CN104280472A - 液相色谱搭载vwd检测器测定水果中糖组分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，色谱条件为：检测器：VWD检测器；色谱柱：CARBOSepCHO-620，Ca型，6.5mm×300mm×10um；流动相：超纯水；流速：0.5ml/min；波长：190nm；柱温：80℃；时间：30min。本发明的液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，采用VWD检测器检测，并采用截止波长只有190nm的超纯水作为样品溶剂和流动相，而同时波长采用190nm，能有效的分离水果果肉中的多种糖，克服了传统的认为液相色谱搭载VWD检测器不适用于直接进行糖类物质检测的技术偏见，成本低廉，操作简单，灵敏度高，测定结果重复性好，准确度高。本发明确定的色谱条件可用于直接分离测定各种水果中的糖组分。

Description

液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法

技术领域

本发明涉及液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，属于化学工业中的化学分析及仪器分析技术领域。

背景技术

水果中含多种糖分，结构复杂且多为异构体，结构差异性小，采用常规方法对其分离鉴定比较困难。加之单糖没有发色基团，紫外吸收微弱甚至无，而且在通常情况下为电中性。因此植物组织中糖检测广泛应用的高效液相色谱法（HPLC），通常需要先进行衍生化，使糖类组分具有UV吸收、荧光特性或其它一些可测定的物理化学性质，再使用选择性检测器如紫外检测器、荧光检测器等进行检测，但这样处理步骤复杂，且会导致不稳定基团的分解，造成结果的偏差。目前常采用液相色谱搭载通用型检测器，如示差折光检测器(HPLC-RID)测定水果中糖组分，这样样品不需衍生化处理，可以直接测得糖分。但是相较紫外检测器而言，示差折光检测器（RID）易受外界环境干扰，对温度变化非常敏感，难以平衡，流动相的波动、洗脱液比的变化等都会明显影响折射率，灵敏度也不高。

可变波长检测器（VWD）是紫外检测器的一种，几乎所有的HPLC都配有这种检测器。VWD灵敏度和选择性高，对温度、流动相的波动和组成的变化不甚敏感；检测限可达10ng。液相色谱搭载可变波长检测器（HPLC-VWD）具有良好的光学性能，在预设的波长范围内检测结果灵敏、准确，广泛用于对大多数有紫外吸收的化合物的检测。然而本领域技术人员普遍认为VWD不适用于糖类物质的检测，这是因为糖类特别是葡萄糖等物质吸光度极其微弱，需要选很低的波长区间进行检测，而常用测定糖类的色谱条件如选择的流动相的截止波长都较高，会产生背景吸收；进一步地，有文献总结称选择性检测器无法对糖类组分进行检测(吕良，陈霈. 浅谈高效液相色谱仪检测器的发展与展望. 计量与测试技术，2008, 35（9）：76-77；武开业，雷林，吕庆华.高效液相色谱仪检测器分类及应用. 科技信息，2010, 13:789-791)，而VWD就是典型的选择性检测器。也就是说，一直存在VWD不适用于检测糖类物质的技术偏见。仅见谢志刚等（谢志刚，李博，陈书军，彭秀兰，王莹，尹鸿萍，奚涛. 高效液相色谱法快速检测氨基葡萄糖含量.分析测试学报，2012，31（5）：575-579）利用HPLC-VWD直接测定硫酸氨基葡萄糖氯化钾胶囊中氨基葡萄糖的含量，氨基葡萄糖是一种天然的氨基单糖，是葡萄糖中的一个羟基被氨基取代，多了一个N这样的元素，是直链伯胺，具有胺的性质，因此该文献报道的采用氨基柱，但是，无需衍生化直接对氨基葡萄糖进行测定的HPLC-VWD法对植物组织中广泛存在的、由C、H、O三元素构成的糖类物质，如蔗糖、葡萄糖、果糖等的检测不具有通用性。总之，目前为止，尚无HPLC-VWD用于直接检测水果以及其它植物组织中各种糖类的记载。本发明拟建立一种HPLC-VWD法直接测定水果中糖组分的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，该方法能有效分离测定水果果肉中的多种糖类物质。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，其步骤包括：

