶剂Ⅱ超声溶解，再加入2～5ml酶溶液混匀，放入37℃水浴中酶解45min，冷却后用乙醇定容至25ml，用于高效液相色谱测定；
步骤(4)：设定高效液相色谱实验条件
色谱柱：YMC Carotenoid(250×4.6mm，5μm)或等效色谱柱；
流动相：甲醇与乙酸乙酯混合溶液；
流速：0.8～1.5ml/min；
检测波长：445nm；
柱温：30℃；
进样量：20ul；
步骤(5)：标准曲线的建立
将步骤(1)得到的标准溶液在步骤(4)的条件下进行液相分析，测得各标准溶液的峰面积，以各标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线；
步骤(6)：含量测定
将步骤(3)得到的样品溶液在步骤(4)的条件下进行液相分析，测得其峰面积，与标准曲线进行对比，得到其浓度，结合样品的称重，计算得到样品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量。
进一步，所述步骤(6)中叶黄素酯和玉米黄质酯含量的计算公式为：
式中：
C样—由样品溶液的峰面积查标准曲线计算得到样品溶液的浓度，μg/mL；
W样—样品称重，g；
V—稀释体积，ml；
1.84—转换为二棕榈酸酯的换算系数。
进一步，所述步骤(2)中酶为脂肪酶、胆固醇酯酶、磷脂酶。
进一步，所述步骤(3)中溶剂Ⅰ为二甲亚砜、乙醇、异丙醇、四氢呋喃，萃取剂为正己烷、石油醚、***、乙酸乙酯，溶剂Ⅱ为乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃。
进一步，所述步骤(4)中甲醇与乙酸乙酯的混合溶液，其中乙酸乙酯占比10％～30％。
进一步，所述的样品是食品或保健食品中的片剂、胶囊、粉剂、软糖制剂。
本发明的一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法，其有益效果是：创造性的采用酶解法将叶黄素酯和玉米黄质酯转换为叶黄素和玉米黄质，再利用高效液相色谱测定叶黄素和玉米黄质的含量并折算成叶黄素酯和玉米黄质酯。对比碱液皂化叶黄素酯和玉米黄质酯需要的强碱性和高温条件，会导致叶黄素降解和异构化，本发明酶解法条件温和，反应效率高，且本方法的液相色谱参数能够完全分离叶黄素和玉米黄质，从而能够准确测定其含量。本发明适用于片剂、胶囊、粉剂、软糖等食品或保健食品中叶黄素酯和玉米黄质酯的测定。
附图说明
图1是实施例1中叶黄素和玉米黄质的标准溶液的色谱图；
图2是实施例1中样品溶液的色谱图；
图3是实施例2中叶黄素和玉米黄质的标准溶液的色谱图；
图4是实施例2中样品溶液的色谱图；
图5是实施例3中叶黄素和玉米黄质的标准溶液的色谱图；
图6是实施例3中样品溶液的色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.0标准溶液配制
分别精密称取10mg叶黄素和玉米黄质对照品于50ml棕色容量瓶中，加入25ml乙醇，超声溶解，用乙醇定容至刻度，作为储备液。将储备液用乙醇稀释成每1ml分别含0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug的标准溶液。
1.1酶溶液配制
称取适量脂肪酶用水溶解，使溶液的酶活力浓度为5.0U/ml。
1.2样品溶液制备
取20粒软糖(产品名称：DHA藻油叶黄素酯软糖，批号：BA2020006,生产单位：江苏艾兰得营养品有限公司)，冷冻粉碎，精密称取2.0g样品于50ml离心管中，分别加入10ml去离子水、0.2g胰酶和0.2g果胶酶，在50℃恒温水浴中振摇溶解后，加入2g氯化钠和15ml乙醇继续在50℃恒温水浴中振摇10min，冷却至室温，加入10ml正己烷振摇2min后离心，移取上清液层至50ml容量瓶中，重复萃取3-4次，用正己烷定容至50ml。精密吸取上述溶液2ml至25ml容量瓶中，氮气吹干，加入4ml乙醇超声溶解，再加入4ml酶溶液混匀，放入37℃水浴中酶解45min，冷却后用乙醇定容至25ml，用于高效液相色谱测定。
1.3高效液相色谱条件
色谱柱：YMC Carotenoid(250×4.6mm，5μm)或等效色谱柱；
流动相：甲醇：乙酸乙酯＝70:30；
流速：1.0ml/min；
检测波长：445nm；
柱温：30℃；
进样量：20ul；
