CN104288750A - 红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2的应用。本发明的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2采用常规的化学合成的方法获得；红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2的分子量为1631.98Da，等电点为11.02，其全序列一级结构为RKCVRQNNKRVCK。本发明的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对体表创伤减少疤痕产生、加快疤痕修复有治疗或修复作用，能够在制备治疗体表创伤、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中应用。
Description
技术领域：
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2在促进皮肤修复、减少疤痕、加快疤痕修复的应用。
背景技术：
皮肤是机体与外界接触的第一道屏障，是机体免于脱水、损伤、感染的第一道防线，是维持内环境稳定和阻止微生物、化学物质等侵入的屏障。炎症、溃疡、严重烧伤、创伤、肿瘤术后以及先天性畸形等多种急慢性损伤引起的大面积的皮肤缺损和难愈性皮肤溃疡，会引发许多局部与全身各***的反应。皮肤缺损后细菌极易入侵繁殖，会引起机体水电解质紊乱、败血症休克、高代谢反应、多脏器功能衰竭等，使机体不能维持正常的自稳状态，甚至导致死亡。慢性皮肤溃疡的预后很差，其危害已不容忽视。由于该病慢性迁延、难以治愈且消耗甚大，给患者造成了很大的心理压力，严重影响患者的身体状况及生活质量。因此，开发出安全高效的促皮肤愈合药物，减少其发病率、降低其致残率、死亡率，从而减轻由此而产生的社会问题，提高广大患者的生活质量，已成为当前医药企业和科研工作者亟待解决的问题。
发明内容：
本发明的目的在于提供红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2在制备治疗体表创伤、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。
本发明的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2采用常规的化学合成的方法获得；红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2的分子量为1631.98Da，等电点为11.02，其全序列一级结构为RKCVRQNNKRVCK。
本发明的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2在制备治疗体表创伤、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。
本发明的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2，是由红瘰疣螈皮肤肽Tylotoin改造而来的皮肤修复肽，其在细胞和小鼠的动物模型上试验(试验方案为常规方法)的具体步骤如下：
1.细胞增殖活性检测:MTT法检测样品对HUVEC，NIH3T3，HaCAT细胞增殖的影响
将HUVEC，NIH3T3，HaCAT分别于含有10％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/ml)的DMEM培养液中培养，待长满培养瓶后，将细胞用含0.02％EDTA的0.25％胰酶消化后稀释成浓度为5×104个/ml的细胞悬液。取96孔细胞培养板，每孔中加180μl细胞悬液，在37℃，5％CO2培养箱中培养5-6h让细胞贴壁后，每孔加入用DMEM培养液稀释成不同浓度的待检测样品20μl，每个浓度作5个重复，空白对照加同样体积的DMEM培养液，培养24h后，每孔加入5mg/ml MTT(用细胞培养PBS缓冲液配制)染液20μl，孵育4h，能观察到蓝紫色结晶物。吸出培养液，每孔加150μl DMSO，在振荡器上振荡混匀，让结晶物充分溶解。于酶联检测仪上测定570nm处的光吸收值，参考波长为630nm。
2.细胞迁移活性
方法：采用细胞划痕法。将对数生长期的HaCAT细胞，以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的培养液制成细胞悬液，按1×106个/孔的密度接种到6孔板，置37℃，5％CO2培养箱内培养至细胞完全长满培养孔。吸弃培养液，PBS洗涤一次。用无菌枪头在每个试验孔中央垂直于培养孔自上而下划一条线，为保证宽度一致，尽量均匀用力。洗去培养液，并用PBS吹洗几次，洗去划痕产生的细胞团，使划痕边缘整齐。吸除PBS后，加入无血清的新鲜培养基和适当浓度的样品，显微镜下拍照后。继续置于细胞培养箱中培养。培养过程中，每隔6个小时观察一次，并拍照记录。为保证每次拍照选择的是相同的视野，接种细胞之前在每个培养孔底部用记号笔做好标记。所得图像数据用Image Pro Plus 6.0分析处理。在划痕每侧边缘均匀选取30个点后取其中线代表划痕边缘，测量划痕间距，并用以下公式计算划痕修复率：划痕修复率＝(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度。实验重复三次。
3.皮肤创伤修复动物实验
1.实验分组:选用6-8周，25g左右雄性昆明小鼠，随机分4组(每组10只)：Cathelicidin-TV2和control组、Cathelicidin-TV2和EGF组。
2.皮肤创伤模型制备:腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，以手术后小鼠能清醒为准。剪除背部毛，用碘伏消毒创伤范围，在小鼠背部左右两边用剪刀各开直径为9mm的等大等圆创口(去除全层皮肤)，单只分笼饲养。
3.创面处理：损伤模型建立后，用无菌纱布清理创口处血污，每只小鼠左侧创口涂抹对照(生理盐水或EGF)20μl，右侧创口涂抹样品(cathelicidin-TV2)(200μg/ml)20μl，自然暴露创口，每天上午、下午各给药1次，并观察记录创口愈合情况。分别在创伤后第0、2、4、6、8、10天，拍照创面。用AutoCAD2004绘图软件计算创面不同时间段创口面积变化。
本发明的有益效果在于：红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对体表创伤减少疤痕产生、加快疤痕修复有治疗或修复作用，能够在制备治疗体表创伤、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中应用。
