CN104236983A - 溶液样品中含长烷基链的离子液体的去除方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含长烷基链的离子液体的去除方法，去除方法包括以下步骤：a)将含有离子液体的溶液调至碱性（pH≥8）；b)采用阳离子交换材料作为吸附剂，去除含长烷基链的离子液体；c)收集去除离子液体后的溶液。该方法能很好地去除溶液中的含长烷基链的离子液体，具有简单、高效、快速的优点，并在蛋白质组学、高分子化学及脂质体代谢组学方面有着广阔的应用前景。

Description

溶液样品中含长烷基链的离子液体的去除方法
技术领域
本发明涉及一种含长烷基链的离子液体的去除方法及其应用，可实现溶液中含长烷基链的离子液体的有效去除，具有简单、高效、快速的优点，并且该方法可以广泛应用于蛋白质组学、高分子化学及脂质体代谢组学的研究中。
背景技术
膜蛋白质对执行细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控以及能量传递等功能起着重要作用。真核生物中1/3的蛋白均整合在膜上。此外，膜蛋白质在药物研究中也起着相当重要的作用，在已知的和正在研究的药物靶标中大约有70%为膜蛋白质。然而，由于膜蛋白质疏水性强，导致其溶解性和酶解效率较差，分析困难。因此，选择一种对膜蛋白质具有高溶解能力的溶剂是膜蛋白质研究的先决条件。
近年来，离子液体作为一种极具应用前景的绿色溶剂受到越来越多的关注。离子液体是完全由阴阳离子组成，通常在室温下表现为液体或是熔点小于100℃的盐类。离子液体具有良好的溶剂性、不挥发、热稳定、液程宽、阴阳离子可设计性等优点，已经被广泛应用在化学合成、电化学、萃取分离、材料制备等诸多领域。由于其良好的溶解能力，近来年离子液体成为膜蛋白质溶解的新型溶剂（Sun,L.L.;Tao,D.Y.;Han,B.;Ma,J.F.;Zhu,G.J.;Liang,Z.;Shan,Y.C.;Zhang,L.H.;Zhang,Y.K.Anal.Bioanal.Chem.2011,399,3387-3397.）。
“Bottom-up”技术是目前蛋白质组学分析鉴定中最常用的技术，该技术是先将蛋白质酶解成肽段，然后通过一维或者多维分离技术进行分离及在线质谱鉴定。在膜蛋白质分析中，为了膜蛋白质的增溶，添加的离子液体等增溶剂会严重影响蛋白质分析的质谱信号。因此质谱分析前，需要对蛋白质样品进行离子液体等增溶剂的去除，以获得理想的质谱信号。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于发展一种含长烷基链的离子液体的去除方法，通过该方法能高效、快速、简便地去除溶液中的离子液体，从而与后续的分析过程相兼容，不对后续的分析造成不利的影响。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
溶液样品中含长烷基链的离子液体的去除方法，将含有长烷基链的离子液体的样品溶液用碱性溶液调至pH≥8的碱性环境；然后采用阳离子交换材料作为吸附剂，去除含长烷基链的离子液体，最后将吸附剂和溶液分离，收集溶液。
含长烷基链的离子液体可为：阳离子部分为烷基链部分，为含6个碳或7个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子；阴离子部分为Cl-、Br-、I-、NO3 -、ClO4 -、AlCl4 -、BF4 -、PF4 -、CF3COO-、CF3SO3 -、(CF3SO2)2N-或SbF6 -。
将含有长烷基链的离子液体的样品溶液用碱性溶液调至pH为8-14的碱性环境。
含有长烷基链的离子液体的样品溶液可为：细胞提取液、胞浆提取液、血浆提取液、蛋白质溶液、多肽溶液、脂质物溶液或呈电负性的聚合物溶液。
调节pH至碱性环境所采用的碱性溶液为pH为9-14的碳酸氢铵缓冲盐溶液、pH为9-14的磷酸缓冲盐溶液、pH为9-14的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液、氨水、碳酸钠溶液、或氢氧化钠溶液。
阳离子交换材料为含有磺酸基团和/或磷酸基团的硅胶或聚合物基质材料（如：聚丙烯酸酯类基质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质）；材料可以是颗粒材料或者整体材料。
