CN104289210B

CN104289210B - 一种苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法

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Publication number: CN104289210B
Application number: CN201410320290.8A
Authority: CN
Inventors: 杨永刚; 李艺; 李宝宗; 王庆峰
Original assignee: SOOCHIRAL CHEMICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Clin Mass Spectrum Medical Instrument Co ltd; Jiangsu Clin Chromaticness Medical Instrument Co ltd; Shanghai Aikesaimo Medical Instrument Co ltd; Shanghai Clinmeta Co ltd
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2034-07-02
Also published as: CN104289210A

Abstract

本发明提供一种基于苯丙氨酸的手性色谱柱固定相的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：第一步，硅胶球表面处理；第二步，苯丙氨酸手性选择器单体的制备；第三步，手性色谱柱固定相的制备。本发明方法具有的有益效果是：1)工艺路线简单、成本低廉、操作方便；2)制备的手性色谱柱固定相具有较宽的手性选择性；3)流动相适用范围广，固定相结合力好，不易流失，使用寿命长；4)分离时间短，不拖尾，柱效高等。

Description

一种苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法

技术领域

本发明涉及属于液相色谱手性分离领域，具体涉及一种基于苯丙氨酸的新型手性色谱柱固定相的制备方法。

背景技术

手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。生命现象中的化学过程都是在高度不对称的环境中进行的。众所周知，手性化合物中单一光学纯对映体表现出不同毒性、药理以及生物活性等特性，所以分离和纯化对映体在制药等很多科学领域得到越来越多的重视。

目前市场上出售的处方药中超过60％的药物分子中含有一个或多个手性中心，而这类手性药物中的绝大多数是以外消旋的形式在市场销售。而手性药物往往只有对映体的一种是有效成分，而另一种没有治疗效果甚至还会引起毒副作用，例如反应停，早在1960年用作镇静和***，用于治疗妊娠期的不良反应。但是后来发现，怀孕早期的妇女服用此药会引起胎儿严重畸形，使该药停止使用。1979年发现，仅R-(+)对映体沙利度安具有镇静和安眠作用。而S-(-)对映体对胎儿有致畸作用。到20世纪80年代以后人们才逐渐认识到手性在药物中的重要性。

中国专利申请号99117305.8公开了一种手性配体交换色谱固定相及其制备方法，它以L-苯丙氨酸为原料，制备一类新型手性选择器，将其于涂敷于固定相上，可实现对氨基酸样品的直接拆分。其不足之处在于分离所需时间较长，后流出组分拖尾较严重，而且固定相容易流失，限制了它的使用寿命。中国申请专利(专利号CN200480043803.X)公开了一种化学键合手性固定相及制备方法，使用脯氨酸作为手性选择剂，通过化学键合的方法将其键合于载体上，可对多种不同类型的手性化合物实现分离，其不足之处在于制备繁琐，柱效不高，稳定性不好。本发明制备固定相工艺简单、成本低廉、操作方便；制备的手性色谱柱固定相具有较宽的手性选择性；流动相适应范围广，固定相结合力好不易流失，使用寿命长等；且分离时间短，不拖尾，柱效高。

发明内容

本发明涉及一种基于苯丙氨酸的手性色谱柱固定相的制备方法，以苯丙氨酸衍生物为母体，设计合成了具有下列通式的手性固定相：

载体-连接基-多肽基团-NH-P

其中，n为1～10的任意整数；

R1为L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸中的苯甲基；

P代表苯胺、3，5-二甲基苯胺、3，5-二氯苯胺、3，5-二甲氧基苯胺、3，5-二氟苯胺、α-萘胺等芳香胺类化合物中的芳基为芳基；

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种基于苯丙氨酸的手性色谱柱固定相的制备方法，

所述制备方法包括以下步骤：

第一步，载体的前处理：

将硅胶球加入茄形瓶，再加入适量的浓盐酸，加热回流1～24h，过滤，水洗至呈中性，依次用丙酮和无水***冲洗，真空干燥；

第二步，手性单体的制备：

(1)Z-苯丙氨酸的合成

冰水浴下在装有1.0L去离子水的三颈瓶中依次加入0.1～10mol NaOH，0.1～10mol苯丙氨酸(PheCOOH)，搅拌全溶后，滴加0.1～10mol苄氧酰氯和0.1～10mol NaOH同体积去离子水溶液，室温搅拌5～20小时。用***萃取，在萃取的水相中加入浓盐酸，调节pH值为酸性，加入乙酸乙酯萃取，水洗至中性，分出的有机相用无水Na₂SO₄干燥，滤去硫酸钠，旋转蒸发出去乙酸乙酯，之后用CCl₄及石油醚重结晶，干燥后即得Z-氨基酸。

