CN104237442A - 试剂盒及其应用以及联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种试剂盒及其应用以及联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法，本发明的串联质谱非衍生法检测用试剂盒包括同位素标准品、提取液、流动相和探针洗液，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液，所述探针洗液为甲醇浓度为50-80体积％的甲醇水溶液。本发明的串联质谱衍生法检测用试剂盒还包括衍生化溶液。本发明的试剂盒用于串联质谱检测时能达到较高的精密度和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及一种串联质谱检测用试剂盒及其应用以及联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法。
背景技术
遗传性代谢病是一类涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质代谢的疾病。其种类繁多，是儿科临床的疑难杂症。虽然其单一病种患病率较低，但总体发病率较高，对人口素质、家庭乃至社会的发展构成了极大的威胁。其诊断主要依赖实验室的特异性检查。
我国每年出生约2200万新生儿，其中出生缺陷儿占90万，占世界的20％，平均每30秒出生一名出生缺陷儿，带给家庭的是沉重的经济、精神压力及终身的痛苦；不利于和谐社会建设和医疗体制改革。仅高苯丙氨酸血症(包括苯丙酮尿症)这类疾病，每年就新增患儿1600-1800例。液相串联质谱技术的发展使得这类疾病在发病前进行干预成为可能。即在新生儿出生后体内某些代谢产物出现异常，而尚未出现临床症状或者症状不明显时就早期明确诊断，并进行及时而有效的对症治疗，以避免患儿的重要脏器出现不可逆性损害，进而保障儿童正常的体格发育和智能发育。
串联质谱检测氨基酸和肉碱的原理：用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的带电荷分子离子和碎片离子，这些带电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子进入质量分析器中(可由电场和/或磁场组成)，根据质荷比不同按空间位置、时间先后或运动迹的稳定与否等实现分离，记录各种检测到的离子的质量数和丰度，形成质谱图。通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。基于以上理论，通过特定的技术将样本中的物质提取出来，利用合适的流动液体带入串联质谱***，根据物质的质荷比不同就能测定不同成分的浓度。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种新的用于串联质谱检测的试剂盒及其应用，以及利用本发明的试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种串联质谱非衍生法检测用试剂盒，该试剂盒包括：同位素标准品、提取液和流动相，其中，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液。
第二方面，本发明提供了一种使用第一方面所述的试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法，该方法包括：(1)使用同位素标准品和提取液制备工作溶液；(2)打孔加样；(3)样本提取；(4)上机检测。
第三方面，本发明提供了一种串联质谱衍生法检测用试剂盒，该试剂盒包括：同位素标准品、提取液、衍生化溶液和流动相，其中，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液。
第四方面，本发明提供了一种使用第三方面所述的试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法，该方法包括：(1)使用同位素标准品和提取液制备工作溶液；(2)打孔加样；(3)样本提取；(4)干燥后加入衍生试剂进行转化；(5)干燥后加入作为复溶液的流动相，振荡混匀；(6)上机检测。
第五方面，本发明提供了第一方面和/或第三方面所述的试剂盒在检测氨基酸和/或肉毒碱中的应用。
本发明的试剂盒用于串联质谱检测时比传统方法能达到更高的精密度和准确度高，利用外周血制成的干血滤纸片标本，只需3微升血液样本即可一次性定量10余种氨基酸和30余种肉碱，根据这些指标能筛选40余种先天性遗传代谢性疾病，大大提高了对疾病的筛查和诊断效率。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供的串联质谱非衍生法检测用试剂盒包括：同位素标准品、提取液和流动相，其特征在于，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液。
本发明中，所述同位素标准品包括氨基酸同位素标准品和肉毒碱同位素标准品，均可以为本领域常规使用的标准品，且市售的各种同位素标准品均可以用于本发明，如美国剑桥实验室提供的同位素标准品，其种类及浓度如下表1所示：
表1
| 氨基酸(AA) | 浓度 | 肉毒碱(AC) | 浓度 |
| 2H4-Ala | 2.50μmol/L | 2H9-C0 | 0.76μmol/L |
| 2H4,13C-Arg | 2.50μmol/L | 2H3-C2 | 0.19μmol/L |
| 2H2-Cit | 2.50μmol/L | 2H3-C3 | 0.038μmol/L |
| 15N,2-13C-Gly | 12.50μmol/L | 2H3-C4 | 0.038μmol/L |
| 2H3-Leu | 2.50μmol/L | 2H9-C5 | 0.038μmol/L |
| 2H3-Met | 2.50μmol/L | 2H3-C8 | 0.038μmol/L |
| 2H2-Orn | 2.50μmol/L | 2H9-C14 | 0.038μmol/L |
| 2H6-Phe | 2.50μmol/L | 2H3-C16 | 0.076μmol/L |
| 13C6-Tyr | 2.50μmol/L | ||
| 2H8-Val | 2.50μmol/L |
本发明中，所述流动相优选为混合液A或混合液B，
混合液A为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80-95:5-20:0.05-0.39；
混合液B为乙腈、水、甲酸和七氟丁酸的混合物，其中，乙腈、水、甲酸和七氟丁酸的体积比为80-95:5-20:0.1-0.25:0.01-0.06。
本发明提供的使用上述试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法包括以下步骤：
(1)使用同位素标准品和提取液制备工作溶液；
(2)打孔加样；
(3)样本提取；
(4)上机检测。
根据本发明，只要使用本发明的试剂盒进行检测即可实现本发明的目的，对上述步骤(1)-(4)的具体操作没有特别的要求，均可参照现有操作进行，优选情况下，样本提取的条件为：40-50℃下650-750rpm振荡孵育40-50分钟(优选45分钟)。
使用本发明的串联质谱非衍生法检测用试剂盒检测新生儿血液中氨基酸和肉毒碱的浓度参考值(即精密度)如下表2所示。
表2
本发明提供的串联质谱衍生法检测用试剂盒包括：同位素标准品、提取液、衍生化溶液和流动相，其特征在于，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液。
本发明中，所述同位素标准品可以与串联质谱非衍生法检测用试剂盒相同。所述衍生化溶液通常为3N盐酸正丁醇。
本发明中，所述流动相优选为混合液C或混合液D，
混合液C为乙腈、水和有机酸的混合物，其中，乙腈、水和有机酸的体积比为80-98:2-20:0.01-0.35；
混合液D为甲醇、乙腈和有机酸的混合物，其中，甲醇、乙腈和有机酸的体积比为50-85:15-50:0.01-0.35；
混合液C或混合液D中，所述有机酸为甲酸和/或七氟丁酸。
本发明提供的使用上述串联质谱衍生法检测用试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法包括以下步骤：
(1)使用同位素标准品和提取液制备工作溶液；
(2)打孔加样；
(3)样本提取；
(4)干燥后加入衍生试剂进行转化；
(5)干燥后加入作为复溶液的流动相，振荡混匀；
(6)上机检测。
根据本发明，只要使用本发明的试剂盒进行检测即可实现本发明的目的，对上述步骤(1)-(6)的具体操作没有特别的要求，可以参照现有的操作进行，优选情况下，样本提取的条件为：25-35℃下600-700rpm振荡孵育40-50分钟，更优选为：30℃下650rpm振荡孵育45min。
优选地，步骤(4)中转化的方式为：55-65℃下静置25-35min，更优选为：60℃下静置30min。
优选地，步骤(5)中振荡混匀的方式为：25-35℃下600-700rpm振荡10-20min，更优选为：30℃下650rpm振荡15min。
使用本发明的串联质谱衍生法检测用试剂盒检测新生儿血液中氨基酸和肉毒碱的浓度的精密度和准确度如下表3所示。
表3
| 平均值 | SD | CV％ | 靶值 | 范围上限 | 下限 | |
| VAL | 326.77 | 47.52 | 14.54 | 312.00 | 447.00 | 177.00 |
| TYR | 305.75 | 23.56 | 7.70 | 287.00 | 382.29 | 209.00 |
| PHE | 209.33 | 16.31 | 7.79 | 198.00 | 271.95 | 144.00 |
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| C12 | 1.99 | 0.21 | 10.75 | 2.20 | 2.67 | 1.60 |
本发明提供的串联质谱非衍生法检测用试剂盒和/或串联质谱衍生法检测用试剂盒中，还可以进一步包括V型底96孔微孔板(抗热)、U型底96孔微孔板、铝箔、粘性封膜和热封膜等，本领域技术人员能够对此进行选择，在此不再赘述。
本发明还提供了上述串联质谱非衍生法检测用试剂盒和/或串联质谱衍生法检测用试剂盒在检测氨基酸和/或肉毒碱中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，使用的试剂盒的具体组成见表4；同位素标准品购自美国剑桥实验室。
表4
实施例1
本实施例用来说明本发明的串联质谱非衍生法检测用试剂盒及其应用。
按照如下方法使用对比试剂盒D1(美国PerkinElmer(NeoBase)公司的非衍生试剂盒，在串联质谱仪器Waters TQD上进行，条件见表5)、试剂盒1(在串联质谱仪器Waters TQD上进行，条件见表5)和试剂盒2(在串联质谱仪器AB3200上进行，条件见表6)检测同一干血滤纸片标本(***临床检验中心提供的室间质控品，批号为201322)中氨基酸和肉毒碱的含量，连续测定后计算各项目结果的平均数、标准差和变异系数，计算结果如表8所示。
1、准备提取工作溶液：将氨基酸内标和肉毒碱内标浓缩液稀释并混合配制，以1:110比例用提取液稀释复溶后的内标液。
2、打孔加入质控血斑和待测样本血斑。
3、加入配制好的提取工作溶液覆上粘性封膜减少挥发。
4、30℃下650rpm振频振荡孵育45分钟。