a、配制4种糖的混合标准溶液，绘制标准溶液曲线；

b、从水果果肉中提取糖配制样品溶液；

c、在色谱条件下对样品溶液进行高效液相色谱分析，并用VWD检测器进行检测；

d、将样品溶液的分析结果与标准曲线做比对，得出样品溶液中的糖含量；

其中高效液相色谱分析的色谱条件为：

检测器：VWD检测器；

色谱柱：CARBOSep CHO-620 ，Ca型，6.5 mm×300 mm×10 um；

流动相：超纯水；

流速：0.5 ml/min；

波长：190 nm；

柱温：80℃；

时间：30min。

进一步的，步骤b中从果肉中提取糖配制样品溶液的步骤为：称取1g果肉，加入7 ml 80%乙醇，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液定容到10ml；再吸取2ml到真空浓缩仪浓缩至干燥，用0.5ml超纯水溶解制得样品溶液，经0.22 mm有机滤头过滤。

进一步的，步骤a中配制4种糖的混合标准溶液的步骤为：分别准确称取1.6g各种糖的标准品，用超纯水溶解定容，制得浓度为160 g/L的标准溶液；分别移取1.00 ml各标准溶液，混合并用超纯水逐级稀释，制得混合标准溶液。

进一步的，所述糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇。

本发明的液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，采用VWD检测器检测，并采用截止波长只有190nm的超纯水作为样品溶剂和流动相，而同时波长采用190nm，能有效的分离检测水果果肉中的多种糖，而不需要将糖类物质先进行衍生化，克服了传统的认为液相色谱搭载VWD检测器不适用于直接进行糖类物质检测的技术偏见，成本低廉，操作简单，灵敏度高，测定结果重复性好，准确度高。本发明确定的色谱条件可用于直接分离测定各种水果中的糖组分。

附图说明

图1为4种糖混合标准溶液的HPLC图，其中1.蔗糖；2.葡萄糖；3. 果糖；4. 山梨醇。

图2为桃‘Big top’品种果肉样品中糖的HPLC图，其中1.蔗糖；2.葡萄糖；3. 果糖；4. 山梨醇。

图3为葡萄‘巨玫瑰’品种果肉样品中酚类化合物的HPLC图，其中1.蔗糖；2.葡萄糖；3. 果糖。

图4为苹果‘红富士’品种1.蔗糖；2.葡萄糖；3. 果糖；4. 山梨醇。

图5为香蕉‘开策’品种1.蔗糖；2.葡萄糖；3. 果糖；4. 山梨醇。

图6为梨‘丰水’品种1.蔗糖；2.葡萄糖；3. 果糖；4. 山梨醇。

下面结合附图对本发明的实施方式做进一步说明。

具体实施方式

试剂与设备：

4种糖标准品包括蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇，均购自Sigma公司，纯度≥98%。

超声波清洗器，离心机，真空浓缩仪，Agilent高效液相色谱***：1100系列，VWD（可变波长）检测器，CARBOSep CHO-620 （Ca型，6.5 mm×300 mm×10 um）。

实施例1

a、配制4种糖的混合标准溶液的步骤为：分别准确称取1.6g各糖标准品，用超纯水溶解定容，制得浓度为160 g/L的标准溶液；分别移取1.00 ml各标准溶液，混合并用超纯水逐级稀释，制得各级别混合标准溶液。

