CN101648995B - 人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法。本发明涉及一种人重组Reg4蛋白，该蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；(b)(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有肿瘤细胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白质；本发明还涉及编码所述人重组Reg4蛋白的DNA序列；本发明还提供了制备所述人重组Reg4蛋白的方法：构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体；制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体；培养转化体，表达蛋白；纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具有活性的形式，制备方法简单、成本低廉，蛋白产品纯度达到98％以上，内毒素含量低，活性高。

Description

人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

Reg4蛋白能促进几种肿瘤细胞的增殖和生长，在结肠癌、胃癌、胰腺癌和***癌，以及炎症性肠病中表达明显升高。人Reg4基因(NM_032044.2)1285bp，CDS长度477bp。CDS前面66bp编码一长度为22个氨基酸的信号肽。信号肽不包含在分泌出来的Reg4内。但Reg4在生物体内含量很少，且难以纯化。目前尚无有具有生物活性的人重组Reg4蛋白报道或上市。我们实验室发展出一种在大肠杆菌中直接表达并纯化成熟形式的人重组Reg4的方法，并在体外检测了重组Reg4蛋白的生物学活性。采用我们的方法纯化出来的人重组Reg4具有纯度高、内毒素含量低、活性强的优点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有现有技术的不足，提供一种人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具有活性的形式，制备方法简单、成本低廉，蛋白产品纯度达到98％以上，内毒素含量低，活性高。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种人重组Reg4蛋白，该蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

(b)(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有肿瘤细胞促增值活性的由(a)衍生的蛋白质。

第二方面，本发明涉及一种编码上述人重组Reg4蛋白的DNA序列，序列如SEQ ID NO：2所示。

第三方面，本发明涉及一种制备上述人重组Reg4蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤一，构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体；

步骤二，制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体；

步骤三，培养转化体，表达蛋白；

步骤四，纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白。

步骤一中，所述DNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

步骤一中，所述重组表达载体为原核表达载体或真核表达载体。

步骤一中，所述重组表达载体为原核表达载体。

步骤一中，所述重组表达载体为pET30a质粒。

步骤二中，所述转化体为大肠杆菌。

在步骤三之后和步骤四之前还包括如下步骤：将大肠杆菌破菌并收集包涵体，包涵体用Pellet Wash Buffer洗涤后，溶解至盐酸胍变性溶液中，然后再将盐酸胍变性溶液加入到复性液中，得到复性后的人重组Reg4蛋白溶液；其中，

所述复性液的组分及含量为：1L复性液的组分及含量为：Tris 6.057g，KCl0.7455g，NaCl 14g，MgCl₂0.4g，CaCl₂0.3g，Guanidine-HCL 47.76g，Sucrose136.92g，Arginine-HCL 105.35g，GSH 300mg，GSSH 60mg，余量为水。

优选地，所述复性后的人重组Reg4蛋白溶液中人重组Reg4蛋白浓度为0.1mg/mL。

对得到的复性后的人重组Reg4蛋白溶液进行如下处理：4℃静置过夜，12000rpm离心30min，得上清，将上清pH值调至8.0，再离心12000rpm离心30min，收集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7.2的磷酸缓冲液稀释，之后用膜包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6.5的磷酸缓冲液将去水后得到的溶液稀释10倍。

所述纯化为阳离子交换柱纯化，具体为：

步骤一，用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及阳离子交换柱，直至电导与UV值平衡；

步骤二，上样，控制流速为1ml/min；

步骤三，用pH为6.5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白；

步骤四，收集流穿液。

所述阳离子交换柱为S/CM柱。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明首次公开了人重组Reg4蛋白的制备方法。本发明所提供的人重组Reg4蛋白为直接具有活性的形式。本发明所述制备人重组Reg4蛋白的方法，工艺简单、成本低廉，不需要酶切等额外的步骤，所生产的重组Reg4蛋白产品纯度达到98％以上，内毒素含量低，活性高。这为Reg4蛋白在新药研发和检测试剂的应用提供了丰富的、高质量的原料。

