CN104293875A - 生物酶催化制备(s)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用生物酶催化制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法，包括以下步骤：在水浴恒温30℃的反应器中加入外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和磷酸钠缓冲溶液，搅拌后加入青霉素G酰化酶，控制搅拌转速为100-500r/min，控制反应时间20-60小时，持续搅拌直至反应结束，最后回收青霉素G酰化酶。本发明的有益之处在于：采用PGA作催化剂，利用其活性、高选择性和对底物的专一性，在常温、常压下进行反应，一步制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯，既省去了氯苯甘氨酸中反应性基团的保护与去保护过程，又获得了光学纯度更高的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体，对映体对量值达95％以上；本发明的方法操作过程简捷易控制，制备过程能耗低，排放少，是环境友好绿色化制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法，具体涉及利用生物酶催化制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法，属于医药技术领域。
背景技术
2-氯苯甘氨酸是具有生物活性的非天然氨基酸，(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯是治疗血栓性疾病新药氯吡格雷的关键手性结构单元。氯吡格雷是一种安全、有效的血小板聚集抑制剂，具有药效显著、安全和耐受性强等特性，目前已大量用于临床治疗。
氯吡格雷是手性药，其S-构型的分子具有强的血小板凝聚抑制活性，耐受性是R-构型的40倍，且R-构型用药后会产生抽搐副作用，因此氯吡格雷是以S-构型作为药物进行销售。用(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体直接合成(S)-氯吡格雷，既省去了手性试剂后拆分过程，又提高了原料的利用率和产品的质量，是生产氯吡格雷手性药最理想的途径。化学法制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯通常用D-樟脑磺酸和L-酒石酸等手性试剂进行拆分(US6812363B2，2002-10-15)，但该方法所需要的手性拆分剂昂贵，产品纯度较低，操作过程繁杂，生产效率低下。
因此，工业化生产迫切需要开发一种高效、低成本的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的制备技术。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效、低成本的、利用生物酶催化制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
生物酶催化制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在水浴恒温30℃的反应器中加入外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和磷酸钠缓冲溶液，前述外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为20-200g/L，前述磷酸钠缓冲溶液的pH值为6.0-9.0，浓度为0.01-0.50mol/L；
(2)搅拌后加入青霉素G酰化酶，青霉素G酰化酶与外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：1～100；
(3)继续搅拌使青霉素G酰化酶与外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯充分接触，控制搅拌转速为100-500r/min，控制反应时间20-60小时，持续搅拌直至反应结束；
(4)反应结束后，回收青霉素G酰化酶。
前述的制备方法，其特征在于，前述外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为50-150g/L。
前述的制备方法，其特征在于，前述磷酸钠缓冲溶液的pH值为7.0-8.0，浓度为0.05-0.20mol/L。
前述的制备方法，其特征在于，前述青霉素G酰化酶为商品固定化青霉素G酰化酶IPA750或Eupergit C。
前述的制备方法，其特征在于，前述青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1:10～50。
前述的制备方法，其特征在于，控制搅拌转速为200-400r/min。
本发明的有益之处在于：
1、本发明采用青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,EC 3.5.1.11，简称PGA)作催化剂，利用PGA的高活性、高选择性和对底物的专一性，在常温、常压下进行反应，一步制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯，既省去了氯苯甘氨酸中反应性基团的保护与去保护过程，又获得了光学纯度更高的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体，对映体对量值达95％以上；
2、目前青霉素G酰化酶已能高效表达和大批量的生产，成本低，其催化外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯发生不对称水解反应，操作过程简捷易控制，制备过程能耗低，排放少，是环境友好绿色化制备方法。
具体实施方式
本发明生物酶催化制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法，其关键在于：青霉素G酰化酶催化外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯发生不对称水解，即：
利用PGA的高活性、高选择性和对底物的专一性，在常温、常压下进行水解反应，一步制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯，既省去了氯苯甘氨酸中反应性基团的保护与去保护过程，又获得了光学纯度更高的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体。
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
在反应器中加入5.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.2mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为100g/L，然后加入0.1g固定化青霉素G酰化酶IPA750，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：50，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应30小时，最后分离出固定化酶。
反应器可以采用工业上常用的间歇式反应器。
实施例2
在反应器中加入5.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.2mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为100g/L，然后加入0.2g固定化青霉素G酰化酶IPA750，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为2：50，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应20小时，最后分离出固定化酶。
实施例3
在反应器中加入5.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.01mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为100g/L，然后加入0.1g固定化青霉素G酰化酶IPA750，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：50，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应30小时，最后分离出固定化酶。
实施例4
在反应器中加入5.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 8.0、0.05mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为100g/L，然后加入0.1g固定化青霉素G酰化酶IPA750，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：50，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应30小时，最后分离出固定化酶。