取混合标准溶液经高效液相色谱分析得到标准溶液曲线，见图1，色谱条件为：

检测器：VWD（可变波长）检测器；

色谱柱：CARBOSep CHO-620 （Ca型，6.5 mm×300 mm×10 um）；

流动相：超纯水；

流速：0.5 ml/min；

波长：190 nm；

柱温：80℃；

时间：30min。

b、称取1g‘Big top’桃品种果肉，加入7 ml 80%乙醇，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液定容到10ml；再吸取2ml进真空浓缩仪浓缩至干燥，用0.5ml超纯水溶解制得样品溶液，经0.22 mm有机滤头过滤。

c、对样品溶液进行高效液相色谱分析，进样量为5μl，得到样品溶液的色谱图，见图2，色谱条件同标准曲线的色谱条件。

d、将样品溶液的色谱图与标准溶液曲线比对，得到桃果肉中各种糖的含量，见表1，单位为g/L，即每L新鲜果肉中含有糖的含量。

实施例2

准确称取1g‘巨玫瑰’葡萄品种成熟果实果肉，样品制备过程和色谱条件同实施例1。所得样品溶液的色谱图见图3，葡萄果肉中各种糖的含量见表1。

实施例3

准确称取1g‘红富士’苹果品种成熟果实果肉，样品制备过程和色谱条件同实施例1。所得样品溶液的色谱图见图4，苹果果肉中各种糖的含量见表1。

实施例4

准确称取1g‘开策’香蕉品种成熟果实果肉，样品制备过程和色谱条件同实施例1。所得样品溶液的色谱图见图5，香蕉果肉中各种糖的含量见表1。

实施例5

准确称取1g‘丰水’梨品种成熟果实果肉，样品制备过程和色谱条件同实施例1。所得样品溶液的色谱图见图6，梨果肉中各种糖的含量见表1。

表1：本发明实施例1-5中各品种水果中糖含量测量结果

表2：本发明实施例1的标准曲线线性回归方程、相关系数、线性范围、相对标准偏差、最低检出限和回收率的结果。

 

本发明首次采用液相色谱搭载VWD检测器检测水果中的糖组分，由于考虑到糖的吸光度很微弱，用VWD检测器检测需要选很低的波长区间，而所用溶剂和流动相的截止波长也必须要低。本发明采用截止波长只有190nm的超纯水作为样品溶剂和流动相，而同时波长采用190nm，得到了理想的结果，达到能有效分离和测定糖组分含量的目的，并且操作简单，准确性和灵敏性高。通过该发明的方法所测得水果果肉中的各种糖含量与文献报道的其它方法测得的结果一致。

Claims (4)

1.一种液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，其步骤包括：

a、配制4种糖的混合标准溶液，绘制标准溶液曲线；

b、从水果果肉中提取糖配制样品溶液；

c、在色谱条件下对样品溶液进行高效液相色谱分析，并用VWD检测器进行检测；

d、将样品溶液的分析结果与标准曲线做比对，得出样品溶液中的糖含量；

其中高效液相色谱分析的色谱条件为：

检测器：VWD检测器；

色谱柱：CARBOSep CHO-620 ，Ca型，6.5 mm×300 mm×10 um；

流动相：超纯水；

流速：0.5 ml/min；

波长：190 nm；

柱温：80℃；

时间：30min。

2.根据权利要求1所述的液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，其特征在于：步骤b中从果肉中提取糖配制样品溶液的步骤为：称取1g果肉，加入7 ml 80%乙醇，避光超声波提取10 min，4℃下10000 rpm离心10 min，取上清液定容到10ml；再吸取2ml到真空浓缩仪浓缩至干燥，用0.5ml超纯水溶解制得样品溶液，经0.22 mm有机滤头过滤。

3.根据权利要求2所述的液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，其特征在于：步骤a中配制4种糖的混合标准溶液的步骤为：分别准确称取1.6g各种糖的标准品，用超纯水溶解定容，制得浓度为160 g/L的标准溶液；分别移取1.00 ml各标准溶液，混合并用超纯水逐级稀释，制得混合标准溶液。

4.根据权利要求3所述的液相色谱搭载VWD检测器测定水果中糖组分的方法，其特征在于：所述糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇。