CN104203282A

CN104203282A - 稳定的水性抗体组合物

Info

Publication number: CN104203282A
Application number: CN201380017932.0A
Authority: CN
Inventors: G·卡西; B·K·德勒姆; J·耶热克; N·罗伊勒
Original assignee: Arecor Ltd
Current assignee: Arecor Ltd
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-12-10
Also published as: IN2014DN06121A; US10532098B2; ES2705538T3; WO2013114112A2; CA2861402C; WO2013114112A3; US20200138946A1; CA2861402A1; DK2809350T3; EP2809350A2; US20150010548A1; EP2809350B1; JP2015506369A

Abstract

本发明提供包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质和乙烯亚胺寡聚物的水溶液，其中寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12的范围内。

Description

稳定的水性抗体组合物

背景技术

虽然多种化学过程(如氧化、脱酰胺作用和天冬氨酸异构化)可以影响治疗性蛋白质(如抗体)的重要质量属性，但蛋白质聚集可论证地是最常见的影响蛋白质稳定性的过程。聚集通常是加重的，且是以高浓度(如10mg/ml或更高)配制在水溶液中的蛋白质的关键降解途径。在保存期间，聚集可以导致制剂中不可接受的高水平的高分子量种类(HMWS)，或导致更大的不溶性聚集体(微粒)的形成。这类受污染的制剂可以落在美国食品与药品管理局及其他药物监管机构设定的规格之外。

在某种程度上，可以通过优化蛋白质组合物的多种参数来控制蛋白质聚集。例如，控制聚集率的方法可以涉及优化pH、加入金属离子螯合剂或加入表面活性剂。

组合物的离子强度也可以影响水性蛋白质组合物的聚集率。因此，治疗性蛋白质的常规制剂开发通常包括渗涨度调节剂(tonicity modifier)的筛选，渗涨度调节剂可以选自不带电荷的化学种类，如糖，或带电荷的化学种类，如无机盐或有机盐。如果聚集率在低离子强度组合物中较低，则通常优选不带电荷的渗涨度调节剂，如果聚集率在较高离子强度组合物中较低，则优选带电荷的渗涨度调节剂。通常在用于治疗性应用的水性蛋白质组合物中使用的带电荷的渗涨度调节剂包括氯化钠。典型的不带电荷的渗涨度调节剂包括蔗糖、海藻糖、甘油和甘露醇。

蛋白质聚集是非常复杂的过程，涉及许多不同的机制。但是，据信，两种主要类型的非共价相互作用驱动蛋白质聚集：(1)蛋白质分子的非极性部分之间的疏水相互作用；和(2)蛋白质分子的带电荷区域之间的电荷-电荷相互作用。据信，当聚集率在较高离子强度的组合物中比在较低离子强度的组合物中低的那些情况下，聚集的关键原因是由于蛋白质分子之间的电荷-电荷相互作用。

但是，如果能够控制蛋白质聚集的溶液和组合物将用于治疗性应用，则它们显示有利的毒性谱也至关重要。因此，可以用来降低蛋白质聚集率的任意添加剂自身必须具有有利的毒性谱。

因此，存在对用于制备稳定、高度浓缩的蛋白质溶液，尤其是具有有利的毒性谱并因此适合用于治疗性应用的高度浓缩的抗体溶液的改进方法的需要。

US 2007/0036866(Kissel等)描述了包含PEI和PEG残基的阳离子嵌段聚合物。

发明概述

本发明涉及抗体蛋白质，尤其是处于高浓度的抗体蛋白质的聚集问题。本发明还涉及提供显示有利的毒性谱且适合用于治疗性应用的浓缩抗体溶液的问题。预期本发明的应用导致水性抗体蛋白质组合物中的聚集率显著降低，同时提供显示有利的毒性谱并因此可以用于治疗性应用的组合物。本发明还涉及抗体蛋白质及尤其是处于高抗体蛋白质浓度的抗体蛋白质水性组合物中的自缔合问题，同时提供抗体蛋白质的显示有利毒性谱的治疗用组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质和乙烯亚胺的寡聚物的水溶液，其中该寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12的范围内。

在一个实施方案中，本发明提供降低浓度为至少约10mg/mL的水溶液中的抗体蛋白质的聚集率的方法。该方法包括向该溶液中加入乙烯亚胺的寡聚物的步骤，其中n＝2-12。

在一个实施方案中，本发明可以提供降低抗体浓度为至少约10mg/mL的水性抗体蛋白质溶液在保存期间的黏度增加速率的方法。该方法包括向该溶液中加入乙烯亚胺的寡聚物的步骤，其中n＝2-12。

在一个实施方案中，本发明可以提供降低浓度为至少约10mg/mL的水溶液中的抗体蛋白质的不希望的片段化的速率，该速率通过保存期间低分子量种类的形成来检测。具体而言，这种不希望的片段化可以发生在包含一种或多种抗体片段的融合蛋白质中。该方法包括向该溶液中加入乙烯亚胺的寡聚物的步骤，其中n＝2－12。

本文公开的某些乙烯亚胺寡聚物是新的，因此作为本发明的一个方面要求保护。因此，本发明还提供式(V)的化合物：

X-Y₁-[CH₂CH₂NH]_n-R

式V

其在下文中更详细地描述，其用于本发明的溶液、组合物和方法。

预期本文所述实施方案的溶液和组合物显示有利的毒性谱并因此适合用于治疗性应用。

附图简述

图1A-1F显示乙烯亚胺的PEG化和非PEG化寡聚物及5k mPEG在40℃对利妥昔单抗(rituximab)制剂的聚集率的影响。

图2显示PEI的大小对HEK293和Vero细胞的细胞毒性作用的影响。

图3显示乙烯亚胺寡聚物的大小对Vero细胞抑制的影响。每个点旁边的数字表示所测试的寡聚物或聚合物的分子量(Da)。

图4显示乙烯亚胺寡聚物的大小对MDCK细胞抑制的影响。每个点旁边的数字表示所测试的寡聚物的分子量(Da)。

图5显示五亚乙基六胺和2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺(化合物(1))对Vero细胞抑制的影响。

发明详述

本发明涉及其中n＝2-12的乙烯亚胺寡聚物稳定高度浓缩的抗体水溶液(即至少约10mg/mL的浓度)同时预期显示有利的毒性谱的发现。具体而言，预期本发明的乙烯亚胺寡聚物显示比高级同系物(例如，分子量大于600Da的聚乙烯亚胺)更有利的毒性谱。

由于此预期的有利毒性谱，本发明尤其适用于治疗性应用的抗体蛋白质的水性组合物。

与现有的用于稳定抗体蛋白质的高浓度水性制剂的方法相比，尤其是就降低的聚集率和可逆的自缔合而言，本发明提供了几个优势。例如，本发明应允许更合理的制剂开发方法，在设计试验制剂中需要更少的试验和差错。结果是，这使得能够以加速、更低成本的途径来优化符合保存稳定性和对低体积皮下注射的适合性的关键性能要求的制剂。

与现有技术的方法相比，本发明所显示的稳定性益处和预期的有利毒性谱应使得能够使用治疗上重要的抗体蛋白质的更高浓度水性制剂。

本文所用的术语“抗体蛋白质”指抗体、抗体片段、与活性部分缀合的抗体、包含一种或多种抗体片段(如免疫球蛋白Fc结构域)的融合蛋白质、或前述任一种的衍生物。衍生物的实例包括缀合衍生物，例如，与另一部分缀合的抗体或抗体片段。这类部分包括化学惰性聚合物，如PEG。优选的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，优选单克隆抗体。单克隆抗体可以是例如哺乳动物或禽类抗体、嵌合抗体(例如人/小鼠或人/灵长类嵌合体)、人源化抗体或全人抗体。适宜的抗体包括免疫球蛋白，如IgG(包括IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)、IgM、IgA(如IgA₁或IgA₂)、IgD、IgE或IgY。适宜的抗体还包括单链抗体。还包括抗体片段，包括Fc、Fab、Fab₂、ScFv片段等。还包括单结构域抗体，包括纳米抗体。

抗体蛋白质优选是治疗性抗体蛋白质。这种抗体蛋白质具有希望的治疗或预防活性，且标示用于治疗、抑制或预防疾病或医学障碍。

术语“PEI”指聚乙烯亚胺(包含多个重复基团的乙二胺聚合物)，其可以可选地被衍生化。

术语“OEI”指包含2-12个重复单位的乙烯亚胺寡聚物，其可以可选地被衍生化。

本文所用的术语“水溶液”指水中，优选蒸馏水、去离子水、注射用水、无菌注射用水或注射用制菌水中的溶液。本发明的水溶液包含溶解的抗体蛋白质、乙烯亚胺寡聚物及可选的一种或多种添加剂和/或赋形剂。水溶液还可以包含一种或多种部分溶解或不溶解的成分，如添加剂或赋形剂。这种或这类成分的存在将产生多相组合物，如悬液或乳状液。优选地，如通过眼睛或光散射确定，本发明的水溶液是均相溶液。

寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物通常基本上由其中n在2-12范围内的化学式-(CH₂CH₂NH)_n-的部分或其支化衍生物组成，或包含其中n在2-12范围内的化学式-(CH₂CH₂NH)_n-的部分或其支化衍生物。线性乙烯亚胺寡聚物仅包含仲氨基(不考虑寡聚物的末端官能度)，而支化的乙烯亚胺寡聚物可以包含伯氨基、仲氨基和叔氨基。在本发明中，也考虑包含线性和支化的乙烯亚胺寡聚物的混合物的水溶液。适宜地，本发明的乙烯亚胺寡聚物是线性的。

例如，n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9、n＝10、n＝11或n＝12。在一个实施方案中，n＝3-12、4-12、5-12或6-12。在另一实施方案中，n＝2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6或2-5，例如3-5。在另一实施方案中，n＝3-9、4-8或5-7。还在另一实施方案中，n＝2-11、3-11、4-10、5-9或6-8。还在另一实施方案中，n＝4-7、4-6或4-5。其中n＝2-12的乙烯亚胺寡聚物可以是衍生化的或未衍生化的。在一个实施方案中，乙烯亚胺寡聚物是未衍生化的，且适宜地选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺。未衍生的乙烯亚胺寡聚物成本较低，且比对应的衍生化寡聚物更易于获得。