将吸附剂和样品溶液接触和分离的方式可以为：
将吸附剂固载于固相载体上或填充于中空容器中，将含有离子液体的样品溶液通过固相载体或中空容器，并与吸附剂接触后，直接收集；
或将吸附剂和样品溶液混合接触后，将吸附剂通过离心沉淀的方式，与含有离子液体的溶液分离；
或将吸附剂包裹于磁性颗粒上，将吸附剂和样品溶液混合接触后，通过磁力作用，与含有离子液体的样品溶液分离。
固相载体为：表面积为1cm2-10m2，形状为长方体、正方体、圆锥体或圆柱体中一种或二种以上，材质为聚合物材料，具体为硅胶、纤维素膜、聚醚砜膜、树脂、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和磁性复合材料。
中空容器为：内部空腔径向横截面直径为50μm-5cm的不锈钢管、20-1000μl移液器枪头、1-200ml固相萃取（SPE）管、1-200ml注射器针管、50-500μm内径毛细管或注射器滤膜腔体。
所述样品溶液为蛋白质样品、脂质体样品及高分子样品中一种或二种以上混合，该方法可用于蛋白质样品、脂质体样品及高分子样品的分析中。
具体：
1、将含有长烷基链的离子液体的样品溶液，用pH为9-14碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液，氨水、碳酸钠溶液、或氢氧化钠溶液碱性溶液调至pH>8的碱性环境；
2、采用含有磺酸基团和/或磷酸基团的硅胶或聚合物基质的阳离子交换材料作为吸附剂，吸附溶液中含长烷基链的离子液体。若吸附剂固载于固相载体上或填充于中空容器中，则将含长烷基链离子液体的样品溶液以10-1 000μL的流速直接通过吸附剂即可；若吸附剂为未被固定化的颗粒，则直接将吸附剂加入含长烷基链离子液体的溶液中，振荡3-10min。
3、若吸附剂固载于固相载体上或填充于中空容器中，则直接收集流出液，即为去除离子液体后的溶液；若吸附剂为未被固定化的颗粒，则通过离心的方法（100-30000g）分离吸附剂和溶液，收集溶液部分，即为去除离子液体后的溶液。
本发明具有如下优点：
1．去除效率高。pH>8的碱性范围内，绝大部分蛋白质或肽段成电负性，由于所带负电荷和离子液体中含有长烷基链的阳离子的正电荷相反，采用强阳离子交换材料，含有长烷基链的离子液体被保留，而蛋白质或肽段不保留，从而将离子液体和蛋白质/肽段分开。
2．操作方便、快捷。强阳离子交换材料只需和含长烷基链的离子液体充分接触，即可将两者分离。随后，采用离心或磁性分离等手段，即可回收去除离子液体后的溶液。若强阳离子交换材料被填装于柱管内或被固定化，将含离子液体的溶液通过阳离子交换材料，收集流出液即为去除离子液体后的溶液。
附图说明
图1为BSA酶解产物的MALDI-TOF质谱图。图1.用强阳离子交换材料为吸附剂（A）将其填充于捕集柱内（B）直接放入溶液中，去除离子液体后的BSA酶解产物的质谱图；（C）不含离子液体的BSA酶解产物的质谱图；（D）含离子液体的BSA酶解产物的质谱图。
具体实施方式
实施例1
1．牛血清白蛋白（BSA）样品预处理：将1mg BSA溶解于1mL4%（4g/100mL）的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑（C12Im-Cl）的50mM碳酸氢铵溶液（ABC）中，90℃下热变性10min后，加入10mM二硫苏糖醇（DTT）溶液，56℃下反应60min进行蛋白质的还原处理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA）溶液，室温下避光反应30min后进行蛋白质的烷基化处理。最后，按蛋白质/胰蛋白酶：25/1，加入40μg的胰蛋白酶（溶于50mM碳酸氢铵溶液，pH8.0），37℃酶解12小时。最后，加入10μl甲酸酸化，终止酶解。
2．含长烷基链的离子液体的去除：将强阳离子交换材料（日本东曹达，TSK-GEL SP-5PW，10μm，1000）填装于抛光不锈钢捕集柱柱管内（内径4.6cm，长1cm）。向摩尔浓度为1mg/mL BSA的酶解产物（100μL，溶于4%C12Im-Cl的50mM ABC）加入400μL1mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液（Tris-HCl，pH9.5）。随后，将上述0.2mg/mL BSA的酶解产物用1mM Tris-HCl，pH9.5作为载流液，以1mL/min的流速，用泵推动，通过强阳离子交换捕集柱，收集流出液，即为去除离子液体后的溶液。
