CN104181117A - 一种检测纤维中蛋白质含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测纤维中蛋白质含量的方法。将考马斯亮蓝法应用到纤维中蛋白质含量的定量检测中。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后变成蓝色，其最大吸收波长从465nm变成595nm，蛋白质在1～1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，符合朗伯比尔定律，可用于纤维中蛋白质含量的定量测定。检测过程包括制备蛋白质标准溶液、制备考马斯亮蓝溶液、绘制标准曲线、得到线性回归方程和线性相关系数r、制备供试品溶液、对样品中蛋白质含量进行测定、结果计算与分析。

Description

一种检测纤维中蛋白质含量的方法

技术领域

本发明涉及一种检测纤维中蛋白质含量的方法，属于纺织材料检验技术领域。

背景技术

目前，纺织面料的组分越来越复杂，已经由原来的单、双组分向多组分发展。而纤维材料中的天然纤维的组成更加复杂，以棉为例，其主要组成物质是纤维素，此外还含有少量多缩戊糖、蜡质、蛋白质、脂肪、水溶性物质及灰分等伴生物。如何鉴别纤维种类及其各组分含量也是纤维检验的一项重要内容，纤维鉴别包括形态特征鉴别和理化性质鉴别。形态特征鉴别常用显微镜观察法。理化性质鉴别的方法很多，有燃烧法、溶解法、试剂着色法、熔点法、比重法、双折射法、X射线衍射法和红外吸收光谱法等。这些检测方法多是定性检测，缺乏定量检测方案。众所周知，定量检测更加有利于了解纤维中各组分的含量，有助于提高分析工作的精确度。因此，应该加强纤维检验技术领域中定量检测方案的制定。

在纤维中蛋白质含量的检验技术领域，仍然停留在定性检测阶段，即测试该面料是否含蛋白质纤维，而不是测试是否含蛋白质或蛋白质含量是多少。关于纤维中蛋白质含量的测定，目前仅有少数学者使用了凯氏定氮法，该方法与双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法是蛋白质含量测定方法中常用的四种古老的经典方法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定方法，即考马斯亮蓝法(Bradford法)，其属于分光光度法。考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后变成蓝色，其最大吸收波长从465nm变成595nm，蛋白质在1～1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，符合朗伯比尔定律，故可用于纤维中蛋白质的定量测定。

由于蛋白质含量测定的四种经典方法各有其缺点，尤其对纤维检测适用性不强，因此选用干扰少、灵敏度高、显色快、操作简便的考马斯亮蓝法更加适合纤维中蛋白质含量的检测。该方法不仅能够定量检测，也可以通过其显色反应进行定性检测，从而对纤维分析工作提供更准确的数据，对完善纺织纤维的检测技术具有十分重要的意义。关于考马斯亮蓝法在纺织纤维检验中的应用，目前尚未见有所报道。

发明内容

本发明旨在提供一种检测纤维中蛋白质含量的方法。

本发明中检测方法所采用的技术方案：

步骤1：蛋白质标准溶液的制备。

精确称取牛血清白蛋白100.00mg，用少量蒸馏水溶解定容至1000mL，即为100μg/mL蛋白质标准储备液，或用其他稀释算法得到100μg/mL蛋白质标准储备液，冰箱中4～5℃保存。

步骤2：考马斯亮蓝G-250溶液的制备。

取一定量考马斯亮蓝G-250在研钵中进一步研磨后，精密称取考马斯亮蓝G-250 100.00mg，加入95％乙醇50mL，再加入100mL 85％(W/V)磷酸，用蒸馏水稀释定容至1000mL。置于棕色瓶中备用，常温下放置一个月后不能再使用。

步骤3：标准曲线的绘制。

①分别精密吸取标准蛋白溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于6个10mL具塞试管中，方案如表1所示，各管加蒸馏水至1.0mL，再分别加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL，混匀，放置10min，使用分光光度计于波长595nm下立即测定吸光度。

表1标准曲线测定溶液配制方案

试管编号	0	1	2	3	4	5
							标准蛋白质溶液(mL)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
水(mL)	1	0.8	0.6	0.4	0.2	0.0
							考马斯亮蓝试剂(mL)	5	5	5	5	5	5

②标准曲线回归方程的建立：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线得到线性回归方程Y＝aX+b及线性相关系数r，相关系数越接近1越好。

步骤4：供试品溶液的制备。

①精密称取待测纤维样品x g于试管中，于20℃时用1.0mol/L次氯酸钠y mL将样品溶解30min，使纤维中的蛋白质纤维或其他蛋白质物质充分溶解在次氯酸钠溶液中。

②将溶解样品包含未溶解纤维一同置于离心机中进行离心，速度设定为3000r/min，时间为10min。待离心完毕后，用移液器移取z mL上清液于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混合均匀，上清液中蛋白含量较高，需根据待测样品的情况将其稀释。