术语“乙烯亚胺寡聚物”包括其中例如通过惰性聚合物或封端基团衍生化(例如化学修饰)寡聚物的一个或多个末端的衍生物。

本文所用的“C₁-C₆烷基”定义为包含1-6个碳原子的直链或支化的脂肪族碳链，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基，及对应的亚烷基，如亚甲基、1,2-亚乙基等。

还可以用化学惰性聚合物衍生化乙烯亚胺寡聚物。除非另有说明，本文所用的术语“聚合物”包括共聚物。化学惰性聚合物可以例如通过提高水溶性、提高稳定性或降低毒性来赋予乙烯亚胺寡聚物本身物理化学益处。备选地或此外，化学惰性聚合物可以例如通过增强乙烯亚胺寡聚物在减少抗体蛋白质聚集中的作用来赋予水溶液中的抗体蛋白质物理化学益处。在一个实施方案中，用选自聚乙二醇(PEG和mPEG(mPEG是用甲氧基封端的聚乙二醇聚合物))、聚丙二醇(PPG)和聚氨基酸的一种或多种聚合物衍生化乙烯亚胺寡聚物。在另一实施方案中，用共聚物衍生化乙烯亚胺寡聚物，其中该共聚物由选自聚乙二醇(PEG和mPEG)、聚丙二醇(PPG)和聚氨基酸的聚合物(和/或其相关单体)组成。适宜的聚氨基酸包括具有不带电荷的侧链或无侧链的那些，且包括聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸和聚苯丙氨酸。适宜地，用一个或多个聚乙二醇(PEG)基团衍生化乙烯亚胺寡聚物。

在用化学惰性聚合物衍生化乙烯亚胺寡聚物时，该聚合物通常具有约500至约10000Da，例如约1000至约5000Da的范围内的分子量。

聚合物聚乙二醇(例如PEG和mPEG)、聚丙二醇(PPG)在化学式上定义为PEG-O-、mPEG-O-和PPG-O-(及其共聚物)，即PEG、mPEG、PPG或共聚物分子在作为衍生物发挥作用时以-O-终止。例如，在代表性化学式PEG-O-(CH₂CH₂NH)₄H或PEG-O-OEI中，-O-部分与PEG分子缔合而不是与乙烯亚胺寡聚物缔合。在这种背景下，本文所用的“PEG”和“PEG-O-”应认为是在结构上等同，只是在后一种情况下，明确地定义了PEG的末端基团。以类似的方式，取决于它所结合的寡聚物上的基团的官能度，本文在化学式上将聚氨基酸定义为包括氨基端或羧基端。例如，在代表性化学式[聚氨基酸]-NH-(CH₂CH₂NH)₄H中，-NH-部分与聚氨基酸缔合。备选地，在代表性化学式H₂N-(CH₂CH₂NH)₄-C(O)-[聚氨基酸]中，-C(O)-部分与聚氨基酸缔合。

如果存在的话，化学惰性聚合物可以是封端的，即以通常与具体聚合物相关的官能度不同的官能度终止。例如，在一个实施方案中，该化学惰性聚合物是聚乙二醇，且用甲氧基封端，即MeOCH₂CH₂-PEG-O-。如之前所述，用甲氧基封端的聚乙二醇聚合物可以表示为“mPEG”。在优选实施方案中，用一个或多个PEG或mPEG基团衍生化乙烯亚胺寡聚物。PEG或mPEG亚单位可以选择最佳大小。在一个实施方案中，PEG或mPEG为约500Da至约10000Da，例如约1000Da、2000Da或5000Da。希望得到PEG和mPEG亚单位的低多分散性。优选地，多分散性小于1.2，更优选小于1.1。

可以通过可选的桥连基(即定位在乙烯亚胺寡聚物和衍生化基团(例如封端基团或载体基团或化学惰性聚合物)之间的基团)来衍生化乙烯亚胺寡聚物。可选的桥连基优选具有低反应性，且对本发明的组合物的水溶液中的水解稳定。例如，适宜的桥连基包括羰基、酰胺、氨基甲酸酯和脲。可选地，可以在该桥连基和衍生化基团之间***亚烷基(如C₂-C₁₀亚烷基或C₃-C₁₀亚烷基)。优选地，桥连基是可选地与亚烷基连接的酰胺。在备选实施方案中，桥连基仅由C₃-C₁₀亚烷基组成，适宜地，C₃-C₆亚烷基，更适宜地，C₃或C₄亚烷基，其在乙烯亚胺寡聚物的一个末端与NH直接连接。

可以按上文所述衍生化乙烯亚胺寡聚物，其中衍生化寡聚物的一个或多个末端。备选地，可以衍生化乙烯亚胺寡聚物的一个或多个末端，且可以用-H或惰性封端基团封端寡聚物的一个或多个备选末端。

适宜的惰性封端基团包括-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)。优选的封端基团是CH₂CH₂OH。

备选地，乙烯亚胺寡聚物可以是未衍生化的，但可以用-H或上文所述的惰性封端基团在寡聚物的一个或多个末端封端。

上文所述的任意乙烯亚胺寡聚物可以是线性的或支化的。

在一个实施方案中，提供式I的乙烯亚胺寡聚物：

R-K-[CH₂CH₂NH]_n-R

式I

其中，K代表O或NH，n＝2-12，且每个R独立地是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

在一个实施方案中，K代表NH。

在一个实施方案中，提供式II的乙烯亚胺寡聚物：

X-Y₁-[CH₂CH₂NH]_n-Y₂-X

式II

其中，n＝2-12，每个X独立地选自聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)、聚丙二醇(PPG-O-)和聚氨基酸；Y₁是可选的，且选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和-(CH₂)_mK-，其中m＝3-10，K代表O或NH；Y₂选自-C(O)-(C₀-C₆)烷基-、-C(O)O(C₂-C₆)烷基-、–C(O)-NH-(C₂-C₆)烷基-和-(CH₂)_m-，其中m＝2-10。

在一个实施方案中，可选的Y₁选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和-(CH₂)_mK-，其中m＝3-10，K代表NH。

在一个实施方案中，可选的Y₁选自–(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，K代表O或NH。

在一个实施方案中，可选的Y₁选自–(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，K代表NH。

在一个实施方案中，Y₂选自-C(O)-(C₂-C₆)烷基-、-C(O)O(C₂-C₆)烷基-、–C(O)-NH-(C₂-C₆)烷基-和-(CH₂)_m，其中m＝2-10。

在备选实施方案中，提供式III的乙烯亚胺寡聚物：

X-Y₁-[CH₂CH₂NH]_n-R

式III

其中，n＝2-12；X选自聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)、聚丙二醇(PPG-O-)和聚氨基酸；Y₁是可选的，且选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，K代表O或NH；R是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

在一个实施方案中，Y₁是可选的，且选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，K代表NH。

在式(III)的一个实施方案中，n＝2-12；X是PEG-O-或mPEG-O-，Y₁缺乏，R是–H或-CH₂CH₂OH。在另一实施方案中，n＝2-12；X是mPEG-O-；Y₁缺乏，R是-H。在另一实施方案中，n＝2-12；X是mPEG-O-；Y₁缺乏，R是-CH₂CH₂OH。在另一实施方案中，n＝2-8；X是mPEG-O-；Y₁缺乏，R是-CH₂CH₂OH。在另一实施方案中，n＝2；X是mPEG-O-；Y₁缺乏，R是-CH₂CH₂OH。在另一实施方案中，n＝5；X是mPEG-O-；Y₁缺乏，R是-CH₂CH₂OH。在另一实施方案中，n＝8；X是mPEG-O-；Y₁缺乏，R是-CH₂CH₂OH。

在式(III)的一个实施方案中，n＝2-12；X是mPEG-O-，Y₁存在，且选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和-(CH₂)_mK-，其中m＝3-10，K代表O或NH；R是-H或CH₂CH₂OH。在另一实施方案中，n＝4-8；X是m PEG-O-；Y是–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-，R是-H。在另一实施方案中，n＝5；X是mPEG-O-；Y是-(C₂)烷基-C(O)-NH-，R是-H。在另一实施方案中，n＝5；X是mPEG-O-；Y是-(C₄)烷基-C(O)-NH-，R是-H。

在备选实施方案中，提供式IV的乙烯亚胺寡聚物：

R-K-[CH₂CH₂NH]_n-Y₂-X₂

式IV

其中，n＝2-12，K代表O或NH；X₂选自聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)、聚丙二醇(PPG-O-)和聚氨基酸；Y₂选自-C(O)-(C₀-C₆)烷基-、-C(O)O(C₂-C₆)烷基-、–C(O)-NH-(C₂-C₆)烷基-和-(CH₂)_m-，其中m＝2-10；R是-H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

在式IV的一个实施方案中，n＝2；K表示O，X₂是mPEG-O-；Y₂是-C(O)-(C₂)烷基-；R是-H。类似地，在式IV的另一实施方案中，n＝2；K代表O；X₂是mPEG-O-；Y₂是–(CH₂)₃-；R是–H。在一个实施方案中，Y₂选自-C(O)-(C₂-C₆)烷基-、-C(O)O(C₂-C₆)烷基-、–C(O)-NH-(C₂-C₆)烷基-和-(CH₂)_m-，其中m＝2-10。

可以通过常规方法制备乙烯亚胺寡聚物(包括其衍生物)，例如通过包括以下的步骤：

(i)聚合乙烯亚胺或聚合2-甲基-2-唑啉或2-乙基-2-唑啉，然后通过碱水解脱酰。例如，此方法可应用于制备用mPEG衍生化的乙烯亚胺寡聚物，其中用mPEG衍生物mPEG-X(其中X是NH₂、OH、O-甲磺酰基或O-甲苯磺酰基)作为聚合的起始反应剂。这类方法可以基于Kissel等在US20070036866A1中及Akiyama等在Macromolecules,2000,33,5841-5845中所述的那些方法。

(ii)通过与载体聚合物的活化羧基衍生物反应来酰化预形成的乙烯亚胺寡聚物。例如，在基于mPEG的载体聚合物的情况下，适宜的活化羧基衍生物是mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯和mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，从而掺入烷基-酰胺桥连基。这类方法可以基于Wagner等在US20040248842A1中及Schluep在US20050031579A1中所述的那些方法。

(iii)使预形成的乙烯亚胺寡聚物与载体聚合物的异氰酸酯衍生物反应，从而掺入烷基-脲桥连基。例如，在基于mPEG的载体聚合物的情况下，从mPEG-醇和1,6-己二异氰酸酯制备适宜的异氰酸酯衍生物。这类方法可以基于Petersen等在Macromolecules 2002,35,6867-6874中所述的那些方法。