1.4计算
式中：
C样—由样品溶液的峰面积查标准曲线计算得到样品溶液的浓度，μg/mL；
W样—样品称重，g；
V—稀释体积，ml；
1.84—转换为叶黄素二棕榈酸酯和玉米黄质二棕榈酸酯的换算系数
1.5含量测定
不同浓度的叶黄素和玉米黄质标准溶液分别进样，测得各标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标做标准曲线，计算线性回归方程。然后对样品溶液进行测定，分别得到叶黄素和玉米黄质的峰面积，依据标准曲线计算得到样品溶液中叶黄素和玉米黄质的浓度，并结合样品称重和稀释体积，计算得到样品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量分别为1020.3ug/g和140.5ug/g，回收率分别为99.2％和99.8％。
实施例2：
1.0标准溶液配制
分别精密称取10mg叶黄素和玉米黄质对照品于50ml棕色容量瓶中，加入25ml乙醇，超声溶解，用乙醇定容至刻度，作为储备液。将储备液用乙醇稀释成每1ml分别含0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug的标准溶液。
1.1酶溶液配制
称取适量胆固醇酯酶用水溶解，使溶液的酶活力浓度为8.0U/ml。
1.2样品溶液制备
取20粒胶囊内容物(产品名称：蓝莓叶黄素酯凝胶糖果，批号：V19070,生产单位：浙江艾兰得生物科技有限公司)，精密称取1.0g内容物于50ml离心管中，分别加入5ml去离子水、0.2g胰酶和0.2g果胶酶，在40℃恒温水浴中振摇溶解后，加入2g氯化钠和25ml二甲亚砜继续在40℃恒温水浴中振摇10min，冷却至室温，加入10ml石油醚振摇2min后离心，移取上清液层至50ml容量瓶中，重复萃取3-4次，用石油醚定容至50ml。精密吸取上述溶液4ml至25ml容量瓶中，氮气吹干，加入3ml四氢呋喃超声溶解，再加入3ml酶溶液混匀，放入37℃水浴中酶解45min，冷却后用乙醇定容至25ml，用于高效液相色谱测定。
1.3高效液相色谱条件
色谱柱：YMC Carotenoid(250×4.6mm，5μm)或等效色谱柱；
流动相：甲醇：乙酸乙酯＝90:10；
流速：1.5ml/min；
检测波长：445nm；
柱温：30℃；
进样量：20ul；
1.4计算
式中：
C样—由样品溶液的峰面积查标准曲线计算得到样品溶液的浓度，μg/mL；
W样—样品称重，g；
V—稀释体积，ml；
1.84—转换为叶黄素二棕榈酸酯和玉米黄质二棕榈酸酯的换算系数
1.5含量测定
不同浓度的叶黄素和玉米黄质标准溶液分别进样，测得各标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标做标准曲线，计算线性回归方程。然后对样品溶液进行测定，分别得到叶黄素和玉米黄质的峰面积，依据标准曲线计算得到样品溶液中叶黄素和玉米黄质的浓度，并结合样品称重和稀释体积，计算得到样品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量分别为4625.8ug/g和805.7ug/g，回收率分别为99.5％和99.1％。
实施例3：
1.0标准溶液配制
分别精密称取10mg叶黄素和玉米黄质对照品于50ml棕色容量瓶中，加入25ml乙醇，超声溶解，用乙醇定容至刻度，作为储备液。将储备液用乙醇稀释成每1ml分别含0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug的标准溶液。
1.1酶溶液配制
称取适量磷脂酶用水溶解，使溶液的酶活力浓度为3.0U/ml。
1.2样品溶液制备
取20粒片剂(产品名称：叶黄素酯泡腾片，批号：HC2021060，生产单位：江苏艾兰得营养品有限公司)，粉碎，精密称取4.0g样品于50ml离心管中，分别加入8ml去离子水、0.2g胰酶和0.2g果胶酶，在60℃恒温水浴中振摇溶解后，加入2g氯化钠和20ml异丙醇继续在60℃恒温水浴中振摇10min，冷却至室温，加入10ml乙酸乙酯振摇2min后离心，移取上清液层至50ml容量瓶中，重复萃取3-4次，用乙酸乙酯定容至50ml。精密吸取上述溶液1ml至25ml容量瓶中，氮气吹干，加入2ml异丙醇超声溶解，再加入5ml酶溶液混匀，放入37℃水浴中酶解45min，冷却后用乙醇定容至25ml，用于高效液相色谱测定。