附图说明

图1为自人Reg4cDNA中PCR出来的人Reg4基因片段和割胶回收后的Reg4基因片段的电泳图；

图2为包装的pET30a质粒示意图；

图3为表达的人重组Reg4的电泳图；

图4为以FPLC方法纯化的人重组Reg4检测结果图；

图5为纯化的人重组Reg4电泳图；

图6为人重组Reg4纯度的SEC-HPLC检测结果图；

图7为人重组Reg4蛋白western blotting电泳图；

图8为纯化后人重组Reg4蛋白对结肠癌细胞促增殖作用的对比图。

本发明涉及的大肠杆菌BL21(DE3)已在《Guo D，Hu K，Lei Y，Wang Y，MaT，He D.Identification and characterization of a novel cytoplasm proteinICF45 that is involved in cell cycle regulation.J Biol Chem.2004，279(51)：53498-53505》文献中公开。大肠杆菌BL21(DE3)可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从德国Novagen公司购得，编号为Novagen：69389；

本发明涉及的表达载体PET30a(+)已在《Lin M，Trottier E，Pasick J，Sabara M.Identification of antigenic regions of the Erns protein for pigantibodies elicited during classical swine fever virus infection.JBiochem.2004，136(6)：795-804》文献中公开。表达载体PET30a(+)可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从德国Novagen公司购得，编号为Novagen：69909-3。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York ColdSpring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通过从酵母、如细菌的微生物或人或动物细胞系中分泌，可产生重组分子形式的本实施例的人重组Reg4蛋白。任选从宿主细胞中分泌多肽。

许多表达***是已知的和可用的，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽袍杆菌)，酵母(例如酿酒酵母、乳克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)，丝状真菌(例如曲霉)，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。

本实施例包括编码本实施例的人重组Reg4蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。

本实施例中，转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。

本实施例还包括通过合成和重组技术生产本实施例的人重组Reg4蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、宿主细胞和生物体。

用于本实施例的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本实施例的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology.GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience(1992)和Sambrook etal.(1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使DNA与载体可操作相连。例如，可在欲***载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3’，5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

多核苷酸***物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体久PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO，COS，NSO，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

本实施例还包括含有本实施例的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节***的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。

通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本实施例的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al.，BasicMethodsIn Molecular Biology(1986)。

编码本实施例的人重组Reg4蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。

通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本实施例的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使用如Southem(1975)J.Mol.Biol.95，503或Berentet al(1985)Biotech.3，208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。

通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本实施例的入重组Reg4蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。

在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本实施例的人重组Reg4蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本实施例的人重组Reg4蛋白，所述层析柱有：Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或Methyl柱。

另外，可使用国际公开号WO00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本实施例的人重组Reg4蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本实施例的人重组Reg4蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本实施例的人重组Reg4蛋白。

实施例

步骤一，人重组Reg4蛋白表达载体的构建

从人类肝脏cDNA中用引物5’GGAATTCCATATGGATATCATCATGAGACCCAGC 3’(SEQ ID NO：4)和反向引物5’CGGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAGG 3’(SEQID NO：5)(由上海生工合成)PCR出人Reg4基因。引物中加下划线的部分是NdeI和BamH I的酶切位点。PCR条件为：94℃2分钟：94℃30秒钟，58℃30秒钟，68℃30秒钟，35循环。PCR产物凝胶电泳，回收约500bp的DNA片段(见图1)，以Nde I和BamH双酶切并将酶切下来的片段包装进入Nde I和BamH双酶切的pET30a质粒并测序(Invitrogene)。以卡拉霉素平板挑选阳性克隆，并将阳性克隆抽提质粒，以Nde I和BamH双酶切验和测序验证正确包装的质粒(SEQID NO：2)。图1为自人Reg4cDNA中PCR出来的人Reg4基因片段和割胶回收后的Reg4基因片段的电泳图；图2为包装的pET30a质粒示意图，其中斜体部分为Nde I和BamH的酶切位点，终止子为“TAG”。将包装的pET30a载体转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，并行双酶切、PCR和测序鉴定，选出构建成功的Reg4-pET30a-BL21工程菌株。