(iv)利用预形成的乙烯亚胺寡聚物和载体聚合物的醛衍生物的还原性胺化，从而掺入(CH₂)_m桥连基。例如，在基于mPEG的载体聚合物的情况下，适宜的醛衍生物是mPEG丙醛和mPEG丁醛。也可以利用相应的醛水合物。这类方法可以基于例如Kintsler在US5824784中及Bentley和Harris在US5990237中所述的用于蛋白质的N端PEG化的那些方法。

示例性条件描述于实施例章节中。

乙烯亚胺寡聚物可以以游离碱形式或以盐的形式加至本发明的水溶液或组合物。水溶液或组合物的pH优选足够低，使得乙烯亚胺寡聚物的至少部分碱性基团在溶液中质子化。通常，本发明的水溶液或组合物的pH在4至8，例如5.0至7.5或5.5至7.0的范围内。优选地，本发明的水溶液或组合物的pH可以在5.5至6.0、6.0至6.5或6.5至7.0的范围内。

乙烯亚胺寡聚物还可以作为适宜的酸(如可药用酸)的盐加至水溶液或组合物。适宜的酸包括盐酸、氢溴酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、磷酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、马来酸、延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、丙二酸、硫酸、L-谷氨酸、酒石酸、L-天冬氨酸、丙酮酸、粘酸、苯甲酸、葡糖醛酸、草酸和抗坏血酸。在一个实施方案中，该酸是包含两个或多个酸性基团的多酸。应注意，虽然式I、II、III和IV的衍生化聚乙二醇寡聚物以未质子化的氮中心显示，但这些化学式的部分或实际上全部碱性氮中心质子化的寡聚物也旨在认为包含在本发明的范围之内。考虑其中部分或全部碱性氮中心质子化的未衍生化的乙烯亚胺寡聚物的所有实施方案也认为包含在本发明的范围之内。

在一个实施方案中，乙烯亚胺寡聚物的50-100％的碱性氮中心质子化。在另一实施方案中，乙烯亚胺寡聚物的80-100％的碱性氮中心质子化。优选地，乙烯亚胺寡聚物的至少95％的碱性氮中心质子化。不希望受限于理论，考虑在乙烯亚胺寡聚物的至少95％的碱性氮中心质子化时，掩盖了抗体蛋白质表面的高电荷密度，从而抑制抗体蛋白质的聚集。具体而言，不希望受限于理论，考虑乙烯亚胺寡聚物掩盖了抗体蛋白质表面带负电荷的区块，从而抑制抗体蛋白质的电荷驱动的聚集。

在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液的pH低于蛋白质的等电点(pI)。在一个实施方案中，抗体蛋白质的pI高于溶液的pH，适宜地，高至少0.5个单位，更适宜地，高0.5至5个单位之间，甚至更适宜地，高1至3个单位之间。在一个实施方案中，抗体蛋白质的pI为至少7，例如，在7-10或7.5-9的范围内。

在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液是等渗的。在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液是高渗的。在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液是低渗的。

乙烯亚胺寡聚物以足以提供希望的稳定性的浓度存在于组合物中。在一个实施方案中，乙烯亚胺寡聚物的浓度从约0.01至约10mg/mL，例如从约0.01至约0.1mg/mL、约0.1至约0.25mg/mL、约0.25至约1mg/mL、约1至约2mg/mL、约2至约5mg/mL或约5至约10mg/mL。在一个实施方案中，乙烯亚胺寡聚物的浓度为约0.2mg/mL至约2mg/mL。如本文中所使用，本发明的组合物中乙烯亚胺寡聚物的质量指游离碱当量，即它不包括任何抗衡阴离子(如果存在)。

在某些实施方案中，抗体蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的比(wt/wt)为至少10，例如，至少20。在某些实施方案中，蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的重量比从约20至约300，优选从约50至约200。在某些实施方案中，蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的重量比为约100。在某些实施方案中，蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的重量比可以高于300，例如，高达500、800或1000。这些重量比指排除任意衍生化基团(例如PEG基团)的乙烯亚胺寡聚物含量本身的重量。在一个实施方案中，抗体蛋白质与寡聚物的比(wt/wt)从约100至约200。

本发明的溶液优选包含缓冲剂。通常，选择缓冲剂来提供允许蛋白质溶解至希望的浓度的pH。优选地，pH足够低，使得乙烯亚胺寡聚物中的至少部分碱性基团质子化。还可以选择缓冲剂来增强蛋白质稳定性。

本发明人已研究了乙烯亚胺寡聚物和聚合物的大小对细胞毒性的影响，如实施例7和8中所述。结果显示在图2、3和4中，并清楚地证明，随着聚乙烯亚胺的大小的减小，其细胞毒性作用也减小。证明了重量从约50,000Da减小至约800Da的聚乙烯亚胺的逐渐减小的细胞毒性(见实施例7)。此细胞毒性逐渐减小的趋势可以合理地外推，暗示寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内(即重量<800Da)的乙烯亚胺寡聚物将具有甚至更低的细胞毒性。实际上，进一步证明了向下至约100Da的逐渐降低的细胞毒性(见实施例8)。不希望受限于理论，本发明人认为，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物具有足够的大小来掩盖抗体蛋白质表面具有高电荷密度的区域，从而解决浓缩溶液中抗体蛋白质聚集的问题。具体而言，不希望受限于理论，考虑n＝2-12的乙烯亚胺寡聚物具有足够的大小来掩盖抗体蛋白质的具有高负电荷密度的区块，从而解决浓缩溶液中电荷驱动的抗体蛋白质聚集的问题。此外，作为本发明人的研究的结果(见图2、3和4)，且同样不希望受限于理论，本发明人认为，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物还具有足够小的大小，以避免施加与细胞膜的破坏相关的任意毒性作用。因此，这类寡聚物可以减少浓缩抗体蛋白质溶液中的聚集，同时显示有利的毒性谱。因此，这类寡聚物在治疗性应用中尤其有用。

如实施例1-6中所述，已发现，在相同条件下保存相同时长后，与缺乏该乙烯亚胺寡聚物但其他方面相似或相同的组合物相比，本文定义的乙烯亚胺寡聚物可以显著降低组合物(如水性抗体蛋白质溶液)中抗体蛋白质的聚集率。

在一个实施方案中，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在将高分子量蛋白质种类的增加限制于在40℃保存一个月后不超过5％(按总蛋白质重量计)，适宜地，不超过3％，更适宜地，不超过2％。在一个实施方案中，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在将高分子量蛋白质种类的增加限制于在2-8℃保存多达两年后不超过5％(按总蛋白质重量计)，适宜地，不超过3％，更适宜地，不超过2％。高分子量种类的定量按组合物中总蛋白质的重量的百分比计。

在一个实施方案中，在相同条件下保存相同时长后，与缺乏乙烯亚胺寡聚物但其他方面相同的组合物相比，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在将高分子量蛋白质种类的增加限制了至少10％，优选至少25％，更优选至少50％。

在一个实施方案中，在相同条件下保存相同时长后，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在保持蛋白质的水性组合物不含可见聚集体，而在缺乏乙烯亚胺寡聚物但其他方面相同的组合物中观察到了可见聚集体的形成。可见聚集体的定量可以通过浊度或其他类型的光散射测量来进行。

在某些实施方案中，将抗体融合或缀合至活性分子，如毒素或能够结合诸如⁹⁹Tc、¹¹¹Ir、¹³¹I或⁹⁰Y的放射性金属离子的螯合剂。在这类实施方案中，抗体通常作为靶向剂发挥作用，例如将活性分子定向至展示某种细胞表面蛋白质的细胞。

可以按本文所述配制的具体抗体包括但不限于：英夫利昔单抗(infliximab)(嵌合抗体，抗-TNFα)、阿达木单抗(adalimumab)(人抗体，抗-TNFα)、巴利昔单抗(basiliximab)(嵌合抗体，抗-IL-2)、阿昔单抗(abciximab)(嵌合抗体，抗-GpIIb/IIIa)、达利珠单抗(daclizumab)(人源化抗体，抗-IL-2)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(人源化抗体，抗-CD33)、阿伦单抗(alemtuzumab)(人源化抗体，抗-CD52)、依决洛单抗(edrecolomab)(鼠Ig2a，抗-EpCAM)、利妥昔单抗(嵌合抗体，抗-CD20)、帕利珠单抗(palivizumab)(人源化抗体，抗-呼吸道合胞病毒)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(人源化抗体，抗-HER2/neu(erbB2)受体)、贝伐单抗(bevacizumab)(人源化抗体，抗-VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab)(嵌合抗体，抗-EGFR)、艾库组单抗(eculizumab)(人源化抗体，抗-补体***蛋白质C5)、依法利珠单抗(efalizumab)(人源化抗体，抗-CD 1Ia)、替伊莫单抗(ibritumomab)(鼠抗体，抗-CD20)、莫洛单抗-CD3(muromonab-CD3)(鼠抗体，抗-T细胞CD3受体)、那他珠单抗(natalizumab)(人源化抗体，抗-α4整联蛋白)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(人源化IgG，抗-EGF受体)、奥马珠单抗(omalizumab)(人源化抗体，抗-IgE)、帕尼单抗(panitumumab)(人抗体，抗-EGFR)、兰尼单抗(ranibizumab)(人源化抗体，抗-VEGF)、1-131托西莫单抗(tositumomab)(人源化抗体，抗-CD20)、奥法木单抗(ofatumumab)(人抗体，抗-CD-20)、赛妥珠单抗(certolizumab)(人源化抗体，抗-TNF-α)、戈利木单抗(golimumab)(人抗体，抗-TNFα)和地诺单抗(denosumab)(人抗体，抗-RANK配体)。优选的抗体包括曲妥珠单抗和利妥昔单抗。另一种目的抗体是英夫利昔单抗。

可以按本文所述配制的其他嵌合抗体包括巴维昔单抗(bavituximab)(抗-磷酯酰丝氨酸)、brentuximab(抗-CD30)、司妥昔单抗(siltuximab)(抗-IL-6)、克立昔单抗(clenoliximab)(抗-CD4)、加利昔单抗(galiximab)(抗-CD80)、鲁昔单抗(gomiliximab)(抗-CD23)、凯利昔单抗(keliximab)(抗-CD4)、鲁西单抗(lumiliximab)(抗-CD23)、普立昔单抗(priliximab)(抗-CD4)、替奈昔单抗(teneliximab)(抗-CD40)、伐利昔单抗(vapaliximab)(抗-VAP1)、依美昔单抗(ecromeximab)(抗-GD3)和帕基昔单抗(pagibaximab)(抗-葡萄球菌脂磷壁质)。