附图说明：
图1红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对HUVEC细胞增殖的影响。
图2红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对NIH3T3细胞增殖的影响。
图3红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对HaCAT细胞增殖的影响。
图4红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对角质细胞迁移活性。
图5红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对角质细胞的划痕修复率。
图6红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对小鼠皮肤创面的修复。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明作进一步的详述。
本实施例所用的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2采用常规的化学合成的方法获得；红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2的分子量为1631.98Da，等电点为11.02，其全序列一级结构为RKCVRQNNKRVCK。
本实施例所用的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2在细胞和小鼠的动物模型上试验，其试验方案为常规方法，具体步骤同发明内容部分的描述。
实施例1：
红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对HUVEC细胞增殖的影响。
如图1所示，cathelicidin-TV2在不同浓度1、5、10和20μg/ml下，与对照相比，570nm处的光吸收值明显逐渐升高，浓度在10、20μg/ml时与对照相比有显著差异。表明cathelicidin-TV2能够促进HUVEC的体外增殖，且有明显浓度依赖性。
实施例2：
红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对NIH3T3细胞增殖的影响。
Cathelicidin-TV2在不同浓度1、5、10和20μg/ml下，与对照相比，570nm处的光吸收值轻微升高，浓度在10、20μg/ml时与对照相比有显著差异(图2)。表明cathelicidin-TV2能够促进NIH3T3的体外增殖。
实施例3：
红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对HaCAT细胞增殖的影响。
cathelicidin-TV2在不同浓度1、5、10和20μg/ml下，与对照相比，570nm处的光吸收值逐渐升高(图3)。表明Cathelicidin-TV2能够促进HaCAT的体外增殖。
实施例4：
红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对角质细胞迁移活性和划痕修复率
采用细胞划痕法检测了cathelicidin-TV2在50μg/ml浓度能明显促进HaCAT细胞迁移活性(图4)。cathelicidin-TV2在作用24，48小时后，与对照组相比有明显的差别，24h和48h划痕修复率分别达到60％和80％(图5)。说明cathelicidin-TV1和-TV2具有促进角质细胞迁移的作用。
实施例5：
红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2对小鼠皮肤创面的修复。
在小鼠背部左右两侧各开等大等圆全皮层创口后，分别给与cathelicidin-TV2，EGF(浓度均为200μg/ml)和生理盐水各20μl，一天两次。在治疗后第0、2、4、6、8、10天，分别拍照创面。
结果如图6所示：在治疗后2天cathelicidin-TV2、EGF治疗组和生理盐水对照组相比创口面积分别减小8％、10％、15％。接下来的几天，治疗组创口愈合速度相对于对照组明显加快，到第8天cathelicidin-TV2、EGF治疗组创口面积比对照组分别减小65％、70％。第10天左右，治疗组创口基本愈合，与对照组相比有显著差异。实验结果表明Cathelicidin-TV2有较强的促进创伤愈合的作用，其促进创伤愈合作用效果与EGF相近。
Claims (1)
1.分子量为1631.98Da，等电点为11.02，其全序列一级结构为RKCVRQNNKRVCK的红瘰疣螈皮肤修复肽cathelicidin-TV2在制备治疗体表创伤、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107973838A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-05-01 | 暨南大学 | 一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽及其应用 |
| CN113480628A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-10-08 | 贵州师范大学 | 一种贵州疣螈多肽tk-cath及其编码基因和应用 |
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2014
- 2014-10-23 CN CN201410570522.5A patent/CN104288750A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
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|---|
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| CN113480628B (zh) * | 2021-08-17 | 2022-06-21 | 贵州师范大学 | 一种贵州疣螈多肽tk-cath及其编码基因和应用 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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