1.3高效液相色谱条件
色谱柱：YMC Carotenoid(250×4.6mm，5μm)或等效色谱柱；
流动相：甲醇：乙酸乙酯＝80:20；
流速：0.8ml/min；
检测波长：445nm；
柱温：30℃；
进样量：20ul；
1.4计算
式中：
C样—由样品溶液的峰面积查标准曲线计算得到样品溶液的浓度，μg/mL；
W样—样品称重，g；
V—稀释体积，ml；
1.84—转换为叶黄素二棕榈酸酯和玉米黄质二棕榈酸酯的换算系数
1.5含量测定
不同浓度的叶黄素和玉米黄质标准溶液分别进样，测得各标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标做标准曲线，计算线性回归方程。然后对样品溶液进行测定，分别得到叶黄素和玉米黄质的峰面积，依据标准曲线计算得到样品溶液中叶黄素和玉米黄质的浓度，并结合样品称重和稀释体积，计算得到样品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量分别为1564.8ug/g和205.9ug/g，回收率分别为99.7％和99.6％。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (3)
1.一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤(1)：标准溶液的配置
分别称取适量叶黄素和玉米黄质对照品，用乙醇溶解，制成每1ml分别含0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug的标准溶液；
步骤(2)：酶溶液的制备
称取适量酶用水溶解，使溶液的酶活力浓度为2～10U/m1；
步骤(3)：样品溶液的制备
称取1.0～5.0g样品于50ml离心管中，分别加入5～10ml水、0.1～0.5g胰酶和0.1～0.5g果胶酶，在40～60℃恒温水浴中振摇溶解后，加入1～5g氯化钠和15～25ml溶剂I继续在40～60℃恒温水浴中振摇10min，冷却至室温，加入10ml萃取剂振摇2min后离心，移取上清液层至50ml容量瓶中，重复萃取3～4次，用萃取剂定容至50ml；
精密吸取上述溶液1～5ml至25ml容量瓶中，氮气吹干，加入2～5ml溶剂II超声溶解，再加入2～5ml酶溶液混匀，放入37℃水浴中酶解45min，冷却后用乙醇定容至25ml，用于高效液相色谱测定；
步骤(4)：设定高效液相色谱实验条件
色谱柱：YMC Carotenoid 250×4.6mm，5μm或等效色谱柱；
流动相：甲醇与乙酸乙酯混合溶液；
流速：0.8～1.5ml/min；
检测波长：445nm；
柱温：30℃；
进样量：20ul；
步骤(5)：标准曲线的建立
将步骤(1)得到的标准溶液在步骤(4)的条件下进行液相分析，测得各标准溶液的峰面积，以各标准溶液峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立标准曲线；
步骤(6)：含量测定
将步骤(3)得到的样品溶液在步骤(4)的条件下进行液相分析，测得其峰面积，与标准曲线进行对比，得到其浓度，结合样品的称重，计算得到样品中叶黄素酯和玉米黄质酯的含量；
步骤(2)中酶为脂肪酶、胆固醇酯酶或磷脂酶；
步骤(3)中溶剂I为二甲亚砜、乙醇、异丙醇或四氢呋喃，萃取剂为正己烷、石油醚、***或乙酸乙酯，溶剂II为乙醇、异丙醇、丙酮或四氢呋喃；
步骤(4)中甲醇与乙酸乙酯的混合溶液，其中乙酸乙酯占比10％～30％。
2.根据权利要求1所述的一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法，其特征是：所述步骤(6)中叶黄素酯和玉米黄质酯含量的计算公式为：
式中：
C样-由样品溶液的峰面积查标准曲线计算得到样品溶液的浓度，μg/mL；
W样-样品称重，g；
V-稀释体积，ml；
1.84-转换为二棕榈酸酯的换算系数。
3.根据权利要求1所述的一种叶黄素酯和玉米黄质酯的测定方法，其特征是：所述的样品是食品中的片剂、胶囊、粉剂或软糖制剂。
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