可以按本文所述配制的其他人源化抗体包括依帕珠单抗(epratuzumab)(抗-CD22)、阿夫土株单抗(afutuzumab)(抗-CD20)、比伐单抗(bivatuzumab mertansine)(抗-CD44)、坎图珠单抗(cantuzumabmertansine)(抗-黏蛋白)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)(抗-TACSTD1)、达塞珠单抗(dacetuzumab)(抗-CD40)、elotuzumab(抗-CD319)、伊瑞珠单抗(etaracizumab)(抗-α_vβ₃-整联蛋白)、farletuzumab(抗-FRα)、沃伊图珠单抗(inotuzumab ozogamicin)(抗-CD22)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(抗-癌胚抗原)、林妥珠单抗(lintuzumab)(抗-CD33)、米拉图单抗(milatuzumab)(抗-CD74)、尼妥珠单抗(抗-EGFR)、oportuzumabmonatox(抗-EpCAM)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(抗-HER2)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)(抗-FAP)、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)(抗-甲胎蛋白)、替加珠单抗(tigatuzumab)(抗-TRAIL-2)、图考珠单抗(tucotuzumabcelmoleukin)(抗-EpCAM)、维妥珠单抗(veltuzumab)(抗-CD20)、阿塞珠单抗(aselizumab)(抗-CD62L)、阿泊珠单抗(apolizumab)(抗-HLA-DRB)、benralizumab(抗-CD125)、西利珠单抗(cedelizumab)(抗-CD4)、依帕珠单抗(抗-CD22)、厄利珠单抗(erlizumab)(抗-CD18)、芳妥珠单抗(fontolizumab)(抗-干扰素-γ)、美泊利单抗(mepolizumab)(抗-IL5)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(抗-CD20)、帕考珠单抗(pascolizumab)(抗-IL4)、培克珠单抗(pexelizumab)(抗-补体组分5)、PRO-140(抗-CCR5)、瑞利珠单抗(reslizumab)(抗-IL5)、隆塔珠单抗(rontalizumab)(抗-干扰素-α)、罗维珠单抗(rovelizumab)(抗-CD11、CD18)、西利珠单抗(siplizumab)(抗-CD2)、他利珠单抗(talizumab)(抗-IgE)、替丽珠单抗(teplizumab)(抗-CD3)、托珠单抗(tocilizumab)(抗-IL6R)、维多珠单抗(vedolizumab)(抗-α₄β₇-整联蛋白)、维西珠单抗(visilizumab)(抗-CD3)、伊利珠单抗(ibalizumab)(抗-CD4)、替巴珠单抗(tefibazumab)(抗-聚集因子A)、他西珠单抗(tadocizumab)(抗-α_11bβ₃-整联蛋白)、内珠单抗(bapineuzumab)(抗-淀粉状-β)、solanezumab(抗-淀粉状-β)、他尼珠单抗(tanezumab)(抗-NGF)、乌珠单抗(urtoxazumab)(抗-大肠杆菌志贺样毒素II B亚基)、非维珠单抗(felvizumab)(抗-呼吸道合胞病毒)、莫维珠单抗(motavizumab)(抗-呼吸道合胞病毒糖蛋白F)和lebrikizumab(抗-IL13)。

可以按本文所述配制的其他人抗体包括阿托木单抗(atorolimumab)(抗-Rh因子)、夫苏木单抗(fresolimumab)(抗-TGFβ-1、-2和-3)、乐德木单抗(lerdelimumab)(抗-TGFβ-2)、美替木单抗(metelimumab)(抗-TGFβ-1)、莫罗木单抗(morolimumab)(抗-Rh因子)、伊匹单抗(ipilimumab)(抗-CTLA-4)、曲利木单抗(tremelimumab)(抗-CTLA-4)、柏替木单抗(bertilimumab)(抗-CCL11)、扎木单抗(zanolimumab)(抗-CD4)、巴列津单抗(briakinumab)(抗-IL12、-23)、康纳单抗(canakinumab)(抗-IL1β)、优特克单抗(ustekinumab)(抗-IL12、-23)、阿德姆单抗(adecatumumab)(抗-EpCAM)、贝利单抗(belimumab)(抗-B细胞激活因子)、西妥木单抗(cixutumumab)(抗-IGF-1受体)、可那木单抗(conatumumab)(抗-TRAIL-R2)、figitumumab(抗-IGF-1受体)、伊妥木单抗(iratumumab)(抗-CD30)、来沙莫单抗(lexatumumab)(抗-TRAIL-R2)、鲁图莫单抗(lucatumumab)(抗-CD40)、马帕木单抗(mapatumumab)(抗-TRAIL-R4)、necitumumab(抗-EGFR)、olaratumab(抗-PDGF-Rα)、普林木单抗(pritumumab)(抗-波形蛋白)、罗妥木单抗(robatumumab)(抗-IGF-1受体)、伏妥莫单抗(votumumab)(抗-肿瘤抗原CTAA16.88)、杂鲁木单抗(zalutumumab)(抗-EGFR)、斯达卢单抗(stamulumab)(抗肌生成抑制素)、依芬古单抗(efungumab)(抗真菌HSP90)、艾韦单抗(exbivirumab)(抗-乙型肝炎表面抗原)、foravirumab(抗-狂犬病糖蛋白)、利韦单抗(libivirumab)(抗-乙型肝炎表面抗原)、瑞非韦鲁单抗(rafivirumab)(抗-狂犬病糖蛋白)、瑞加韦单抗(regavirumab)(抗-巨细胞病毒糖蛋白B)、司韦单抗(sevirumab)(抗-巨细胞病毒)、妥韦单抗(tuvirumab)(抗-乙型肝炎病毒)、panobacumab(抗-铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型IATS011)、雷西巴单抗(raxibacumab)(抗-炭疽毒素)、雷莫芦单抗(ramucirumab)(抗-VEGF-R2)和刚奈鲁单抗(gantenerumab)(抗-淀粉状-β)。

包含免疫球蛋白分子的片段的融合蛋白质也可以按照本发明配制。适宜的融合蛋白质包括含有与一个或多个免疫球蛋白片段(如Fc结构域)融合的活性蛋白质结构域的蛋白质。这类融合蛋白质包括具有单体单位的二聚体蛋白质，该单体单位包含诸如可溶性受体或受体胞外配体结合结构域的活性蛋白质结构域，该活性蛋白质结构域与免疫球蛋白Fc结构域融合。两个Fc结构域可以通过二硫键结合形成二聚体蛋白质。这类融合蛋白质包括依那西普(etanercept)、阿巴西普(abatacept)和贝拉西普(belatacept)。

包含抗体(或一个或多个抗体片段)和诸如PEG的化学惰性聚合物的缀合衍生物也可以按照本发明配制。这类衍生物包括赛妥珠单抗(certolizumab pegol)。

抗体蛋白质可以分离自天然来源或可以是重组蛋白质。

在某些实施方案中，抗体蛋白质基本上纯，也就是说，组合物包含单种蛋白质，且无实质性量的任意额外蛋白质。在优选实施方案中，蛋白质包含组合物的总蛋白质含量的至少99％、优选至少99.5％和更优选至少约99.9％。在优选实施方案中，蛋白质对在药物组合物中的用途而言足够纯。

水溶液中抗体蛋白质的浓度为至少约10mg/mL，且优选在约25mg/mL至约400mg/mL的范围内。在某些实施方案中，浓度为至少约25mg/mL。在某些实施方案中，蛋白质浓度为至少约30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。更优选地，蛋白质浓度高于50mg/mL，例如至少约80mg/mL。浓度可以是多达约400mg/mL，例如多达约350mg/mL、300mg/mL、250mg/mL、200mg/mL或175mg/mL。本文考虑通过前述下限之一和前述上限之一限定的每个浓度范围。

本文所用的术语“可药用”指药物组合物的成分，其适合用于预期的用途及对人或动物(如哺乳动物)身体施用的方式而无过度的不良结果，如毒性、刺激和***反应，且具有合理的风险/收益比。

适宜地，本发明的组合物包含缓冲剂来稳定组合物的pH，还可以选择缓冲剂来增强蛋白质稳定性。在一个实施方案中，选择具有接近组合物pH的pKa的缓冲剂；例如，在组合物的pH在4.5-5.5范围内时，适宜地利用乙酸作为缓冲剂，在组合物的pH在5.6-6.5范围内时，适宜地利用组氨酸作为缓冲剂。备选地，在另一实施方案中，按WO2008/084237中所公开进一步稳定本发明的组合物，WO2008/084237描述了包含蛋白质和一种或多种添加剂的组合物，其特征在于该***基本上不含常规缓冲剂，即在保存组合物的预期温度范围内具有组合物的pH的1个单位之内的pKa的化合物。在此实施方案中，将组合物的pH设在这样的值，组合物在该pH值下具有就pH而言的最大可测量稳定性；一种或多种添加剂(替换缓冲液)能够与蛋白质交换质子，且在保存组合物的预期温度范围内具有比组合物的pH高或低至少1个单位的pKa值。通过保持蛋白质处于适宜的pH，处于或接近可测量稳定性最大的值，在缺乏常规缓冲剂的情况下，可以实质性提高蛋白质的保存稳定性。在某些实施方案中，通过使用在组合物的预期保存温度范围内具有水性组合物pH的1至5个pH单位之间、优选1至3个pH单位之间、最优选1.5至2.5个pH单位之间的pKa的添加剂，通常可以可能实质性地进一步增强保存稳定性。

本发明的溶液可以进一步包括一种或多种常规赋形剂，如无机盐，优选钠、钾、钙或铵与氯、硫酸、碳酸、亚硫酸、硝酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、马来酸或乳酸组合的盐；氨基酸，优选组氨酸、甘氨酸、精氨酸或甲硫氨酸(例如作为抗氧化剂)；糖或糖醇，优选海藻糖、蔗糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、乳糖醇、甘油或1,2-丙二醇；表面活性剂，优选聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯80、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407；痕量金属螯合剂，优选ETDA；防腐剂，优选苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或苯索氯铵。镁与氯、硫酸、碳酸、亚硫酸、硝酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、马来酸或乳酸组合的无机盐也是适宜的赋形剂。