步骤5：样品中蛋白质含量的测定。

①从容量瓶中或从离心后上清液中分别移取m mL的样品于另外p个试管中(p平行)，再分别加入蒸馏水n mL、考马斯亮蓝标准储备液5mL，充分混合。以空白试剂为参照，在波长595nm下测定吸光度。

②对照标准曲线及线性回归方程Y＝aX+b，根据稀释倍数，计算出待测样品的蛋白质含量。

测试完毕，对结果进行记录、分析。

发明中分光光度测试所用的比色皿应该是塑料或玻璃的，用前应保证清洗干净，禁止使用石英比色皿。

发明中考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，只需加1种试剂，非常简便。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2min即可完成，显色快速。其颜色可以在1h内保持稳定，但在5～20min之间，颜色的稳定性最好，也是测试的最佳时间。

发明中考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度比其他方法灵敏度高，抗干扰小，但检测仍有一些物质干扰此法的测定、如Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等，因此，被测纤维样品应先充分皂洗、水洗后再进行溶解测试。

发明中基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250间的快速显色反应，其生成物的吸光值与样品中蛋白质浓度成比例，建立了蛋白质的光学分析技术，发明将该项技术引入到纤维检验中，实现了纤维中蛋白质含量的快速定量检测。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步描述，这些实施例只为清楚公开本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：棉纤维中蛋白质含量的测定。

棉属于天然纤维素纤维，其主要成分为纤维素，但纤维中含有少量蛋白质等伴生物。蛋白质含量非常低，且受很多因素影响，如：品种、产地、季节、成熟度等。考察纤维中伴生物及杂质的含量也是纤维分析的一个重要内容。

按照技术方案中步骤1、2、3制备好蛋白质标准溶液、考马斯亮蓝G-250溶液，通过分光光度计测试并绘制出标准曲线，得到线性回归方程Y＝0.00645X+0.15730，线性相关系数r＝0.9992。精密称取待测纤维样品0.6g于试管中，于20℃时用1.0mol/L次氯酸钠10mL将样品溶解30min，使纤维中的蛋白质物质充分溶解在次氯酸钠溶液中。将溶解样品(包含未溶解纤维)置于离心机中进行离心，速度设定为3 000r/min，时间为10min。离心完毕后，用移液器分别移取1.0mL的样品于另外3个试管中，再分别加入蒸馏水0.0mL、考马斯亮蓝标准储备液5mL，充分混合。以空白试剂为参照，在波长595nm下测定吸光度，测得吸光度值分别为0.254、0.252、0.254，计算蛋白质含量分别为0.150％、0.147％、0.150％，平均值为0.149％。

实施例2：麻纤维中蛋白质含量的测定。

麻纤维的主要成分为纤维素，蛋白质含量非常低，以杂质形式存在。采用实施例1中的测试过程，测试麻纤维中的蛋白质含量，计算蛋白质含量平均值为0.055％。

实施例3-6：再生纤维素中蛋白质含量的测定。

再生纤维素纤维或面料中蛋白质含量应该很低或者为0，测试方法与棉麻纤维相近。采用实施例1中的测试过程，测试几种代表性再生纤维素纤维中的蛋白质含量。

表2几种再生纤维素纤维中的蛋白质含量

实施例	纤维种类	蛋白质含量
			3	Tencel纤维	0.021％
4	Modal纤维	0.035％
			5	竹纤维	0.052％
6	粘胶纤维	0.045％

实施例7：蚕丝纤维中蛋白质含量的测定。

蚕丝属于蛋白质纤维，其蛋白质含量较高，溶解液需要稀释到合适倍数，才能对样品进行测试。

按照技术方案中步骤1、2、3制备好蛋白质标准溶液、考马斯亮蓝G-250溶液，通过测试绘制出标准曲线，得到线性回归方程Y＝0.00645X+0.15730，线性相关系数r＝0.9992，不同批次测试，应该重新测试标准蛋白和绘制标准曲线。精密称取待测纤维样品0.1g于试管中，于20℃时用1.0mol/L次氯酸钠10mL将样品溶解30min，使纤维中的蛋白质物质充分溶解在次氯酸钠溶液中。将溶解样品包含未溶解纤维一同置于离心机中进行离心，速度设定为3 000r/min，时间为10min。待离心完毕后，用移液器移取2.5mL上清液于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。从容量瓶中分别移取0.6mL的样品于另外2个试管中，再分别加入蒸馏水0.4mL、考马斯亮蓝标准储备液5mL，测得吸光度值分别为0.409、0.408，计算蛋白质含量分别为79.28％、78.96％，平均值为79.12％。

实施例8：羊毛纤维中蛋白质含量的测定。

羊毛纤维与蚕丝纤维一样属于蛋白质纤维，对溶解液需要稀释多倍才能得到蛋白质的稀溶液。采用实例7中的测试过程，测试羊毛纤维中的蛋白质含量，计算蛋白质含量平均值为85.5％。