实施例5
在反应器中加入2.5g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.2mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为50g/L，然后加入0.1g固定化青霉素G酰化酶Eupergit C，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：25，水浴控温恒温于30℃，控制转速为200r/min，反应30小时，最后分离出固定化酶。
实施例6
在反应器中加入2.5g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为50g/L，然后加入0.1g固定化青霉素G酰化酶Eupergit C，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：25，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应30小时，最后分离出固定化酶。
实施例7
在反应器中加入5.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 7.0、0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为100g/L，然后加入0.1g固定化青霉素G酰化酶Eupergit C，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：50，水浴控温恒温于30℃，控制转速为400r/min，反应40小时，最后分离出固定化酶。
实施例8
在反应器中加入1.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 8.0、0.01mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为20g/L，然后加入0.01g固定化青霉素G酰化酶IPA750，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：100，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应30小时，最后分离出固定化酶。
实施例9
在反应器中加入10.0g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 8.0、0.05mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为200g/L，然后加入10.0g固定化青霉素G酰化酶Eupergit C，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：1，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应60小时，最后分离出固定化酶。
实施例10
在反应器中加入7.5g外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和50mL pH 8.0、0.01mol/L磷酸钠缓冲溶液，此时外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为150g/L，然后加入0.75g固定化青霉素G酰化酶IPA750，此时固定化青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：10，水浴控温恒温于30℃，控制转速为300r/min，反应50小时，最后分离出固定化酶。
需要说明的是，在本发明的制备方法中：
(1)磷酸钠缓冲溶液的pH值可以在6.0-9.0范围内调整，优选的pH值为7.0-8.0，磷酸钠缓冲溶液的浓度可以在0.01-0.50mol/L范围内调整，优选的浓度为0.05-0.20mol/L，在上述范围内青霉素G酰化酶均具有较高的催化活性；
(2)根据实际生产过程的需要，搅拌转速可以在100-500r/min范围内调整。
反应液中(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯和(R)-2-氯苯甘氨酸由装有进口手性柱的高效液相色谱仪进行定量分析，(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯和(R)-2-氯苯甘氨酸的对映体过量值分别用ees(％)和eep(％)表示，反应总转化率用C(％)表示，其计算如下：
ees＝(cSS–cRS)/(cSS+cRS)
eep＝(cRP–cSP)/(cRP+cSP)
C(％)＝ees/(ees+eep)
式中，cSS为(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度，mol/L；
cRS为(R)-2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度，mol/L；
cRP为(R)-2-氯苯甘氨酸的浓度，mol/L；
cSP为(S)-2-氯苯甘氨酸的浓度，mol/L。
采用现有的方法制备而来的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体，其光学纯度一般可以达到70-90％。
采用本发明的方法制备而来的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体，其光学纯度见表1。
表1(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的光学纯度
| 组别 | 对映体过量值ees | 转化率C |
| 实施例1 | 96.5％ | 69.2％ |
| 实施例2 | 95.3％ | 69.9％ |
| 实施例3 | 97.1％ | 70.9％ |
| 实施例4 | 95.1％ | 70.2％ |
| 实施例5 | 95.8％ | 72.0％ |
| 实施例6 | 95.5％ | 69.4％ |
| 实施例7 | 95.1％ | 68.4％ |
| 实施例8 | 96.1％ | 70.5％ |
| 实施例9 | 95.0％ | 66.1％ |
| 实施例10 | 95.3％ | 68.0％ |
由此可见，本发明用青霉素G酰化酶催化外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯，突出的优势是获得的(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体纯度更高，ees可以达到95％以上。
另外，由前面的各实施例还可以看出，本发明的方法具有制备过程简捷、反应条件温和、成本低等特点，非常适合工业化生产。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.生物酶催化制备(S)-2-氯苯甘氨酸甲酯单一对映体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在水浴恒温30℃的反应器中加入外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯和磷酸钠缓冲溶液，所述外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为20-200g/L，所述磷酸钠缓冲溶液的pH值为6.0-9.0，浓度为0.01-0.50mol/L；
(2)搅拌后加入青霉素G酰化酶，青霉素G酰化酶与外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1：1～100；
(3)继续搅拌使青霉素G酰化酶与外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯充分接触，控制搅拌转速为100-500r/min，控制反应时间20-60小时，持续搅拌直至反应结束；
(4)反应结束后，回收青霉素G酰化酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述外消旋2-氯苯甘氨酸甲酯的浓度为50-150g/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸钠缓冲溶液的pH值为7.0-8.0，浓度为0.05-0.20mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述青霉素G酰化酶为商品固定化青霉素G酰化酶IPA750或Eupergit C。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述青霉素G酰化酶与2-氯苯甘氨酸甲酯的质量比为1:10～50。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，控制搅拌转速为200-400r/min。
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