本发明的溶液可选地包含渗涨度调节剂。适宜的渗涨度调节剂在上文背景技术中列出，且可以是带电荷或不带电荷的化学种类。典型的不带电荷的渗涨度调节剂包括糖类，如蔗糖、海藻糖、甘油和甘露醇。典型的带电荷的渗涨度调节剂包括带电荷的化学种类，如精氨酸或氯化钠。

在一个实施方案中，用诸如无机盐或有机盐的带电荷种类调节抗体蛋白质的水溶液的渗涨度。在一个实施方案中，用诸如糖类或糖醇的不带电荷种类调节抗体蛋白质的水溶液的渗涨度。

本发明的水性组合物涵盖广范围的摩尔渗透压浓度，包括低渗、等渗和高渗的组合物。优选地，本发明的溶液基本上等渗。优选的溶液具有约200至约500mOsm/L范围内的摩尔渗透压浓度。优选地，摩尔渗透压浓度在约250至约350mOsm/L的范围内。更优选地，摩尔渗透压浓度为约300mOsm/L。在一个实施方案中，溶液预期用于通过肌内或皮下注射来对受试者施用，且选择溶液的摩尔渗透压浓度来最小化注射时的疼痛。

本文所用的术语“高分子量种类”指蛋白质含量的任意成分，其具有至少两倍于亲本活性蛋白质的分子量的表观分子量。也就是说，高分子量种类是亲本蛋白质的多聚聚集体。多聚聚集体可以包含具有显著改变的构象的亲本蛋白质分子，或者它们可以是处于天然构象或近天然构象的亲本蛋白质单位的组装。高分子量种类的测定可以用本领域已知的方法进行，包括大小排阻层析、电泳、分析型超速离心/沉降速度、光散射、动态光散射、静态光散射和场流分级分离。

优选地，在40℃保存至少一个月、两个月或三个月后，本发明的组合物包含不超过5％(按总蛋白质重量计)高分子量种类。在一个实施方案中，在40℃保存至少一个月、两个月或三个月后，高分子量种类的量增加不超过5％(按总蛋白质重量计)，优选不超过3％。高分子量种类的定量按组合物中总蛋白质的重量的百分比计。

在优选实施方案中，在相同条件下保存相同时长后，本发明的组合物应显示保存期间高分子量种类的增加比缺乏乙烯亚胺寡聚物但其他方面相同的组合物低至少10％，优选低至少25％，更优选低至少50％。

在一个实施方案中，本发明的组合物是适合用于对有需要的受试者施用治疗性抗体蛋白质的药物组合物。这类组合物可以在用于对受试者施用治疗性蛋白质的方法中使用。

在另一实施方案中，本发明提供用于对有需要的受试者施用治疗性抗体蛋白质的方法。该方法包括施用水溶液的步骤，该水溶液包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质及寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物。优选地，通过静脉内、皮下或肌内注射施用该组合物。更优选地，通过皮下注射施用该组合物。

在优选实施方案中，蛋白质浓度足够高，使得每次施用的总体积不超过约2mL。优选地，每次施用的总体积不超过约1.5mL或约1.0mL。在一个实施方案中，每次施用的溶液体积从约0.5至约2mL，优选从约0.5至约1.5mL。

在另一实施方案中，本发明提供适合用于对有需要的受试者施用的包装的药物组合物。该药物组合物包含水溶液，该水溶液包含浓度为至少约10mg/mL的治疗性抗体蛋白质及寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物。

优选地，溶液的体积为约2mL或更少。在一个实施方案中，溶液的体积提供约0.5至约2mL的施用体积，具有足够的过剩来适应经注射器摄取溶液的限制。在一个实施方案中，该过剩为施用体积的约10％至约20％。药物组合物优选包装在适于***针头来吸出溶液的小瓶中。在一个实施方案中，该药物组合物包装在具有胶塞的玻璃瓶中。包装的药物组合物可以作为试剂盒提供，该试剂盒进一步包含使用说明和可选的适合用于肌内或皮下施用的注射器。备选地，包装的药物组合物可以以适合用于肌内或皮下施用的预装一次性注射器的形式提供。预装自动注射装置也将适合用于肌内或皮下施用。

本文所用的乙烯亚胺寡聚物的百分比指基于乙烯亚胺寡聚物的游离碱的重量(即排除任意抗衡离子的重量)。

在另一方面，本发明提供式V的化合物：

X-Y₁-[CH₂CH₂NH]_n-R

式V

其中，n＝2-6；X选自聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)、聚丙二醇(PPG-O-)和聚氨基酸；Y₁选自-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，K代表NH；R是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

在式(V)的一个实施方案中，n为3-5。

在式(V)的一个实施方案中，X具有500Da至5000Da的MW，且是聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)或聚丙二醇(PPG-O-)，适宜地，X具有约2000Da或约5000Da的MW，且是mPEG-O-。

在式(V)的一个实施方案中，Y₁是-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-，适宜地，是(C₂-C₄)烷基-C(O)-NH-。

在式(V)的一个实施方案中，Y₁是(CH₂)_mK，其中m＝3-10，例如m＝3或4，且K代表NH。

在式(V)的一个实施方案中，R是H。在式(V)的一个实施方案中，R是-(C₂-C₄烷基)-OH。

在式(V)的一个实施方案中，n＝2-6，X具有500Da至5000Da的MW，且是聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)或聚丙二醇(PPG-O-)；Y₁选自-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，K代表NH；R是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

在式(V)的一个实施方案中，n＝2-6，X是聚乙二醇(例如PEG-O-和/或mPEG-O-)；Y₁选自-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-4，K代表NH；R是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

在式(V)的一个实施方案中，n＝2-6，X是mPEG-O-；Y₁选自-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-4，K代表NH；R是H或-(C₂-C₆烷基)-OH。

在式(V)的一个实施方案中，n＝2-6，X是聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)；Y₁选自-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-4，K代表NH；R是H或-(C₂-C₆烷基)-OH；其中在Y₁是(CH₂)_mK时，R是-(C₂-C₆烷基)-OH。

式(V)的示例性化合物包括mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺(例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG戊酸酰氨基四亚乙基五胺(例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG戊酸酰氨基三亚乙基四胺(例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇(例如，其中mPEG是2K或5KmPEG)和mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇(例如，其中mPEG是2K或5KmPEG)。

可以用实施例中所述的方法和与之类似的方法连同技术人员已知的方法来制备式(V)的化合物。

例如，其中Y₁是-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-的式(V)的化合物可以如下制备，其中LG代表离去基团，如O-琥珀酰亚胺(见例如化合物(I)的合成)：

方案1

其中Y₁是K为NH的(CH₂)_mK的式(V)的化合物可以经还原性胺化如下制备：

方案2

方案3

方案3是方案1的备选方案，但是，此颠倒顺序的步骤同样地适用于方案2，其中在乙烯亚胺寡聚物和含有聚乙二醇的基团X已偶联后加入封端基团R。

在R是-(C₂-C₆烷基)-OH时，如果在偶联之前保护R的羟基，则可能需要额外的步骤。例如，如果用-SiMe₂ ^tBu基团(叔丁基二甲基甲硅烷基)保护基团R，则一旦偶联至乙烯亚胺寡聚物，就必须在额外的脱保护步骤中去除-SiMe₂ ^tBu基团如下：

方案4

适合用于去除诸如叔丁基二甲基甲硅烷基的硅保护基团的试剂包括氟化试剂，例如氟化四丁基铵(TBAF)(见例如化合物(2)合成的步骤3)。

以上式(V)的化合物用于本发明的溶液、组合物和方法。

本发明的其他方面包括：

A.水溶液，其包含：

(a)浓度为至少约10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL、或约25mg/mL至约400mg/mL的范围(例如多达约350mg/mL、300mg/mL、250mg/mL、200mg/mL或175mg/mL)的抗体蛋白质；和

(a)本文所述的式I、式II、式III、式IV或式V的乙烯亚胺寡聚物，其中寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12的范围内(或在式V的定义的范围内)，且其中乙烯亚胺的浓度为约0.01至约10mg/mL(例如从约0.01至约0.1mg/mL、约0.1至约0.25mg/mL、约0.25至约1mg/mL、约1至约2mg/mL、约2至约5mg/mL或约5至约10mg/mL)；

和

其中水溶液的pH在4至8(例如5.0至7.5或5.5至7.0)的范围内，且溶液具有约200至约500mOsm/L的范围内的摩尔渗透压浓度。

B.方面A的水溶液，其中溶液包含提供足以允许溶解蛋白质至希望的浓度且足够低以允许乙烯亚胺寡聚物中的部分碱性基团质子化的pH的缓冲剂。

C.方面A或B的水溶液，其中用可选地封端的化学惰性聚合物衍生化乙烯亚胺寡聚物。

D.方面A、B或C的水溶液，其中抗体蛋白质的浓度足够高，使得每次施用的总体积不超过约2mL。

E.方面A、B、C或D的水溶液，其中水溶液进一步包含一种或多种常规赋形剂。

实施例

材料

乙二胺(Mw 60Da)、二亚乙基三胺(Mw 103Da)、三亚乙基四胺(Mw146Da)、四亚乙基五胺(Mw 189Da)、五亚乙基六胺(Mw 232Da)和PEI800(聚乙烯亚胺，乙二胺支化的，LS测定的平均Mw～800，GPC测定的平均Mn～600)获自Sigma-Aldrich。5K mPEG醇(Mw 5000Da)获自Dr Reddy’sCPS。2K mPEG琥珀酰亚胺戊酸酯获自Layson Bio。5K mPEG丙醛获自Dr Reddy’s CPS。

缩写词

CPE 致细胞病变作用

DMEM Dulbecco极限必需培养基

FBS 胎牛血清

HEK 人胚肾

MDCK Madin-Darby犬肾上皮

MTBE 甲基叔丁醚

mPEG 用甲氧基封端的聚乙二醇聚合物

PEG 聚乙二醇

PEI 聚乙烯亚胺

PPG 聚丙二醇

THF 四氢呋喃

所选择的乙烯亚胺寡聚物衍生物的合成

合成了以下衍生的乙烯亚胺寡聚物：

化合物(1)mPEG-O(CH₂)₄CONH-(CH₂CH₂NH)₅H(＝2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺)(约Mw 2331)