步骤二，人重组Reg4蛋白的表达

步骤一中制备的工程菌株在LB培养基(1％NaCl；1％Tryptone；0.5％YeastExtract；pH7.0)中培养至OD600＝0.6左右时，加入IPTG进行诱导(我们使用的是1mM浓度，然而，更高或者更低的浓度也是适用的)，诱导在37～42℃下摇床培养进行4小时。诱导结束后离心收集菌体，并以1×PBS(137mM NaCl；2.7mMKCl；4.3mM Na₂HPO₄；1.4mM KH₂PO₄；pH7.4)进行洗涤。图3为表达的人重组Reg4的电泳图；图3中，第一道：分子量标记；第二道：未经IPTG诱导的工程菌株；第三道：经IPTG诱导的工程菌株；可见在约16kDa处有诱导出来的人重组Reg4。

步骤三，人重组Reg4蛋白的变性及复性

步骤二中离心收集的菌体以超声的方式进行破菌并收集包涵体(新芝JY92-2D，500W，适量超声。我们的方法中使用的是3秒超声3秒休息为一个循环，共30分钟。超声缓冲液：1×PBS；1mM EDTA；0.1mM PMSF；pH7.4。包涵体以Pellet Wash Buffer(所述Pellet Wash Buffer的组分及含量为：100mlPellet Wash Buffer的组分及含量为：Triton X-100 1ml，EDTA 0.292g，NaCl0.293g，余量为1×PBS；其中1L 1×PBS的组分及含量为：NaCL 8g，KCL 0.2g，Na₂HPO₄ 1.42g，KH₂PO₄ 0.27g，余量为水)；

洗涤后以50倍体积的盐酸胍变性溶液溶解(所述盐酸胍变性溶液的组分及含量为：100ml盐酸胍变性溶液的组分及含量为：Tris 0.606g，EDTA 0.292g，NaCl0.293g，Guanidine-HCL 57.318g，余量为水；pH8.0)；

包涵体充分溶解后再将变性液滴加至复性液中(所述复性液的组分及含量为：1L复性液的组分及含量为：Tris 6.057g，KCl 0.7455g，NaCl 14g，MgCl₂0.4g，CaCl₂ 0.3g，Guanidine-HCL 47.76g，Sucrose 136.92g，Arginine-HCL105.35g，GSH 300mg，GSSH 60mg，余量为水)；复性时需严谨控制蛋白浓度，最佳浓度为0.1mg/mL；

将变性-复性后的蛋白溶液小心封好，4℃静置过夜，12000rpm离心30min，得上清，将上清pH值调至8.0，再离心12000rpm离心30min，收集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7.2的磷酸缓冲液稀释，之后用膜包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6.5的磷酸缓冲液将去水后得到的溶液稀释10倍，待过柱纯化。发明人发现采用此缓冲液体系可保证复性出来的人重组Reg4蛋白能被方便的纯化出来并且具有相应的生物学活性。

步骤四，人重组Reg4蛋白的纯化

步骤三中所制备的人重组Reg4蛋白复性液在15000rpm离心30分钟后，取上清以经膜包去盐去水后，进行离子交换柱纯化。在我们的方法中采用了一步离子交换柱纯化的方法。步骤如下：

(1)Phase A(磷酸盐缓冲液，pH 6.5)平衡柱床：用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及柱子，直至电导与UV值平衡；