3.MALDI-TOF分析：将收集的去除离子液体后的BSA酶解产物溶液冻干后,重溶于500μL0.1%（体积分数）三氟乙酸水溶液，即0.2mg/mL BSA酶解产物。以2-氰基-4-羟基肉桂酸（7mg/mL,溶于含0.1%（体积分数）三氟乙酸的60%乙腈水溶液）为基质，按体积比1:1混合，点样2μL，自然风干后，MALDI-TOF检测。质谱图见图1（A），鉴定结果见表1。
实施例2
1．牛血清白蛋白（BSA）样品预处理：将摩尔浓度为1mg BSA溶解于1mL4%（4g/100mL）的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑（C12Im-Cl）的50mM碳酸氢铵溶液（ABC）中，90℃下热变性10min后，加入10mM二硫苏糖醇（DTT）溶液，56℃下反应60min进行蛋白质的还原处理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA）溶液，室温下避光反应30min后进行蛋白质的烷基化处理。最后，按蛋白质/胰蛋白酶：25/1加入，40μg的胰蛋白酶（溶于50mM碳酸氢铵溶液，pH8.0），37℃酶解12小时。最后，加入10μl甲酸酸化，终止酶解。
2．含长烷基链的离子液体的去除：向1mg/mL BSA的酶解产物（100μL，溶于4%C12Im-Cl的50mM ABC）加入400μL1mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液（Tris-HCl，pH9.5）。随后，向上述溶液中加入2mg强阳离子交换材料（日本东曹达，TSK-GEL SP-5PW，10μm，1000），震荡3min后,14000g离心5min。取上清，即为去除离子液体后的溶液。
3.MALDI-TOF分析：将收集的去除离子液体后的BSA酶解产物溶液冻干后，重溶于500μL0.1%（体积分数）三氟乙酸水溶液，即0.2mg/mL BSA酶解产物。以2-氰基-4-羟基肉桂酸（7mg/mL,溶于含0.1%（体积分数）三氟乙酸的60%乙腈水溶液）为基质，按体积比1:1混合，点样2μL，自然风干后，MALDI-TOF检测。质谱图见图1（B），鉴定结果见表1。
对照组1
用不含长烷基链的离子液体的溶剂溶解BSA，进行样品预处理：将1mg BSA溶解于1mL50mM碳酸氢铵溶液（ABC）中，90℃下热变性10min后，加入10mM二硫苏糖醇（DTT）溶液，56℃下反应60min进行蛋白质的还原处理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA）溶液，室温下避光反应30min后进行蛋白质的烷基化处理。最后，按蛋白质/胰蛋白酶：25/1，加入40μg的胰蛋白酶（溶于50mM碳酸氢铵溶液，pH8.0），37℃酶解12小时。最后，加入10μl甲酸酸化，终止酶解。将BSA酶解产物稀释至0.2mg/mL，以2-氰基-4-羟基肉桂酸（7mg/mL,溶于含0.1%（体积分数）三氟乙酸的60%乙腈水溶液）为基质，按体积比1:1混合，点样2μL，自然风干后，MALDI-TOF检测。质谱图见图1（C），鉴定结果见表1。
对照组2
用含长烷基链离子液体的BSA酶解产物溶液为对照组：将1mg BSA溶解于1mL4%（4g/100mL）的氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑（C12Im-Cl）的50mM碳酸氢铵溶液（ABC）中，90℃下热变性10min后，加入10mM二硫苏糖醇（DTT）溶液，56℃下反应60min进行蛋白质的还原处理后，通入30mM碘乙酰胺（IAA）溶液，室温下避光反应30min后进行蛋白质的烷基化处理。最后，按蛋白质/胰蛋白酶：25/1，加入40μg的胰蛋白酶（溶于50mM碳酸氢铵溶液，pH8.0），37℃酶解12小时。最后，加入10μl甲酸酸化，终止酶解。将BSA酶解产物稀释至0.2mg/mL，以2-氰基-4-羟基肉桂酸（7mg/mL,溶于含0.1%（体积分数）三氟乙酸的60%乙腈水溶液）为基质，按体积比1:1混合，点样2μL，自然风干后，MALDI-TOF检测。质谱图见图1（D），鉴定结果见表1。
