CN104246478A - 通过测量光散射和荧光来表征样本的方法和设备 - Google Patents

Abstract

一种用于表征至少一个样本的方法以及实施这一方法的设备，所述方法包括：a)通过各个照射波长(λ_ε ¹-λ_E ³)下的N>1次光线(LE¹-LE³)照射待分析的所述样本或每个样本；b)为每个所述光线获取由所述样本或每个样本发出的至少一个荧光光强度和至少一个弹性散射光强度；c)对于所述样本或每个样本，基于所述荧光强度和所述弹性散射光强度来确定矢量指标；d)基于相应的矢量指标来确定表征每个样本或者所述样本经作用的方法的至少一个参数。

Description

通过测量光散射和荧光来表征样本的方法和设备

技术领域

本发明涉及一种利用光散射和荧光测量以及对所述测量的统计处理来表征样本(尤其是食品、药品以及生物或环境介质)的方法和设备。

本发明可被特别但非专门地应用于农业食品或制药行业。例如，本发明使得可以在制备或保存食品期间研究食物的营养和/或毒性的趋势，并控制对食品的处理(烹饪、烘培等)。

本发明还可以应用于环境行业，例如，废水、工业污泥、发酵介质等的处理。

更一般地，本发明可以被应用于确定样本质量的任何指标，和/或表征所述样本经作用的方法的任何参数。

该方法基于化学计量方法，且在本发明的有益实施例中，具体地基于光谱数据的多变量或者优选地基于光谱数据的多向统计分析。当数据以三向或更多向排布在表格中时，多向分析是多变量分析的自然扩展。其基于诸如“PARAFAC”(“平行因子”，即平行因子模型)和NPLS(“N向部分最小平方回归”)之类的统计模型的使用。在这方面可以参考由R.Bro在阿姆斯特丹大学1998年的博士论文“Multi-way Analysis in the Food IndustryModels,Algorithms,and Applications(食品工业模型中的多向分析、算法和应用)”的参考文献。

背景技术

文献WO2011/080408描述了一种用于样本(特别是食品样本)的光谱分析的方法和设备，其执行对光谱数据的多向处理。该方法包括：通过各个波长下的激发光辐射来照射待分析的每个样本；从每个样本获取多个前沿(frontal)荧光光谱，每个荧光光谱对应于各个激发光辐射；对这些荧光光谱进行预处理，特别用于从其中减去瑞利散射的成分；对预处理后的光谱应用多向统计模型，并且通过例如多线性回归来确定每个样本质量的指标和/或表征每个样本经作用的方法的参数。

文献WO2011/158192描述了一种用于表征农业食品的一个或多个样本的方法，该方法也使用从每个样本获取的多个前沿荧光光谱，以及利用多向数据分析方法对它们进行处理。这一方法最终通过多维空间中的点来描绘每个样本，使得可以计算相对于一个或多个参考样本的距离。这一距离使得例如可以量化样本的天然性和/或新鲜度。

文章：

-“Analysis of visible reflectance spectra of stored,cooked and diseasedchicken meats(经储存鸡肉、经烹饪鸡肉和患病鸡肉的可视反射光谱的分析)”，Y.Lio和Y.-R.Chen，Meat Science(肉类科学)58(2001)，第395-401页；以及

-“The Use of Visible and Near-Infrared Reflectance Measurements to assessSensory Changes in Carrot Texture and Sweetness during Heat Treatment(在热处理期间评估胡萝卜纹理和甜度的感官变化的可视化近红外线反射测量的使用)”，N.De Belie等，Biosystems Engineering(生物***工程)(2003)85(2)，第213-225页，

描述了用于表征食品样本的方法，其使得基于对反射光谱的多向分析方法的应用，尤其可以研究食品的烹饪。

由于这些方法必须获取和处理多个光谱，进而处理大量的数据，所以这些方法的执行相对复杂，因而昂贵。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的这些缺陷。