(2)上样，控制流速为1ml/min；

(3)用pH为6.5的含有1M NaGl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白；

(4)收集Flow Through(流穿液)：观察紫外吸收曲线，在上样时和洗脱时紫外吸收升高时收集Flow Through；

(5)纯化后的人重组Reg蛋白以以pH7.4的1×PBS透析；

(6)透析后的蛋白浓度可达1mg/mL以上，纯度可达98％以上，蛋白可直接以液氮速冻后置于-80℃低温冰箱保存。

图4为以FPLC方法纯化的人重组Reg4检测结果图；图中显示的是阳离子柱纯化，根据紫外吸收峰和电导曲线，收集洗脱峰。

以下是对制备得到的Reg 4蛋白进行的相关检测：

一，Reg 4蛋白的常规检测

(1)按照常规SDS-PAGE电泳操作检测纯度。图5为纯化的人重组Reg4电泳图；如图5所示，第一道：分子量标记。第二道：未经IPTG诱导后的工程菌株。第三道：经IPTG诱导后的工程菌株。第四道：洗涤后包涵体。第五道：变性后上清。第六道：阳离子交换柱洗脱下来的纯化的人重组Reg4蛋白。蛋白纯度经BandScan软件分析其纯度可达98％以上；

(2)步骤四制备的人重组Reg4蛋白进行HPLC-SEC检测，条件为：(条件：ACME 9000(Younglin，Korea)，TSK-GEL G2000SWXL(Tosoh，Japan)上样量为20μl，蛋白浓度为0.5μg/μl，流速为0.8mL/min，UV检测280nm)。可见在洗脱液中，只有一个峰存在。如图6所示，图6为人重组Reg4纯度的SEC-HPLC检测结果图；

(3)按照常规Western blotting检测表达蛋白的特异性。将菌体蛋白经SDS-PAGE电泳后，转膜到PVDF膜上，5％脱脂奶粉4度封闭过夜，商品化的抗Reg4抗体室温孵育1h，洗膜3次，二抗室温孵育45mins，ECL检测。图7为人重组Reg4蛋白western blotting电泳图；图7中，第一道：IPTG诱导的菌体蛋白；第二道：未经IPTG诱导的菌体蛋白。可见表达的蛋白确为特异性的Reg 4蛋白。

二，人重组Reg4蛋白内毒素检测

采用鲎试剂(厦门鲎试剂实验厂有限公司)，检测了步骤四制备的三批人重组Reg4蛋白的内毒素含量，均＜1E.U/ug。

三，人重组Reg4蛋白活性检测

步骤四制备的人重组Reg4蛋白对于结肠癌细胞显示了较强的促增殖作用。HCT116(a)和HT29(b)细胞长满培养皿70-80％时，在无小牛血清1640培养液中培养过夜；将HCT116和HT29细胞以1×10³/孔的密度分别接种于96孔培养板，在0.1ml 1640培养液(含10％胎牛血清)中于37℃、含5％CO2的孵箱中培养过夜；吸去培养液，加入0.1ml新鲜1640培养液(含5％胎牛血清，但含有不同浓度的重组hReg4纯品(0nM，，10nM，100nM，200nM，500nM，1000nM))继续培养68h；终止培养前加入CCK-8溶液10ul/孔，37℃温育3h，测定OD450nm和OD490nm值。同时设置空白孔(培养基、CCK-8溶液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、CCK-8溶液)，每组设定6复孔，结果取其平均值。图8为纯化后人重组Reg4蛋白对结肠癌细胞促增殖作用的对比图：纯化后人重组Reg4蛋白对对结肠癌细胞显示了较强的促增殖作用。

四，人重组Reg4第12位氨基酸由Gly改为Ala

将步骤一中所述的PCR目的基因片段自起始密码子ATG之后第32位碱基以定点突变的方法改成G，即(ATGGATATCATCATGAGACCCAGCTGTGCTCCTGGA)改为(ATGGATATCATCATGAGACCCAGCTGTGCTCCTGCA)，表达并纯化后的蛋白质序列第12位由Gly变为Ala(见SEQ ID NO：3)，即(MDIIMRPSCAPG)成为(MDIIMRPSCAPA)。对这一纯化后的蛋白质采用了“三，人重组Reg4蛋白活性检测”中所述的方法，在变异后的人重组Reg4蛋白浓度为0nM，10nM，100nM，200nM，500nM，1000nM时，其活性与步骤四制备的人重组Reg4蛋白相比无显著变化。

序列表

<110>上海交通大学

<120>人重组Reg4蛋白及其编码基因以及该蛋白的制备方法

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>137

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MUTAGEN

<222>(1)..(1)

<400>1

Met Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His

1               5                   10                  15

Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp

            20                  25                  30

Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly

    50                  55                  60

Tyr Gln Arg Ser Gln Pro Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys

65                  70                  75                  80

Arg Gln Gln Trp Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser

                85                  90                  95

Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser

            100                 105                 110

Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg

        115                 120                 125

Gln His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro

    130                 135

<210>2

<211>423

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>2

catatggata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat ggttttacca caagtccaat     60

tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg ccgagctcga gtgtcagtct    120

tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa aggaagccag caccatagca    180

gagtacataa gtggctatca gagaagccag ccgatatgga ttggcctgca cgacccacag    240

aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc tgtacagatc ctggtctggc    300

aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct ccaataacaa ctttttaact    360

tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt gcaagtaccg accataggga    420

tcc                                                                  423

<210>3

<211>137

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Met Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro Ala Trp Phe Tyr His

1               5                   10                  15

Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp

            20                  25                  30

Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly

    50                  55                  60

Tyr Gln Arg Ser Gln Pro Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys

65                  70                  75                  80

Arg Gln Gln Trp Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser

                85                  90                  95

Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser

            100                 105                 110

Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg

        115                 120                 125

Gln His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro

    130                 135

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>4

ggaattccat atggatatca tcatgagacc cagc    34

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<400>5

cgggatccct atggtcggta cttgcacagg         30

Claims (3)

1.一种制备人重组Reg4蛋白的方法，其中的人重组Reg4蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质；

(b)(a)中的氨基酸序列经过一个氨基酸突变衍生的如SEQ ID NO：3所示的蛋白质，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一，构建含有编码人重组Reg4蛋白DNA的重组表达载体；

步骤二，制备含有步骤一所得重组表达载体的转化体；

步骤三，培养转化体，表达蛋白；然后将大肠杆菌破菌并收集包涵体，包涵体用Pellet Wash Buffer洗涤后，溶解至盐酸胍变性溶液中，然后再将盐酸胍变性溶液加入到复性液中，得到复性后的人重组Reg4蛋白溶液；其中，所述复性液的组分及含量为：1L复性液的组分及含量为：Tris 6.057g，KCl 0.7455g，NaCl 14g，MgCl₂0.4g，CaCl₂0.3g，Guanidine-HCL 47.76g，Sucrose 136.92g，Arginine-HCL 105.35g，GSH 300mg，GSSH 60mg，余量为水；

所述复性后的人重组Reg4蛋白溶液中人重组Reg4蛋白浓度为0.1mg/ml，对得到的复性后的人重组Reg4蛋白溶液进行如下处理：4℃静置过夜，12000rpm离心30min，得上清，将上清pH值调至8.0，再离心12000rpm离心30min，收集上清；之后将上清用与上清等体积的pH为7.2的磷酸缓冲液稀释，之后用膜包去盐去水至稀释后总体积的1/10，再用pH为6.5的磷酸缓冲液将去水后得到的溶液稀释10倍；

步骤四，纯化蛋白，得到人重组Reg4蛋白；

所述纯化为阳离子交换柱纯化，具体为：

i)用pH为6.5磷酸盐缓冲液清洗管路及阳离子交换柱，直至电导与UV值平衡；

ii)上样，控制流速为1ml/min；

iii)用pH为6.5的含有1M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱蛋白；

iv)收集流穿液。

2.根据权利要求1所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一中，所述DNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的人重组Reg4蛋白的制备方法，其特征是，步骤一中，所述重组表达载体为pET30a质粒。

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