(2)Z-苯丙氨酸-芳香胺的反应

称取0.1～10mol的Z-苯丙氨酸加入三颈瓶中，加入50～1000mL N，N-二甲基甲酰胺加热搅拌溶解，加入0.1～10mol的苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，搅拌1～5小时后加入0.1～10mol的三乙胺，称取0.1～10mol芳香胺溶解于50～500mLN，N-二甲基甲酰胺中加入到混合液中，常温搅拌1～10h，45℃下搅拌1～50h，然后向三颈瓶中加入去离子水析出沉淀，过滤，滤饼真空干燥，用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥。

(3)脱去苄氧基保护：

250mL的三颈瓶中加入0.1～10mol步骤2)产物，加入乙醇溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，通入H₂反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用四氢呋喃(THF)和石油醚重结晶，得到产品。

(4)与Z-苯丙氨酸反应

称取0.1～10mol的Z-苯丙氨酸在三颈瓶中，加入50～1000mL的N，N-二甲基甲酰胺加热搅拌溶解，加入0.1～10mol HBTU，搅拌1～5小时后加入0.1～10mol的三乙胺，称取0.1～10mol的步骤(3)产物溶解于50～500mL N，N-二甲基甲酰胺中加入到混合液中，常温下搅拌1～10小时，45℃下搅拌1～50小时，然后向三颈瓶中加入去离子水析出沉淀，过滤。滤饼真空干燥，用四氢呋喃重结晶，抽滤，真空干燥。

(5)Z-苯丙氨酸二肽衍生物的合成

250mL的三颈瓶中加入0.1～10mol步骤4)产物，加入四氢呋喃溶解，加入少量用四氢呋喃稀释的Pd/C，通入H₂反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用四氢呋喃(THF)和石油醚重结晶，得到产物。

(6)手性单体的合成

氮气保护下向反应瓶中加入0.1mol～10mol步骤5)的产物，然后加入10～1000mL二氯甲烷，搅拌溶解。然后加入用二氯甲烷稀释的0.1～10mol异氰酸酯基硅氧烷。室温反应10-24小时，在N₂保护下滤去滤液，滤饼分别用50-500mL重蒸的二氯甲烷，石油醚洗涤得到产物。

第三步，手性固定相的制备：

取1～500mg手性单体加入茄形瓶中，加入步骤1中处理的硅胶球和适量甲苯，加热回流，用分水器除水1～100小时后过滤，用丙酮、***依次冲洗固体，真空干燥固体相。用标准匀浆填充法将得到的手性固定相装入4.6mm×250mm HPLC柱中。

优化的，所述第一步中的硅胶求为商品化硅胶球，规格为粒径5-20μm，孔径50-100埃。

优化的，所述第二步(1)中的苯丙氨酸为L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸。

优化的，所述第二步(2)中的所涉及的芳香胺为苯胺、3，5-二甲基苯胺、3，5-二氯苯胺、3，5-二甲氧基苯胺、3，5-二氟苯胺、α-萘胺等。

优化的，所述第二步(6)中的异氰酸酯基硅氧烷为3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、4-异氰酸酯基丁基三乙氧基硅烷、5-异氰酸酯基戊基三乙氧基硅烷、6-异氰酸酯基己基三乙氧基硅烷、7-异氰酸酯基庚基三乙氧基硅烷、8-异氰酸酯基辛基三乙氧基硅烷、9-异氰酸酯基寅基三乙氧基硅烷，10-异氰酸酯基癸基三乙氧基硅烷中的一种。