可以实现这一目的的本发明的一个主题是一种用于表征至少一个样本的方法，包括：

a)由各个照射波长下的N≥1次光辐射照射待分析的所述样本或每个样本；

b)为每次所述光辐射获取由所述样本或每个样本发出的至少一个荧光光强度和至少一个弹性散射光强度；

c)对于所述样本或每个样本，根据所述荧光强度和所述弹性散射光强度来确定矢量指标(vector indicator)；

d)由相应的矢量指标来确定表征每个样本或者所述样本经作用的方法的至少一个参数。

通过比较从现有技术中已知的上述方法，更具体地根据文献WO2011/080408和WO2011/158192，根据本发明的方法的特征在于结合使用荧光和散射数据，其使得可以改进对样本的表征和/或减少使用的光源数量，因而简化实现器具。应强调的是，在上述文献WO2011/080408和WO2011/158192中，散射光的强度仅被看作干扰荧光光谱获取的障碍，而认为荧光光谱是有用信息的唯一承载者。

根据本发明的方法的不同具体实施例：

-所述荧光强度和所述弹性散射光强度可以以前沿模式获取。

-所述步骤a)可以包括：通过数量为1到6之间的大致单色光辐射来照射待分析的所述样本或每个样本。

-所述步骤b)可以包括：对于所述样本或每个样本，获取至少一个荧光光谱，且所述步骤c)包括：同样对于所述样本或每个样本：

-通过将多变量或多向统计模型应用到所述荧光光谱或每个荧光光谱来计算分值矢量，所述统计模型由照射载荷矢量和荧光载荷矢量来定义；以及

-将所述分值矢量与至少一个弹性散射强度值或至少一个弹性散射光谱的参数特性进行级联(concatenation)。

-在步骤c)中实施的所述统计模型可以选自PARAFAC模型和NPLS模型。

-所述步骤b)可以包括：对于所述样本或每个样本，获取至少一个光谱，所述至少一个光谱包括由荧光产生的成分和由弹性散射产生的成分；以及减去由激发光辐射的弹性散射产生的所述成分，特别地，由弹性散射产生的所述成分显然能够通过广义线性模型计算。换句话说，可以使用广义线性模型分离出由荧光和弹性散射产生的成分，因而这两种成分能被用于表征样本。

-该方法还可以包括初步校准阶段，包括：

i)由所述各个照射波长下的所述N≥1次光辐射对多个校准样本进行照射；

ii)对于每个所述校准样本，获取所述荧光光谱或多个光谱；

iii)通过迭代法确定所述统计模型的所述载荷矢量，以及每个校准样本的分值矢量。

-确定表征每个样本或者所述样本经作用的方法的至少一个参数的所述步骤d)可以通过选自以下的方法来实施：根据所述矢量指标的多线性回归；计算所述矢量指标与参考矢量之间的距离；监督或非监督分类法；以及“计分”法。

-该方法还可以包括初步校准阶段，包括：为所述校准样本，确定将所述矢量指标与所述参数或每个参数的已知数值连结起来的函数。

-所述样本或每个样本可以是选自食品、药品、生物介质或环境介质的产品。

-所述或每个所述标量或矢量参数可以表示所述样本的基质的物理化学结构，或者所述物理化学结构的转型。

本发明的另一主题是一种用于表征至少一个样本的设备，包括：

-至少一个光源，用于通过各个照射波长下的N≥1次光辐射来照射待分析的所述样本或每个样本；

-获取装置，用于获取对于每次所述光辐射，由所述样本或每个样本发出的至少一个荧光光强度和至少一个弹性散射光强度；以及

-用于处理表示所获取的光强度的数据的装置，其被编程或配置为实施如上所述的方法。

附图说明

通过阅读参考以示例方式给出的附图所作的说明，本发明的其它特征、细节和优点将变得明显，附图中：

-图1表示用于实施根据本发明的方法的装置的框图；

-图2A和图2B示出相比于仅使用荧光，结合包括荧光和光的弹性散射如何改进对牛肉烹饪时间的预测；

-图3A和图3B示出相比于仅使用荧光，结合包括荧光和光的弹性散射如何改进对烘培菊苣期间丙烯酰胺含量的趋势的预测；以及

-图3C示出烘培期间菊苣在430nm下的散射强度的趋势。

具体实施方式

图1的设备包括三个单色光源SL¹、SL²和SL³，产生波长为λ_E ¹、λ_E ²和λ_E ³的各个照射光辐射。这种设备的替代实施例可以包括更多或更少数量的单色光源(极限为只有1个)，甚至产生所有照射辐射的多色光源。

同时或依次将辐射LE¹-LE³朝向样本S引导，样本S可以为容纳在透明容器内的固体、粉末、液体等。在被每个入射辐射LEⁱ的照射之后，样本S发出LDF辐射，其实质上包括两个成分(contribution)：一个是由弹性散射产生的与照射辐射相同波长的成分；另一个是由荧光产生的多色成分。衍射光栅RD将LDF辐射分解为光谱分量(spectral component)。通过矩阵传感器DL获得最终的光谱SP，光谱SP产生信号，这些信号在被转换成数字形式后由数据处理装置MTD处理。

在图1的实施例中，用前沿(frontal)模式检测散射和荧光，也就是说，在接收入射光的样本S的同一侧上。这不是必须的。

类似地，可以使用色散元件(例如棱镜)而非衍射光栅将LDF辐射分解为其光谱分量；甚至还可以用傅里叶变换光谱仪来替代色散元件。根据另一变型例，可以使用可移动或与旋转光栅或棱镜相关联的聚光检测器(spot light detector)(单色型设备)。

衍射光栅的使用提供了利用衍射级数量的优点。有利之处是即使所使用的检测器由于过强的光强度(典型地是散射光强度)而饱和，也能够利用(access)散射幅度。由第二级衍射导致的副本实际上比第一级弱很多，因此可以利用第一级尖峰信号(spike)的幅度(每一级衍射的强度之间的比例是恒定的，且仅取决于光栅)。因而，可以同时获得较高的荧光信号和散射幅度。

特别地，当“单色”光源表现出相对宽的光谱(例如，其为发光二极管)时，由传感器DL获取的光谱包括由弹性散射产生的成分和由荧光产生的成分，两个成分部分重叠。在这种情况下，为了消除这一成分，可以提供预处理；上述文献WO2011/080408描述了一种此类型的预处理方法，其基于经由广义线性模型(GLZ)使用对数连结函数对与荧光重叠的散射区域的预测。这一文献还描述了其它预处理操作(归一化、多元扩散校正等)，其也能应用于本发明。

如同在上述文献WO2011/080408的方法中，将统计模型应用到DLi传感器所获取的荧光光强度值可提供被称为“分值(score)”的矢量，其用以表征样本。根据本发明的一个实施例，通过将所述分值矢量和一个或更多弹性散射强度值级联(concatenation)而构成矢量指标或说明性矢量。该矢量指标因而使得可以获得表征样本S或样本经作用的方法的参数(标量或矢量)。优选地，所述标量或矢量参数或每个标量或矢量参数将表示所述样本的以固体、液体或粉末形式的“基质(matrix)”的物理-化学结构，或者这种结构的转型。就复合物而言，或者就一个和相同族的若干复合物而言，其可以例如是含量，或者甚至是量化由诸如烹饪之类的方法引起的所述基质的物理化学改性的参数。“基质”应被理解为样本的主要部分，其形成相对统一的质量，表现出大致的连续性并可能包含其它少数组成部分，例如分散离子或悬浮的液滴。

在某些情况下，荧光“分值”矢量可以被由在离散波长下特定数量(通常在1与6之间)的荧光强度值构成的矢量所替代或补充。

在某些情况下，矢量指标还可以包含关于一个或更多弹性散射光谱的形式的信息。实际上，这些光谱不一定等同于对应的照射光谱。因而，例如矢量指标可以通过级联以下而获得：荧光分值矢量、一个或更多离散弹性散射强度值、以及表示一个或更多弹性散射光谱的形式或宽度的一个或更多标量参数。

实施该方法首先需要校准阶段，涉及多个校准样本Sⁱ。适当获取的荧光光谱(如果有需要，在“清理”由弹性散射产生的零散成分(straycontribution)之后)被组织为第三级数据张量(“数据立方体”)，其三条“路径”为：样本、照射辐射、荧光光谱的波长。如果照射是单色的，则数据由第二级张量表示。

应用到数据的统计模型可以是“PARAFAC”类型，其构成为将三向张量X分解为三个矢量(“三元”)a_i、b_i、c_i的外积加上余数E的总和，也为“数据立方体”形式。因而可被写作如下：

$x_{\mathrm{ijk}}=\underset{f=1}{\overset{F}{\mathrm{\Σ}}}{a}_{\mathrm{if}}{b}_{\mathrm{jf}}{c}_{\mathrm{kf}}+e_{\mathrm{ijk}},$

其中：“i”从1到I>1，是样本的序数(index)；“j”从1到J>1，是照射波长的序数；“k”从1到K>1，是对应于每个照射辐射的荧光光谱波长的序数；“f”是PARAFAC分解因子F的序数。因子F的数量可被先验地限定，或者使用现有技术公知的标准限定。

矢量(具有F分量)a_i.＝(a_i1…a_iF)被称为样本Sⁱ的“分值”矢量，而矢量b_j·＝(b_j1…b_jF)和c_k·＝(c_k1…c_kF)分别是照射和发射“载荷”矢量，其限定统计模型。这些矢量通过公知的迭代法(例如，交替最小二乘)，以最小化余数E的张量弗罗贝尼乌斯范数(即，||X-X_mat||_FRO的值)的方式来确定，其中X_mat对应于PARAFAC模型的数据立方体(见下)，且||.||_FRO表示弗罗贝尼乌斯范数(或者任意其它合适的范数)。

PARAFAC模型可以用矩阵形式被重写为如下：

其中：

-X_mat是样本的荧光发出的不同辐射强度的矩阵，大小为Ix(J*K)；这一矩阵包含与三向张量X相同的信息，但以不同方式组织；

-B和C是照射和发射“载荷”的矩阵(大小分别为J*F和K*F个元素)，其列由矢量b_j ^T.和c_k. ^T形成；

-A_IF是“分值”的矩阵(大小为I*F)，其列由矢量a_i ^T.形成；

-符号表示张量Khatri-Rao积；以及

-指数T表示转置运算。

这一模型使得可以在已完成校准后，为新样本获得分值矢量。实际上，如果X_new被作为具有包含为所述新样本获取的荧光光谱的J*K分量的矢量；则这一新样本的分值的矢量(维度F)由以下给出：

其中，指数+表示张量乘的广义逆矩阵。

但是，重要的是注意到“PARAFAC”模型是经验性的；因此，仅对于与校准中已使用的样本类似的样本有效。

然后，由分值矢量以及例如一个或更多弹性散射强度值，甚至还有在多个离散波长处的一个或更多荧光强度值来构成矢量指标。这能够仅通过级联而完成。

接着，可以由校准数据构成多线性回归模型以允许预测，该多线性回归模型作为所述矢量指标、表征样本和/或样本经作用的方法的参数(甚至多个)的函数。这一参数例如可以是所确定的分量的含量，或者烹饪时间。显然，表征参数的值对于校准样本必须是已知的。

在不脱离本发明范围的情况下可以设想出上述表征方法的多个变型。例如，统计模型可以不是PARAFAC类型，而是例如NPLS类型，或者其它已知类型(在本文中，见R.Bro的上述文献)。而且，从矢量指标(如上所述，能由与表示弹性散射的参数级联的分值矢量构成)到表征样本的参数的转变可以通过除了多线性回归之外的其它方式完成，例如通过计算所讨论的每个样本的矢量指标与参考样本的矢量指标之间的距离(欧几里得距离或马氏距离)。还可以利用监督或非监督分类技术，或者被称为“计分(scoring)”的监督方法。

“计分”是一种数据排序技术，其使得可以通过分值评估样本或样本组类似于另一样本或样本组的概率。根据如上定义的矢量指标来计算此概率。

作为非限制示例，可以使用以下方法：

由PARAFAC荧光分值和散射强度，构成矩阵M(n×m)，其中n是样本的数量，且m是变量的数量，即每个矢量指标的分量的数量。

然后，通过使用如下线性回归模型来计算距离y的矢量指标：

y＝b₁a₁+b₂a₂+…+b_ma_m+e

矢量y是二进制数，且取如下值：对于所谓的参考样本为零，对于待表征的样本为1。矢量a_i是矩阵M的列，标量b_i是线性模型的系数；e是余数的矢量。

学生t检验被应用到根据参考样本的分值和散射预测的距离以及根据待表征的样本的分值和散射预测的距离统计量t由如下等式计算：

其中，n_r和n_s分别是由线性回归模型提供的距离的平均值，它们的方差(S)和用于测量参考(下标为r)，以及样本(下标为s)的副本的数量(n)。

“计分”分值被表示为概率密度的函数：

$p\left(t\right)=\frac{\mathrm{\Γ}\left(\frac{v+1}{2}\right)}{\sqrt{\mathrm{v\π}}\mathrm{\Γ}\left(\frac{v}{2}\right)}{(1-\frac{t^2}{v})}^{-0.5(v+1)};$ 用于v≥1

其中Γ是欧拉伽马函数，且v是自由度

基于分布(H₀:)上的零假设，表现出较高外部概率的样本得到更高的分值，即接近1。

将使用两个示例性应用，在其上示出本发明的技术效果。

第一示例涉及控制食品的烹饪，特别是牛肉的烹饪。

通过在烹饪期间分析一块肉的表面的反射来测量散射，可以绘制烹饪程度的动态曲线。散射光强度随时间的变化明显地反映出蛋白质在热的作用下特性改变所导致的蛋白质聚合的信息，这一现象通过介质颜色的变化而在视觉上反映出来。在其它食品鱼或蛋白的情况下，介质的透明性的丧失相当明显。在加热或凝结牛奶的情况下，肉眼没有感觉到变化，但定量测量显示，即使在这种情况下，与特性改变的浆液蛋白质的聚合的形成相关联地引发散射。荧光也受到在烹饪过程中发生的化学和物理-化学转变的影响。因此，通过测量相对于初始程度的距离(欧几里得或马氏)的形式，可以在散射方面或者更佳地在散射-荧光结合的趋势动态方面限定最佳的烹饪程度及其转变(translation)。另一途径包括：在烹饪时间上构建回归；以及识别由荧光和散射信号的结合预测的最优时间。

表I表示对于四个识别因子(Fact1至Fact4)，以及在不同波长下的最大散射和荧光强度(应用术语最大强度是因为散射和荧光光谱显示出有限的宽度)，对以180℃对牛肉烤炙烹饪10分钟的样本计算的不同PARAFAC分值之间获得的关联系数。更具体地：

-D1S1对应于与光栅RD的第一级衍射相关联测量的、用280nm照射辐射的最大弹性散射强度；

-D1S2对应于与光栅RD的第一级衍射相关联测量的、用375nm照射辐射的最大弹性散射强度；

-D2S2对应于与光栅RD的第二级衍射相关联测量的、375nm的散射强度；以及

-D1S3对应于与光栅RD的第一级衍射相关联测量的、用430nm照射辐射的最大弹性散射强度。

一方面，关联表格示出荧光明显与散射相关联，且荧光和光散射与烹饪时间相关联。

表I

图2A示出仅根据荧光数据(四个PARAFAC因子的分值的矢量)获得的烹饪时间的多线性回归模型(x轴：预测烹饪时间，以分钟计；y轴：实际烹饪时间)；图2B示出同样使用280nm下的最大弹性散射强度(D1S1)获得的回归模型。在这两种情况下，基于14个样本执行校准。可以看出，包括进弹性散射相当大地改进了对烹饪时间的预测；实际上，均方预测误差从1.60分钟改变为0.35分钟。

第二示例涉及在烘培菊苣期间，菊苣的丙烯酰胺含量的变化趋势。

表II表示对于四个识别因子(Fact1至Fact4)，以及在不同波长下的最大散射和荧光强度，不同PARAFAC分值之间获得的关联系数。D1S1、D1S2和D1S3已在先前定义；D2S1对应于在光栅RD的第二级衍射下观察到的在280nm下的弹性散射。