实施例9：牛奶蛋白纤维中蛋白质含量的测定。

牛奶蛋白质纤维中蛋白质含量的测定方案按照技术方案中步骤1、2、3制备好蛋白质标准溶液、考马斯亮蓝G-250溶液，通过测试绘制出标准曲线，得到线性回归方程Y＝0.00645X+0.15730，线性相关系数r＝0.9992(不同批次测试，应该重新测试标准蛋白和绘制标准曲线)。精密称取待测纤维样品0.1g于试管中，于20℃时用1.0mol/L次氯酸钠10mL将样品溶解30min，使纤维中的蛋白质物质充分溶解在次氯酸钠溶液中。将溶解样品包含未溶解纤维一同置于离心机中进行离心，速度设定为3 000r/min，时间为10min。待离心完毕后，用移液器移取5mL上清液于50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。从容量瓶中分别移取0.6mL的样品于另外2个试管中，再分别加入蒸馏水0.4mL、考马斯亮蓝标准储备液5mL，测得吸光度值分别为0.340、0.341，计算蛋白质含量分别为28.33％、28.48％，平均值为28.40％。

实施例10：大豆蛋白纤维中蛋白质含量的测定。

目前大批量生产的服用再生蛋白质纤维主要是牛奶蛋白纤维和大豆蛋白纤维。大豆蛋白纤维中蛋白质含量采用实施例9中的测试过程，测试大豆蛋白纤维中的蛋白质含量，计算蛋白质含量平均值为22.15％。

实施例11-14：合成纤维中蛋白质含量的测定。

纯的合成纤维或面料中蛋白质含量应该很低或者为0，测试方法与棉麻纤维相近。采用实施例1中的测试过程，测试几种代表性合成纤维中的蛋白质含量。

表3几种合成纤维中的蛋白质含量

实施例	纤维种类	蛋白质含量
			11	聚酯纤维	0.031％
12	锦纶纤维	0.025％
			13	腈纶纤维	0.032％
14	氨纶纤维	0.027％

实施例15-28：混纺/交织纤维或未知纤维中蛋白质含量的测定。

混纺/交织纤维或未知纤维中蛋白质含量的测定可根据情况参照实施例1、实施例7、实施例9的测试过程进行测试。

表4混纺/交织纤维或未知纤维中的蛋白质含量

实施例	纤维或面料种类	蛋白质含量
			15	50％棉/50％麻混纺	0.092％
16	55％棉/45％麻交织	0.105％
			17	40％棉/60％蚕丝混纺	42.25％
18	50％棉/50％蚕丝交织	40.51％
			19	50％棉/50％牛奶蛋白纤维混纺	14.55％
20	45％聚酯/55％羊毛混纺	45.33％
			21	25％锦纶/75％羊毛混纺	64.26％

22	50％聚酯/50％粘胶混纺	0.032％
			23	82％腈纶/18％羊毛混纺	16.74％
24	75％腈纶/20％羊毛/5％锦纶混纺	17.52％
			25	50％棉/45％锦纶/5％氨纶	0.052％
26	未知纤维1#	0.135％
			27	未知纱线2#	15.13％
28	未知面料3#	40.13％

本发明所述的实施例1～28仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种检测纤维中蛋白质含量的方法，其特征在于将考马斯亮蓝法应用到纤维中蛋白质含量的定量检测中，检测过程包括：

步骤1：蛋白质标准溶液的制备；

步骤2：考马斯亮蓝G-250溶液的制备；

步骤3：标准曲线的绘制；

步骤4：供试品溶液的制备；

步骤5：样品中蛋白质含量的测定。

2.根据权利要求1所述一种检测纤维中蛋白质含量的方法，其特征在于所述的考马斯亮蓝检测法不仅适用于检测参丝、羊毛、再生蛋白质纤维等蛋白质纤维，所有纤维均可作为检测对象。

3.根据权利要求1所述一种检测纤维中蛋白质含量的方法，其特征在于所述的供试品溶液的制备方法为：精密称取待测纤维样品x g于试管中，于20℃时用1.0mol/L次氯酸钠y mL将样品溶解30min，将溶解样品其中包含未溶解纤维一同置于离心机中进行离心，速度设定为3 000r/min，时间为10min，待离心完毕后，用移液器移取z mL上清液稀释一定倍数或不经稀释，待测。

4.根据权利要求1所述一种检测纤维中蛋白质含量的方法，其特征在于所述的样品中蛋白质含量的测定方法为：从容量瓶或从离心后上清液中分别移取m mL的样品于另外p个试管中，再分别加入蒸馏水n mL、考马斯亮蓝标准储备液5mL，充分混合，然后以空白试剂为参照，在波长595nm下测定吸光度，测得吸光度值对照标准曲线及线性回归方程Y＝aX+b，根据纤维溶解及稀释倍数，计算出待测样品的蛋白质含量。