5、从板上揭去粘性封膜，转移至对应序号位置的V型底耐热微孔板，每孔转移75ul。
6、覆上铝箔封膜减少挥发。
7、将板放入自动进样器中，启用应用软件，选择正确的内标浓度文件，建立样品列表，选择正确的采集方法，检测，液相泵梯度及质谱仪条件见表7。
表5根据此配方在串联质谱仪器Waters TQD上的质谱条件
表6根据此配方在串联质谱仪器AB3200上的参考质谱条件
表7非衍生方法选用的液相泵梯度及质谱仪条件
表8
对比例1
按照实施例1中使用试剂盒2的方法检测样品中氨基酸和肉毒碱的含量，不同的是，试剂盒中99体积％的甲醇水溶液由无水甲醇代替且流动相为体积比为90:15:0.05:0.04的乙腈、水、甲酸和七氟丁酸的混合液，结果如表8所示。
实施例2
本实施例用来说明本发明的串联质谱衍生法检测用试剂盒及其应用。
按照如下步骤使用对比试剂盒D2(美国PerkinElmer(NeoBase)公司的非衍生试剂盒，在串联质谱仪器Waters TQD上进行，条件见表9)、试剂盒3(在串联质谱仪器Waters TQD上进行，条件见表9)和试剂盒4(在串联质谱仪器AB3200上进行，条件见表10)检测同一干血滤纸片标本(***临床检验中心提供的室间质控品，批号为201322)中氨基酸和肉毒碱的含量，连续测定后计算各项目结果的平均数、标准差和变异系数，计算结果如表12所示。
1.准备提取工作溶液：将氨基酸内标和肉毒碱内标浓缩液稀释并混合配制，以1:200比例用提取液稀释复溶后的内标液。
2.打孔加入质控血斑和待测样本血斑。
3.每孔加入配制好的提取工作溶液90ul覆上粘性封膜减少挥发。
4.28℃下700rpm振频振荡孵育45分钟。
5.从板上揭去粘性封膜，每孔转移60ul至对应序号位置的V型底耐热微孔板。
6.蒸发干燥。
7.每孔加入50ul转化液，用封膜封口，防止挥发。
8.在60℃温度条件下静置30分钟。
9.揭去封膜，蒸发干燥。
10.每孔加入75ul复溶液，用铝箔膜封板。
11.在27℃温度条件下，以550rpm的频率，震荡10分钟。
12.将板放入自动进样器中，启用应用软件，建立样品列表，选择正确的内标浓度文件和采集方法，检测，液相泵梯度及质谱仪条件见表11。
表9根据配方在串联质谱仪器Waters TQD上的参考质谱条件
表10根据此配方在串联质谱仪器AB3200上的参考质谱条件
表11衍生方法选用的液相泵梯度及质谱仪条件
表12
对比例2
按照实施例2中使用试剂盒4的方法检测样品中氨基酸和肉毒碱的含量，不同的是，试剂盒中90体积％的甲醇水溶液由无水甲醇代替且流动相为体积比为75:35:0.4的甲醇、乙腈和七氟丁酸的混合液，结果如表12所示。
从表8和12可以看出，本发明的方法可获得理想的检测效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (11)
1.一种串联质谱非衍生法检测用试剂盒，该试剂盒包括：同位素标准品、提取液和流动相，其特征在于，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述流动相为混合液A或混合液B，
混合液A为甲醇、水和甲酸的混合物，其中，甲醇、水和甲酸的体积比为80-95:5-20:0.05-0.39；
混合液B为乙腈、水、甲酸和七氟丁酸的混合物，其中，乙腈、水、甲酸和七氟丁酸的体积比为80-95:5-20:0.1-0.25:0.01-0.06。
3.使用权利要求1或2所述的试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法，该方法包括以下步骤：
(1)使用同位素标准品和提取液制备工作溶液；
(2)打孔加样；
(3)样本提取；
(4)上机检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，样本提取的条件为：40-50℃下650-750rpm振荡孵育40-50分钟。
5.一种串联质谱衍生法检测用试剂盒，该试剂盒包括：同位素标准品、提取液、衍生化溶液和流动相，其特征在于，所述提取液为甲醇浓度为85-99体积％的甲醇水溶液，所述流动相为甲醇、水、乙腈、甲酸和七氟丁酸中的至少三种组成的混合液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述流动相为混合液C或混合液D，
混合液C为乙腈、水和有机酸的混合物，其中，乙腈、水和有机酸的体积比为80-98:2-20:0.01-0.35；
混合液D为甲醇、乙腈和有机酸的混合物，其中，甲醇、乙腈和有机酸的体积比为50-85:15-50:0.01-0.35；
混合液C或混合液D中，所述有机酸为甲酸和/或七氟丁酸。
7.使用权利要求5或6所述的试剂盒联合检测多种氨基酸和肉毒碱的方法，该方法包括以下步骤：
(1)使用同位素标准品和提取液制备工作溶液；
(2)打孔加样；
(3)样本提取；
(4)干燥后加入衍生试剂进行转化；
(5)干燥后加入作为复溶液的流动相，振荡混匀；
(6)上机检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，样本提取的条件为：25-35℃下600-700rpm振荡孵育40-50分钟。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(4)中转化的方式为：55-65℃下静置25-35min。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(5)中振荡混匀的方式为：25-35℃下600-700rpm振荡10-20min。
11.权利要求1、2、5和6中任意一项所述的试剂盒在检测氨基酸和/或肉毒碱中的应用。
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