将2K mPEG琥珀酰亚胺戊酸酯(1.5g，0.75mmol)溶解在乙腈(45ml)中。五亚乙基六胺(0.26g，1.12mmol)也溶解在乙腈(5ml)中，并在几分钟内逐滴加至溶解的mPEG试剂。然后在室温下过夜搅拌反应混合物，然后产生不透明悬液。将反应混合物滤过然后通过加入甲基叔丁醚(MTBE)(300ml)来从乙腈沉淀mPEG成分。在冰/水浴中冷却悬液，然后滤过纸，用额外的甲基叔丁醚(50ml)洗涤。在降低的压力下室温干燥湿产物几个小时，以产生作为白色固体的标题寡聚物(1.24g；83％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)；3.41-3.84(m，PEG和m，OCH₂CH₂CH₂CH₂CONH)，3.38(s，OCH₃)，2.37-3.36(m，多个CH₂)，2.21(m，CH₂CONH)，1.56-1.72(m，OCH₂CH₂CH₂CH₂CONH)。

化合物(2)mPEG-O(CH₂)₃-(NHCH₂CH₂)₃NHCH₂CH₂OH(＝5K mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇)(约Mw 5247)

步骤1：单保护的二胺

将三亚乙基四胺(1.15g，7.9mmol)和(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)乙醛(0.7g，3.9mmol，0.5当量)组合在甲醇(50ml)中，并在室温下搅拌1小时。然后加入硼氢化钠(89mg，2.4mmol，0.3当量)，这产生轻微泡腾。搅拌反应混合物15分钟，然后在降低的压力下去除甲醇溶剂。将得到的不透明液体溶解在二氯甲烷(50ml)中，并用水(10ml)和盐水(10ml)洗涤。所产生的层不透明，但快速分开。将二氯甲烷层分开，并用硫酸钠干燥，去除干燥剂，在降低的压力下去除溶剂。这产生作为不透明液体的单保护的二胺

将5K mPEG丙醛(5.0g，1mmol)和步骤1的单保护二胺(1.52g，5mmol，5当量)溶解在甲醇(60ml)中，并在室温下搅拌1小时。加入硼氢化钠(0.11g，3mmol，3当量)，并搅拌反应混合物15分钟。然后在降低的压力下去除甲醇溶剂，以产生湿的白色固体。将湿的白色固体溶解在二氯甲烷(30ml)中，并用MTBE(300ml)沉淀产物，以产生作为白色固体的甲硅烷基保护的产物5.3g(100％)。

步骤3：脱保护为mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇

通过在温水浴(～40℃)中温和加温来将步骤2的甲硅烷基保护的前体(4.8g，0.96mmol)溶解在四氢呋喃(THF)(50ml)中。然后加入氟化四丁基铵(1.5ml，THF中的1M溶液，1.5当量)，并在室温下过夜搅拌反应混合物。向反应混合物加入MTBE(125ml)，并通过过滤来收集沉淀。将湿滤饼溶解在二氯甲烷(10ml)中，并通过加入丙-2-醇(250ml)来沉淀。然后重复从二氯甲烷和丙-2-醇沉淀，分离白色固体，在30℃干燥3小时，以产生作为稠密白色固体的标题产物2.2g(45％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)；3.43-3.84(m，PEG，CH₂OH和PEGOCH₂)，3.38(s，OCH₃)，2.45-2.85(m，多个CH₂N)，1.72-1.82(2H，m，PEGCH₂CH₂CH₂NH)。

化合物(3)mPEG-O(CH₂)₃-(NHCH₂CH₂)₅NHCH₂CH₂OH(＝5K mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇)(约Mw 5333Da)

步骤1：单保护的二胺

将五亚乙基六胺(5.3g，23.0mmol)和(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)乙醛(2.0g，11.5mmol，0.5当量)合并在甲醇(100ml)中，并在室温下搅拌1小时。然后加入硼氢化钠(260mg，6.9mmol，0.3当量)，这产生轻微泡腾。搅拌反应混合物15分钟，然后在降低的压力下去除甲醇溶剂。将得到的不透明液体溶解在二氯甲烷(75ml)中，并用水(10ml)和盐水(10ml)洗涤两次。所产生的层不透明，但快速分开。分开二氯甲烷层后，用硫酸钠干燥，去除干燥剂，在降低的压力下去除溶剂。这产生作为不透明浅黄色液体的单保护的二胺3.0g(33％来自二胺)。

步骤2：与5K mPEG-丙醛反应

的压力下去除甲醇溶剂，以产生湿的白色固体。将湿的白色固体溶解在二氯甲烷(30ml)中，并用MTBE(300ml)沉淀产物，以产生作为白色固体的甲硅烷基保护的产物5.2g(100％)。

步骤3：脱保护为mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇

通过在温水浴(～40℃)中温和加温来将步骤2的甲硅烷基保护的前体(4.8g，0.96mmol)溶解在THF(50ml)中。然后加入氟化四丁基铵(1.5ml，氯甲烷(10ml)中，并通过加入丙-2-醇(250ml)来沉淀。然后重复自二氯甲烷和丙-2-醇的沉淀，分离白色固体，在30℃干燥3小时，以产生作为稠密白色固体的标题产物3.1g(65％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)；3.44-3.85(m，PEG，CH₂OH和PEGOCH₂)，3.38(s，OCH₃)，2.45-2.83(m，多个CH₂N)，1.73-1.82(2H，m，PEGCH₂CH₂CH₂NH)。

合成了以下化合物作为参考物质：

化合物(4)mPEG-O(CH₂)₄CONH-(PEI800)(＝2K mPEG戊酸PEI800)(约Mw 2900Da)

将PEI800(0.48g，0.6mmol)溶解在二氯甲烷(90ml)中，以形成不透明溶液。然后将2K mPEG琥珀酰亚胺戊酸酯(1.5g，0.75mmol)作为固体在几分钟内以小部分加入，产生澄清溶液。然后在室温下过夜搅拌反应混合物，然后产生不透明悬液。通过滤过来去除额外的固体，然后在降低的压力下去除约三分之二的二氯甲烷。然后将得到的浓缩物与甲基叔丁醚MTBE(300ml)混合，并在冰/水浴中冷却，以获得产物的沉淀。通过滤过纸来收集产物的沉淀，用MTBE(50ml)洗涤，并在降低的压力下室温干燥几个小时。产生作为白色固体的标题产物(1.50g，89％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)；3.41-3.84(m，PEG和m，OCH₂CH₂CH₂CH₂CONH)，3.38(s，OCH₃)，2.43-3.36(m，多个CH₂)，2.21(m，CH₂CONH)，1.53-1.74(m，OCH₂CH₂CH₂CH₂CONH).

化合物(5)mPEG-O(CH₂)₃-NHCH₂CH₂NHCH₂CH₂OH(＝5K mPEG丙基-N-(羟乙基)乙二胺)(约Mw 5161Da)

通过在水浴中加温至约40℃来将5K mPEG丙醛(2g，0.4mmol)溶解在甲醇(20ml)中。溶解后，使mPEG溶液回至室温，并加入N-(2-羟乙基)乙二胺(0.125g，1.2mmol，3当量)。搅拌胺、醛混合物15分钟，然后加白色固体的标题化合物(1.86g，93％)。¹H NMR(CDCl₃，400 MHz)；3.43-3.84(m，PEG，CH₂OH和PEGOCH₂)，3.38(s，OCH₃)，2.52-2.80(m，多个CH₂N)，1.72-1.82(m，PEGCH₂CH₂CH₂NH)。

制剂制备和稳定性测试

在缺乏或存在多种乙烯亚胺寡聚物的情况下制备蛋白质治疗剂利妥昔单抗和赛妥珠单抗的制剂。用以下产品作为起始物质：(利妥昔单抗)和(赛妥珠单抗)。两种产品的组成如下：

利妥昔单抗(10mg/ml)

二水合柠檬酸钠(7.35mg/ml)

聚山梨酸酯80(0.7mg/ml)

氯化钠(9.0mg/ml)

pH约为6.5

来源：关于的EMA科学讨论(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scient ific_Discussion/human/000165/WC500025817.pdf)

赛妥珠单抗(200mg/ml)

乙酸钠(1.36mg/ml)

氯化钠(7.31mg/ml)

pH约为4.7

来源：RxList(http://www.rxlist.com/script/main/hp.asp)

为了制备用于测试的制剂，有必要去除原赋形剂，并用所选择的赋形剂取代它们。用以下方法来制备用于测试的制剂：将原组合物从制造商的容器取出，并在2-8℃在3.5kDa截留的透析盒(Thermo Pierce)中透析，透析液更换三次，每次最少4小时，包括一次过夜孵育。然后(对利妥昔单抗)用MWCO 50kDa的Amicon离心浓缩器或(对赛妥珠单抗)用MWCO 30kDa的Amicon离心浓缩器将蛋白质浓缩至133.3mg/ml(利妥昔单抗，实施例1-4)、187mg/ml(利妥昔单抗，实施例5)或150mg/ml(赛妥珠单抗，实施例6)。

将含有新赋形剂并调节至所需pH的背景溶液加至经透析的蛋白质，以在最终组合物中达到所需的赋形剂和蛋白质浓度。将配制的样品放置在40℃或5℃保存，并在给定的时期后测试稳定性。在含有乙烯亚胺寡聚物的组合物中测试蛋白质的稳定性，并与具有相同背景但缺乏寡聚物的“对照制剂”比较。为允许进一步比较，配制各实施例中所述的(例如，在实施例1中，原制剂包含100mg/ml的利妥昔单抗)“原制剂”，该“原制剂”具有与原产品(即在利妥昔单抗的情况下为在赛妥珠单抗的情况下为)相同的赋形剂组成但具有特定的蛋白质浓度。

评估聚集的方法

水性蛋白质组合物中的聚集可以通过以下评估：

(a)目测评估

将小瓶放入具有适宜地选择的反差背景的适宜位置，并处于充足和适当的照明之下，以突出任意潜在的或检测到的目测偏差。并排放置对照(或现制备的物质)进行直接比较。如果不存在目测缺陷，则将溶液分类为澄清；如果物质的透明度存在显著改变，则分类为浑浊；如果存在不溶性级分，或如果小瓶底部可见颗粒，则认为已形成沉淀。

(b)大小排阻层析(SEC)