附图说明

图1为制备的CSP1的苯丙氨酸手型固定相的结构式。

图2为制备的CSP2的苯丙氨酸手型固定相的结构式。

图3为制备的CSP3的苯丙氨酸手型固定相的结构式。

图4为制备的CSP4的苯丙氨酸手型固定相的结构式。

图5为CSP2制备的固定相HPLC手性分离效果图。

图6为CSP3制备的固定相HPLC手性分离效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。

具体实施例1：L-苯丙氨酸手性固定相CSP1的制备

1.载体的前处理：

取5.0g硅胶球，加入茄形瓶，再加入10mL的12mol/L的浓盐酸，加热回流2h，过滤，水洗至中性，依次用丙酮和无水***冲洗，真空干燥。

2.手性单体的合成

1)Z-L-PheCOOH的合成

冰水浴下在装有1.0L去离子水的三颈瓶中依次加入0.5mol NaOH，搅拌溶解，再加入0.5mol L-PheCOOH，搅拌全溶后，滴加0.5mol苄氧酰氯和0.5mol NaOH同体积去离子水溶液，室温下搅拌12小时。用***萃取，在萃取出的水相中加入浓盐酸，调节pH值为2～3，加入乙酸乙酯萃取，水洗至中性，分出的有机相用无水Na₂SO₄干燥，滤去硫酸钠，旋转蒸发除去乙酸乙酯，之后用CCl₄及石油醚重结晶干燥后得到Z-L-PheCOOH；

2)Z-L-PheCOOH与苯胺反应

称取0.2mol的Z-L-PheCOOH在三颈瓶中，再加入500mL N，N-二甲基甲酰胺加热搅拌溶解，加入0.2mol HBTU，搅拌1小时后加入0.2mol三乙胺，称取0.2mol苯胺溶解于50mLN，N-二甲基甲酰胺中加入到混合液中，常温搅拌1小时，45℃下搅拌50h，然后向三颈瓶中加入去离子水析出沉淀，过滤，滤饼真空干燥。用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥。

3)脱去苄氧基保护：

250mL的三颈瓶中加入0.1mol上一步骤产物，加入乙醇加热溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，通入H₂反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用THF和石油醚重结晶，得到产品。

4)与Z-L-苯丙氨酸反应：

称取0.1mol的Z-L-PheCOOH在三颈瓶中，加入500mL的N，N-二甲基甲酰胺加热搅拌溶解，加入0.1mol HBTU，搅拌1小时后加入0.1mol的三乙胺，称取0.1mol的步骤(3)产物溶解于50mL N，N-二甲基甲酰胺中加入到混合液中，常温下搅拌1小时，45℃下搅拌50小时，然后向三颈瓶中加入去离子水析出沉淀，过滤。滤饼真空干燥，用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥。

5)Z-L-PheCOOH二肽衍生物的合成

250mL的三颈瓶中加入0.1mol步骤(4)产物，加入四氢呋喃溶解，加入少量用四氢呋喃稀释的Pd/C，通入H₂反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用四氢呋喃(THF)和石油醚重结晶，得到产品。

6)手性单体的合成

氮气保护下向反应瓶中加入0.1mol步骤5)产物，然后加入100mL重蒸的二氯甲烷，搅拌溶解。然后加入用二氯甲烷稀释的0.1mol 3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷。室温反应10小时，在氮气保护下滤去滤液，滤饼分别用500mL重蒸的二氯甲烷，石油醚洗涤得到产物。

3.手性固定相CSP1的制备：

取500mg手性单体样品于茄形瓶中，然后加入在步骤1中处理的硅胶球和适量甲苯，加热回流用分水器除水50小时后过滤，依次用丙酮、***冲洗固体，真空干燥固定相。用标准匀浆填充法将所得到的手性固定相装入4.6mm×250mmHPLC柱中。

Claims

1.一种苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法，其特征是：所述制备方法包括以下步骤，

1)载体硅胶球的前处理：

取5.0g硅胶球加入茄形瓶，再加入10mL的12mol/L的浓盐酸，加热回流1～24h；过滤除去浓盐酸，水洗硅胶球至呈中性，依次用丙酮和无水***冲洗，真空干燥；

2)苯丙氨酸手性单体的制备：

(1)Z-苯丙氨酸的合成：

冰水浴下在装有1.0L去离子水的三颈瓶中依次加入0.1～10mol氢氧化钠，0.1～10mol苯丙氨酸，搅拌全溶后，向溶液中滴加含有0.1～10mol苄氧酰氯和0.1～10mol氢氧化钠的1.0L去离子水溶液，室温下搅拌5～20h；用***萃取，在萃取出的水相中加入浓盐酸，至水相呈酸性，加入乙酸乙酯萃取，水洗至呈中性，分出的有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯，滤去硫酸钠；之后用四氯化碳及石油醚重结晶，干燥后即得Z-苯丙氨酸；