表II

图3C示出了在烘培处理期间，在430nm下的散射的趋势，接近3h的整体持续时间被细分为13个步骤。散射强度的逐渐下降对应于由梅拉德分子引起的吸收；这与色度计测量的颜色密切相关。

图3A示出仅根据荧光数据获得的丙烯酰胺含量的多线性回归模型(x轴：预测含量，以μg/kg计；y轴：测量到的含量)；图3B示出了同样使用弹性散射获得的回归模型。在这两种情况下，基于68个样本进行校准。如对烹饪肉的控制的情况一样，观察到预测的显著改进，其均方误差从356μg/kg改变到276μg/kg。

Claims (12)

1.一种用于表征至少一个样本的方法，包括：

a)由各个照射波长(λ_E ¹-λ_E ³)下的N≥1次光辐射(LE¹-LE³)照射待分析的所述样本或每个样本；

b)为每次所述光辐射获取由所述样本或每个样本发出的至少一个荧光光强度和至少一个弹性散射光强度；

c)对于所述样本或每个样本，根据所述荧光强度和所述弹性散射光强度来确定矢量指标；

d)由相应的矢量指标来确定表征每个样本或者所述样本经作用的方法的至少一个参数。

2.根据前述权利要求之一所述的方法，其中，所述荧光强度和所述弹性散射光强度以前沿模式获取。

3.根据前述权利要求之一所述的方法，其中，所述步骤a)包括：通过数量为1到6之间的基本为单色的光辐射来照射待分析的所述样本或每个样本。

4.根据前述权利要求之一所述的方法，其中，所述步骤b)包括：对于所述样本或每个样本，获取至少一个荧光光谱，且所述步骤c)包括：同样对于所述样本或每个样本：

-通过将多变量或多向统计模型应用到所述荧光光谱或每个荧光光谱来计算分值矢量，所述统计模型由照射载荷矢量和荧光载荷矢量来定义；以及

-将所述分值矢量与至少一个弹性散射强度值或至少一个弹性散射光谱的参数特性进行级联。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤c)中实施的所述统计模型选自PARAFAC模型和NPLS模型。

6.根据权利要求4或5之一所述的方法，其中，所述步骤b)包括：对于所述样本或每个样本，获取至少一个光谱，所述至少一个光谱包括由荧光产生的成分和由弹性散射产生的成分；以及减去由激发光辐射的弹性散射产生的所述成分，由弹性散射产生的所述成分通过广义线性模型计算。

7.根据权利要求4至6中之一所述的方法，还包括初步校准阶段，包括：

i)由所述各个照射波长下的所述N≥1次光辐射对多个校准样本进行照射；

ii)对于每个所述校准样本，获取所述荧光光谱或多个光谱；

iii)通过迭代法确定所述统计模型的所述载荷矢量，以及每个校准样本的分值矢量。

8.根据前述权利要求之一所述的方法，其中，确定表征每个样本或者所述样本经作用的方法的至少一个参数的所述步骤d)通过选自以下的方法来实施：

-根据所述矢量指标的多线性回归；

-计算所述矢量指标与参考矢量之间的距离；

-监督或非监督分类法；以及

-“计分”法。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括初步校准阶段，包括：为所述校准样本，确定将所述矢量指标与所述参数或每个参数的已知数值连结起来的函数。

10.根据前述权利要求之一所述的方法，其中，所述样本或每个样本是选自食品、药品、生物介质或环境介质的产品。

11.根据前述权利要求之一所述的方法，其中，所述或每个所述标量或矢量参数表示所述样本的基质的物理化学结构，或者所述物理化学结构的转型。

12.一种用于表征至少一个样本的设备，包括：

-至少一个光源(SL1-SL3)，用于通过各个照射波长(λ_E ¹-λ_E ³)下的N≥1次光辐射(LE)来照射待分析的所述样本或每个样本；

-获取装置(DL)，用于获取对于每次所述光辐射，由所述样本或每个样本发出的至少一个荧光光强度和至少一个弹性散射光强度；以及

-用于处理表示所获取的光强度的数据的装置(MTD)，其被编程或配置为实施根据权利要求1至11之一所述的方法。