用具有保护柱的300×7.8mm S3000(或等同的)大小排阻柱测量高分子量种类的量。流动相为磷酸钾pH6.5，流速0.4ml/分钟，注射体积1μl，在210和280mm检测。结果表示为％高分子量种类(HMWS)，即对应于聚集的蛋白质的所有峰面积的总和对层析图上所有蛋白质相关峰的总和。例如由于反复使用大小排阻柱，就％HMWS的绝对值而言，可以观察到小的时间点对时间点变异性。但是，在给定的时间点内，用处于相同条件的柱测试样品，所以在该时间点内产生的值是所测试的组合物中蛋白质的相对稳定性的非常好的指示。

实施例1：利妥昔单抗－显示四亚乙基五胺和五亚乙基六胺存在下的聚集控制

将利妥昔单抗按100mg/ml配制在以下背景溶液中：EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)、组氨酸(10mM)。将pH调节至6.5。乙烯亚胺寡聚物(i)四亚乙基五胺五盐酸(n＝4)和(ii)五亚乙基六胺(n＝5)对40℃和5℃海藻糖存在下的聚集增加的影响分别显示在表1和2中。在所有背景溶液中，发现乙烯亚胺寡聚物(i)和(ii)显著降低HMWS的形成率。此外，在40℃，在不含乙烯亚胺寡聚物的对照制剂中，8周后观察到了沉淀。

表1.利妥昔单抗制剂在40℃的聚集率

*且EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)和组氨酸(10mM)

**作为五盐酸盐(列中的浓度基于碱的重量)

表2.利妥昔单抗制剂在5℃的聚集率

*且EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)和组氨酸(10mM)

**作为五盐酸盐(列中的浓度基于碱的重量)

实施例2：利妥昔单抗－进一步研究多种寡聚物和聚合物添加剂存在下的聚集控制

将利妥昔单抗按100mg/ml配制在以下背景溶液中：EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)、组氨酸(10mM)。将pH调节至6.5。

可以测试以下单体、寡聚物和聚合物添加剂：

(a)2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺[化合物(1)]

(b)2K mPEG戊酸PEI800[化合物(4)]；对照

(c)乙二胺；对照

(d)二亚乙基三胺

(e)三亚乙基四胺

(f)四亚乙基五胺

(g)五亚乙基六胺

表3

实施例3：利妥昔单抗－显示含精氨酸的备选背景溶液中四亚乙基五胺和五亚乙基六胺存在下的聚集控制

在作为渗涨度调节剂的精氨酸(80mM)存在下，将利妥昔单抗按100mg/ml配制在以下背景溶液中：EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)、组氨酸(10mM)。将所有制剂的pH调节至6.5。为了比较，还包括了市售液体利妥昔单抗产品的制剂(“原制剂”也含100mg/ml利妥昔单抗)。乙烯亚胺寡聚物(i)四亚乙基五胺五盐酸(n＝4)和(ii)五亚乙基六胺(n＝5)对40℃的聚集增加的影响显示在表4中。在所有背景溶液中，与不含乙烯亚胺寡聚物的背景溶液相比，发现乙烯亚胺寡聚物(i)和(ii)的存在显著降低HMWS的形成率。此外，发现乙烯亚胺寡聚物存在下40℃HMWS的形成率低于原制剂中的形成率，其在8周后也显示沉淀的迹象。

表4.利妥昔单抗制剂在40℃的聚集率

实施例4：利妥昔单抗－显示多种乙烯亚胺寡聚物的聚集控制

将利妥昔单抗按100mg/ml配制在以下背景溶液中：EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)、组氨酸(10mM)和海藻糖(200mM)。将pH调节至6.5。以下添加剂对40℃的聚集增加的影响显示在表5中。

(a)2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺[化合物(1)]

(b)乙二胺(参考)

(c)二亚乙基三胺

(d)三亚乙基四胺

(e)五亚乙基六胺

(f)2K mPEG戊酸PEI800[化合物(4)]

结果表示为通过SEC测量的％高分子种类(HMWS)。进行了以下观察：在所有背景溶液中，与不含乙烯亚胺寡聚物的背景制剂相比，发现乙烯亚胺寡聚物(c)、(d)和(e)的存在以剂量依赖性方式显著降低HMWS的形成率；PEG化乙烯亚胺寡聚物(a)的使用也达到了稳定化作用，并基于摩尔显示与(c)、(d)和(e)一样有效；在与市售液体利妥昔单抗产品的制剂(“原制剂”)相比时，乙烯亚胺寡聚物(a)、(c)、(d)和(e)存在下的聚集率在所有情况下都更低；另一种包含乙二胺(b)的比较制剂在减少HMWS形成上的效果较差；另一种包含2K mPEG戊酸PEI800(f)的比较制剂以剂量依赖性方式降低HMWS的形成率，但可以预期添加剂(f)具有比添加剂(a)、(c)、(d)和(e)较为不利的毒性谱。

表5.40℃16周后利妥昔单抗制剂的聚集率

实施例5：利妥昔单抗－显示PEG化和非PEG化乙烯亚胺寡聚物二者对更高浓度下的聚集控制

将利妥昔单抗按140mg/ml配制在以下背景溶液中：EDTA(0.2mM)、甲硫氨酸(1mM)、组氨酸(10mM)和海藻糖(200mM)。将pH调节至6.5。研究了以下添加剂对聚集率的影响：

(a)5K mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇[化合物(2)]

(b)5K mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇[化合物(3)]

(c)5k mPEG醇

(d)二亚乙基三胺

(e)三亚乙基四胺

(f)五亚乙基六胺

加入添加剂(c)，以允许更好地理解所选择的乙烯亚胺寡聚物的PEG化的作用。

乙烯亚胺寡聚物对利妥昔单抗在40℃的聚集率的影响显示在表6中。结果表示为通过SEC测量的％高分子种类(HMWS)。相同的结果也显示在图1A-1F中。在5K mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇(a)和5K mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇(b)的存在下观察到了聚集率的降低(图1A和1B)。该作用是剂量依赖性的，且在5K mPEG五亚乙基六胺(b)的情况下，仅在5mg/ml观察到该作用。相反，5k mPEG醇(c)单独对聚集率仅具有边际效应(图1C)。非PEG化乙烯亚胺寡聚物(d)、(e)和(f)显示利妥昔单抗聚集率的相当大的剂量依赖性降低(图1D-1F)。

表6.PEG化和非PEG化乙烯亚胺寡聚物和5k mPEG醇对利妥昔单抗制剂在40℃的聚集率的影响

实施例6：赛妥珠单抗－显示PEG化和非PEG化乙烯亚胺寡聚物存在下的聚集控制

在作为渗涨度调节剂的NaCl(150mM)或1,2-丙二醇(200mM)的存在下按100mg/ml将赛妥珠单抗配制在组氨酸缓冲液(10mM，pH 6.0)中。乙烯亚胺寡聚物(b)-(e)对40℃的聚集率的影响显示在表7(150mM NaCl渗涨度调节剂)和表8(200mM 1,2-丙二醇渗涨度调节剂)中。

测试了以下添加剂：

(a)5k mPEG醇

(b)五亚乙基六胺

(c)2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺[化合物(1)]

(d)三亚乙基四胺

(e)5K mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇[化合物(2)]

结果表示为通过SEC测量的％高分子种类(HMWS)。发现PEG化和非PEG化的乙烯亚胺寡聚物(b)-(e)都降低HMWS的形成率，尤其是寡聚物(b)、(c)和(d)。除(e)外，在含有1,2-丙二醇的组合物中(表8)，此作用随剂量增加。还已显示，与赛妥珠单抗的市售液体产品的制剂(“原制剂”)相比，HMWS形成率在乙烯亚胺寡聚物的存在下显著更低。此外，另一含有mPEG醇(a)的比较制剂显示在降低HMWS形成率上无效。

表7.含NaCl的组合物中赛妥珠单抗制剂在40℃的聚集率

表8.含1,2-丙二醇的组合物中赛妥珠单抗制剂在40℃的聚集率

评估细胞毒性的方法

实施例7：确定PEI的大小对HEK293和Vero细胞的细胞毒性作用的影响

传代细胞系人胚肾(HEK)293(获自University of Birmingham)和Vero(获自ECACC(The European Collection of Cell Cultures))，并用来在Dulbecco极限必需培养基(DMEM)+2％胎牛血清(FBS)+4mM L-谷氨酰胺中按1x10⁴个细胞/cm²的浓度建立96孔板。37℃孵育细胞24小时至汇合。24小时后，将分子量在约800Da和约50,000Da之间的多种PEI配制为5mg/mL的贮存液浓度，并将其pH调节至7：(分子量600、1800、10,000和50-100,000)。然后将贮存液在DMEM+2％FBS+4mM L-谷氨酰胺中稀释至以下浓度：2.5mg/mL、1.25mg/mL、600ug/mL、300ug/mL、150ug/mL、75ug/mL、25ug/mL、10ug/mL和5ug/mL。稀释步骤后，将所有浓度(包括贮存液浓度)的100μL加至8孔/平板，产生8个重复/浓度。37℃孵育平板72小时，然后针对致细胞病变作用(CPE)进行筛选，如图2中所示。如上文所讨论，图2清楚地表明，随着PEI的大小减小，其细胞毒性作用也减小。

本发明的乙烯亚胺寡聚物的细胞毒性作用可以通过基本相同的方法来测试。

实施例8：用Vero和MDCK细胞确定乙烯亚胺寡聚物的大小对细胞毒性作用的影响

Vero细胞和Madin-Darby犬肾上皮(MDCK)细胞获自ECACC(TheEuropean Collection of Cell Cultures,Health Protection Agency,PortonDown,Salisbury,SP40JG)。传代细胞，并用来在Dulbecco极限必需培养基(DMEM)+2％胎牛血清(FBS)+4mM L-谷氨酰胺中按1x10⁴个细胞/cm²的浓度建立96孔板。24小时后，将多种乙烯亚胺寡聚物和聚合物(即PEI)配制为5mg/mL的贮存液浓度，并调节其pH至7。测试了以下分子量的寡聚物和聚合物：102、145、188、231、800、1800、10,000和50-100,000Da。然后将贮存液在DMEM+2％FBS+4mM L-谷氨酰胺中稀释至以下浓度：2.5mg/mL、1.25mg/mL、600μg/mL、300μg/mL、150μg/mL、75μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL。稀释步骤后，将各浓度的各样品的100μL加至平板上的8个孔，产生8个重复/浓度。37℃孵育平板72小时，然后针对细胞抑制和致细胞病变作用(CPE)进行筛选。图3显示了乙烯亚胺寡聚物或聚合物的大小与在Vero细胞中的细胞毒性作用直接相关；如通过细胞毒性作用所需的乙烯亚胺寡聚物或聚合物的浓度所测定，大小越小，细胞毒性作用越小。在所测试的最小的三种寡聚物之间不可获得区分，因为它们中没有一种在所测试的最高浓度下显示致细胞病变作用。用MDCK细胞观察到了乙烯亚胺寡聚物或聚合物的大小对细胞毒性作用的类似作用(图4)，但这种情况下的作用渐进性较差，寡聚物的细胞毒性在189Da以下急剧降低。