(2)Z-苯丙氨酸-芳香胺的反应：

称取0.1～10mol由步骤(1)制得的Z-苯丙氨酸加入三颈瓶中，再加入50～1000mL N，N-二甲基甲酰胺，加热搅拌溶解，再加入0.1～10mol苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯，搅拌1～5h后加入0.1～10mol三乙胺，称取0.1～10mol芳香胺溶解于50～500mLN，N-二甲基甲酰胺中加入到混合液中，常温搅拌1～10h，45℃下搅拌1～50h，然后向三颈瓶中加入去离子水析出沉淀，过滤，滤饼真空干燥，用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥；

(3)脱去苄氧基保护：

向250mL的三颈瓶中加入0.1～10mol步骤(2)产物，加入乙醇溶解，加入少量用乙醇稀释的钯碳，通入氢气反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去钯碳，滤液浓缩干后，用四氢呋喃和石油醚重结晶；

(4)与Z-苯丙氨酸反应：

称取0.1～10mol的Z-苯丙氨酸在三颈瓶中，加入50～1000mL的N，N-二甲基甲酰胺加热搅拌溶解，加入0.1～10mol苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯，搅拌1～5h后加入0.1～10mol的三乙胺，称取0.1～10mol的步骤(3)产物溶解于50～500mL N，N-二甲基甲酰胺中加入到混合液中，常温下搅拌1～10h，45℃下搅拌1～50h，然后向三颈瓶中加入去离子水析出沉淀，过滤，滤饼真空干燥，用四氢呋喃重结晶，抽滤，真空干燥；

(5)Z-苯丙氨酸二肽衍生物的合成：

向250mL的三颈瓶中加入0.1～10mol步骤(4)产物，加入四氢呋喃溶解，加入少量用四氢呋喃稀释的钯碳，通入氢气反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去钯碳，滤液浓缩干后，用四氢呋喃，和石油醚重结晶；

(6)手性单体的合成：

氮气保护下向反应瓶中加入0.1mol～10mol步骤(5)产物，然后加入10～1000mL二氯甲烷，搅拌溶解，再加入用二氯甲烷稀释的0.1～10mol异氰酸酯基硅氧烷，室温反应10-24h，在氮气保护下滤去滤液，滤饼分别用50-500mL重蒸的二氯甲烷，石油醚洗涤，即得手性单体；

3)手性固定相的制备：

取1～500mg在步骤2)中制得的手性单体加入茄形瓶中，然后加入在步骤1)中制得的经过前处理载体硅胶球和适量甲苯，加热回流，用分水器除水1～100h后过滤，依次用丙酮、***冲洗滤出的固体，真空干燥，即得该苯丙氨酸手性色谱柱固定相。

2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法，其特征是：该苯丙氨酸手性色谱柱固定相的结构通式为，

其中，n为1～10的任意整数；R₁为苯甲基；P为芳基。

3.根据权利要求1所述的苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述的苯丙氨酸为L-苯丙氨酸或者D-苯丙氨酸。

4.根据权利要求1所述的苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法，其特征是：步骤(2)中所述的芳香胺为苯胺、3，5-二甲基苯胺、3，5-二氯苯胺、 3，5-二甲氧基苯胺和α-萘胺中的一种。

5.根据权利要求1所述的苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法，其特征是：步骤(6)中所述的异氰酸酯基硅氧烷为3-异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷、4-异氰酸酯基丁基三乙氧基硅烷、5-异氰酸酯基戊基三乙氧基硅烷、6-异氰酸酯基己基三乙氧基硅烷、7-异氰酸酯基庚基三乙氧基硅烷、8-异氰酸酯基辛基三乙氧基硅烷、9-异氰酸酯基寅基三乙氧基硅烷和10-异氰酸酯基癸基三乙氧基硅烷中的一种。

6.根据权利要求1-5任一所述的苯丙氨酸手性色谱柱固定相的制备方法，其特征在于：该苯丙氨酸手性色谱柱固定相用标准匀浆填充法装入4.6mm×250mm HPLC柱中。