表1.BSA酶解产物的鉴定结果
鉴定的肽段数 鉴定的序列覆盖率
图1（A） 32 55%
图1（B） 30 51%
图1（C） 30 53%
图1（D） / /
通过表1和图1可以看出，通过该发明的方法，含有长烷基链的离子液体可以从溶液中高效去除，从而不影响质谱的检测。

Claims (9)

1.溶液样品中含长烷基链的离子液体的去除方法，其特征在于：将含有长烷基链的离子液体的样品溶液用碱性溶液调至pH≥8的碱性环境；然后采用阳离子交换材料作为吸附剂，去除含长烷基链的离子液体，最后将吸附剂和溶液分离，收集溶液。
2.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：含长烷基链的离子液体可为：阳离子部分为烷基链部分，为含6个碳或7个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子；阴离子部分为Cl-、Br-、I-、NO3 -、ClO4 -、AlCl4 -、BF4 -、PF4 -、CF3COO-、CF3SO3 -、(CF3SO2)2N-或SbF6 -。
3.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：将含有长烷基链的离子液体的样品溶液用碱性溶液调至pH为8-14的碱性环境。
4.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：含有长烷基链的离子液体的样品溶液可为：细胞提取液、胞浆提取液、血浆提取液、蛋白质溶液、多肽溶液、脂质物溶液或呈电负性的聚合物溶液。
5.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：调节pH至碱性环境所采用的碱性溶液为pH为9-14的碳酸氢铵缓冲盐溶液、pH为9-14的磷酸缓冲盐溶液、pH为9-14的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液、氨水、碳酸钠溶液、或氢氧化钠溶液。
6.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：阳离子交换材料为含有磺酸基团和/或磷酸基团的硅胶或聚合物基质材料（聚丙烯酸酯类基质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质）；材料可以是颗粒材料或者整体材料。
7.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：将吸附剂和样品溶液接触和分离的方式可以为：
将吸附剂固载于固相载体上或填充于中空容器中，将含有离子液体的样品溶液通过固相载体或中空容器，并与吸附剂接触后，直接收集；
或将吸附剂和样品溶液混合接触后，将吸附剂通过离心沉淀的方式，与含有离子液体的溶液分离；
或将吸附剂包裹于磁性颗粒上，将吸附剂和样品溶液混合接触后，通过磁力作用，与含有离子液体的样品溶液分离。
8.根据权利要求6所述的去除方法，其特征在于：
固相载体为：表面积为1cm2-10m2，形状为长方体、正方体、圆锥体或圆柱体中一种或二种以上，材质为聚合物材料，具体为硅胶、纤维素膜、聚醚砜膜、树脂、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和磁性复合材料。
中空容器为：内部空腔径向横截面直径为50μm-5cm的不锈钢管、20-1000μl移液器枪头、1-200ml固相萃取（SPE）管、1-200ml注射器针管、50-500μm内径毛细管或注射器滤膜腔体。
9.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于：所述样品溶液为蛋白质样品、脂质体样品及高分子样品中一种或二种以上混合，该方法可用于蛋白质样品、脂质体样品及高分子样品的分析中。
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CN106323705A (zh) * 2015-07-03 2017-01-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法

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