实施例9：用Vero细胞确定五亚乙基六胺的PEG化对细胞毒性作用的影响

按实施例7中获得和培养Vero细胞。37℃孵育细胞24小时至汇合。24小时后，将五亚乙基六胺(232Da)配制为5mg/mL的贮存液浓度，并调节pH至7。然后将贮存液在DMEM+2％FBS+4mM L-谷氨酰胺中稀释至以下浓度：2.5mg/mL、1.25mg/mL、600μg/mL、300μg/mL、150μg/mL、75μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL。用相同的缓冲液条件和pH将2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺(化合物(1))从100mg/ml的贮存液配制为以下浓度：50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6mg/ml、3mg/ml、1.5mg/ml、750μg/ml、250μg/ml、125μg/ml和60μg/ml。稀释步骤后，将所有浓度(包括贮存液浓度)的100μL加至8个孔/平板，产生8个重复/浓度。37℃孵育平板72小时，然后针对Vero细胞抑制进行筛选。将五亚乙基六胺(232Da)的细胞毒性作用与2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺(化合物(1))的细胞毒性作用相比较。显示引起细胞毒性作用所需的2KmPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺(化合物(1))的浓度比非PEG化的五亚乙基六胺的浓度高约10倍(图5)。此观察结果可能可以通过2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺的五亚乙基六胺部分约为10wt％的事实来解释。

在本说明书和随后的权利要求通篇中，除非文中要求，词语“包含”及其变形将理解为暗示包括所述整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任意其他整数、步骤、整数组或步骤组。

虽然已参考其优选实施方案具体地显示和描述了本发明，但本领域技术人员应理解，可以在其中进行形式和细节的多种改变而不背离所附权利要求所涵盖的本发明的范围。还应理解，本文所述的实施方案并非相互排斥，来自多种实施方案的特征可以按照本发明全部或部分组合。

在按照马库什组或其他备选分组描述本发明的方面或实施方案时，本发明不仅作为整体涵盖所列出的整个组，还单独地涵盖组的每个成员和主组的所有可能的亚组，以及缺乏一个或多个组成员的主组。本发明还设想在所要求保护的发明中明确排除任意组成员中的一个或多个。

本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”旨在包括A和B二者；A或B；A(单独)；及B(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；及C(单独)。

美国申请号61/592,323的公开内容在此以其整体引入作为参考。此外，引用的所有出版物、专利、专利申请、因特网站点和检索号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)在此为了所有目的以相同的程度以其整体引入作为参考，就如同明确和单独地说明这样引入每一单个出版物、专利、专利申请、因特网站点或检索号/数据库序列作为参考一样。

Claims

1.水溶液，其包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质和乙烯亚胺寡聚物，其中寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12范围内。

2.降低水溶液中的抗体蛋白质的聚集率的方法，其中抗体蛋白质浓度为至少约10mg/mL，其包括向所述溶液中加入乙烯亚胺寡聚物的步骤，其中寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在n＝2-12的范围内。

3.权利要求1的水溶液或权利要求2的方法，其中n＝3-11。

4.权利要求3的水溶液或方法，其中n＝6-8。

5.权利要求4的水溶液或方法，其中n＝2-6，例如3-5。

6.权利要求1至5中任一项的水溶液或方法，其中用选自聚乙二醇(例如PEG和mPEG)、聚丙二醇(PPG)和聚氨基酸的一种或多种聚合物衍生化所述乙烯亚胺寡聚物。

7.权利要求1至6中任一项的水溶液或方法，其中用一种或多种共聚物衍生化所述乙烯亚胺寡聚物，其中所述共聚物由选自聚乙二醇(例如PEG和mPEG)、聚丙二醇(PPG)和聚氨基酸的聚合物(及其相关单体)组成。

8.权利要求1至5中任一项的水溶液或方法，其中用一种或多种PEG或mPEG衍生化所述乙烯亚胺寡聚物。

9.权利要求6至8中任一项的水溶液或方法，其中经可选的桥连基衍生化所述乙烯亚胺寡聚物，其中桥连基选自羰基、酰胺、氨基甲酸酯、脲和亚烷基。

10.权利要求1的水溶液或权利要求2的方法，其中乙烯亚胺寡聚物选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺。

11.权利要求1至10中任一项的水溶液或方法，其中用选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₁-C₆烷基)-O-(C₂-C₆烷基)的惰性封端基团封端乙烯亚胺寡聚物。

12.权利要求1或权利要求2的水溶液或方法，其中乙烯亚胺寡聚物为式III：

X-Y₁-[CH₂CH₂NH]_n-R

式III

其中，n＝2-12；X选自聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)、聚丙二醇(PPG-O-)和聚氨基酸；Y₁是可选的，且选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，且K代表O或NH；且R是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

13.权利要求1至7或9至12中任一项的水溶液或方法，其中聚氨基酸选自聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸和聚苯丙氨酸。

14.权利要求12的水溶液或方法，其中n＝2-12，X是PEG-O-或mPEG-O-；Y₁缺乏，且R是-H或-CH₂CH₂OH。

15.权利要求12的水溶液或方法，其中n＝2-12；X是mPEG-O-；Y存在，且选自–(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-OC(O)-NH-、-(C₂-C₆)烷基-NHC(O)NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，且K代表O或NH；R是H。

16.权利要求15的水溶液或方法，其中n＝4-8；X是mPEG-O-；Y是-(C₀-C₆)烷基-C(O)-NH-，且R是-H。

17.权利要求12至16中任一项的水溶液或方法，其中K是NH。

18.权利要求1至17中任一项的水溶液或方法，其中乙烯亚胺寡聚物的碱性氮中心的至少95％质子化。

19.权利要求1至18中任一项的水溶液或方法，其中乙烯亚胺寡聚物以约0.2mg/mL至约5mg/mL的浓度存在。

20.权利要求1至19中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是治疗剂。

21.权利要求1至20中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是抗体、抗体片段、与活性部分缀合的抗体、包含一个或多个抗体片段的融合蛋白质、或前述任一种的衍生物。

22.权利要求21的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是单克隆抗体。

23.权利要求22的水溶液或方法，其中单克隆抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

24.权利要求22的水溶液或方法，其中单克隆抗体是曲妥珠单抗或利妥昔单抗。

25.权利要求22的水溶液或方法，其中单克隆抗体是英夫利昔单抗。

26.权利要求21的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是包含与一个或多个免疫球蛋白Fc片段融合的活性蛋白质结构域的融合蛋白质。

27.权利要求26的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是依那西普、阿巴西普或贝拉西普。

28.权利要求21的水溶液或方法，其中衍生物是包含一种或多种抗体或抗体片段和化学惰性聚合物的缀合衍生物。

29.权利要求28的水溶液或方法，其中缀合衍生物是赛妥珠单抗。

30.权利要求1至29中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质浓度在约25mg/mL和约300mg/mL之间。

31.权利要求1至30中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质浓度高于50mg/mL。

32.权利要求1至31中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质与所述乙烯亚胺寡聚物的重量比(wt/wt)为约50至约100。

33.权利要求32的水溶液或方法，其中抗体蛋白质与所述乙烯亚胺寡聚物的重量比(wt/wt)为约100至约200。

34.用于对有需要的受试者施用抗体蛋白质的方法，其包括对所述受试者施用权利要求1至33中任一项的水溶液的步骤。

35.权利要求34的方法，其中通过皮下或肌内注射或通过静脉内注射或输注施用所述溶液。

36.权利要求34或权利要求35的方法，其中所施用的溶液的总体积为约2mL或更少。

37.权利要求1至36中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pI高于溶液的pH。

38.权利要求37的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pI比溶液的pH高至少0.5个单位。

39.权利要求1至38中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pI为至少7。

40.权利要求39的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pI在7-10的范围内。

41.权利要求1至40中任一项的水溶液或方法，其中水溶液是等渗的。

42.权利要求1至41中任一项的水溶液或方法，其中水溶液包含不带电荷的渗涨度调节剂。

43.权利要求1至41中任一项的水溶液或方法，其中水溶液包含带电荷的渗涨度调节剂。

44.式V的化合物：

X-Y₁-[CH₂CH₂NH]_n-R

式V

其中，n＝2-6；X选自聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)、聚丙二醇(PPG-O-)和聚氨基酸；Y₁选自-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-和(CH₂)_mK，其中m＝3-10，且K代表NH；且R是H或选自-C₁-C₆烷基、-(C₂-C₆烷基)-OH和-(C₂-C₆烷基)-O-(C₁-C₆烷基)的惰性封端基团。

45.权利要求44的化合物，其中n为3-5。

46.权利要求44或45的化合物，其中X具有500Da至5000Da的MW，且是聚乙二醇(例如PEG-O-和mPEG-O-)或聚丙二醇(PPG-O-)。

47.权利要求44至46中任一项的化合物，其中Y₁是-(C₂-C₆)烷基-C(O)-NH-。

48.权利要求44至46中任一项的化合物，其中Y₁是(CH₂)_mK；m＝3或4，且K代表NH。

49.权利要求44至48中任一项的化合物，其中R是H。

50.权利要求44至48中任一项的化合物，其中R是-(C₂-C₄烷基)-OH。

51.权利要求44的化合物，其选自mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺、mPEG戊酸酰氨基四亚乙基五胺、mPEG戊酸酰氨基三亚乙基四胺、mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇和mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇。

52.权利要求1的水溶液，其中乙烯亚胺寡聚物是权利要求44至51中任一项的化合物。

53.适用于对有需要的受试者施用的包装的药物组合物，其包含权利要求1至33、权利要求37至43或52中任一项的水溶液。