CN104155371B - 治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸hplc指纹图谱的建立方法及其hplc指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC指纹图谱，所述建立方法包括以下步骤：(1)、对照品溶液的制备；(2)、供试样品的制备；(3)、高效液相色谱法测定条件的建立及测定。上述消渴丸HPLC指纹谱图的建立方法专属性强、操作简便、具有优异的稳定性、精密度和重现性，可较全面地检测消渴丸中多种主要有效成分，从而构建科学合理的消渴丸HPLC指纹图谱，完整准确地评价消渴丸的安全性、有效性、稳定性和质量均一性。

Description

治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC指纹图谱

技术领域

本发明涉及一种治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸的质量检测方法，特别是涉及消渴丸HPLC指纹图谱的建立及其HPLC指纹图谱。

背景技术

治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸为中药黄芪、地黄、葛根、山药、玉米须、南五味子、天花粉与西药格列本脲组成的中西药复方制剂，具有滋肾养阴、益气生津的功效，临床上多用于治疗气阴两虚所致的消渴病（2型糖尿病），现收载于2010年版《中华人民共和国药典》。作为中西药复合的降糖药物消渴丸，既发挥了中医药的整体调理，防治并发症的优点，又克服了化学药长期服用易产生耐药性及副作用的缺点。截至目前统计，消渴丸销售额已累计超过50亿元，在治疗糖尿病药品中位居第三，仅排在拜糖平和达美康之后。

消渴丸的中药组方来源于元代名医朱丹溪的消渴方和清代名医叶天士的玉泉散，其所含七味中药的化学成分复杂，其中黄芪的主要成分是黄酮和皂苷类化合物（温燕梅，中成药，2006，28(6)：879-893）；地黄的主要成分为环烯醚萜苷（曾艳等，中成药，2006，28(4)：609-611）；葛根的主要成分包括异黄酮、三萜及其皂苷类化合物（尹丽红等，黑龙江医药，2010，23(3)：371-372）；山药中主要成分有多糖、脂肪酸等（赵宏等，今日药学，2009，19(3)：49-52）；玉米须含有黄酮及苷类、挥发性成分、糖类等（朱旭等，长春中医药大学学报，2009，25(2)：183-184）；南五味子中以木脂素和挥发油为主要成分（孙龑龑等，陕西中医学院学报，2007，30(4)：74-75）；天花粉中则含有三萜及其皂苷以及多糖等成分（李振红等，国外医药植物药分册，2003，18(1)：1-4）。但目前对其整方化学成分未进行研究。《药典》中对消渴丸的质量控制包括黄芪、南五味子、山药的显微鉴别；薄层色谱法对葛根素、黄芪甲苷、五味子甲素的定性鉴定；高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对葛根素和格列本脲的含量测定。由于这些方法不能***、完整地反映消渴丸的内在质量，因此在消渴丸的质量控制上具有一定的局限性。

随着高效液相色谱技术优点的日益凸现，HPLC指纹图谱方法，特别是多指标成分HPLC指纹图谱技术开始广泛应用于中药质量控制领域。该技术结合提取分离技术、波谱学方法以及高效液相色谱技术明确中药的主要有效成分，确定指纹图谱重点监控的指标成分，既从宏观上表现中药的整体特征，又从微观上监控其多个指标成分，使中药制剂的质量标准更加完善。

发明内容

基于此，有必要提供一种可以全面反映消渴丸内在质量的治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC指纹图谱。

一种治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)、对照品溶液的制备

精密称取3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖、大豆苷、大豆素、五味子酯甲、五味子甲素，分别加入甲醇溶解各稀释成浓度为0.01～0.1mg/mL的溶液，滤过，即得；

(2)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉，加入85-95%乙醇，加热回流，冷至室温，过滤，浓缩，然后用40-60%甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，即得；

(3)、高效液相色谱法测定

将步骤(2)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温：20-50℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.01%-0.1%的甲酸-水溶液，梯度洗脱;

检测波长：235-280nm。

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述的梯度洗脱方法为：洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A的体积百分比为2%、流动相B体积百分比为98%；

10分钟时，流动相A的体积百分比为5%、流动相B的体积百分比为95%；

20分钟时，流动相A的体积百分比为22%、流动相B的体积百分比为78%；

25分钟时，流动相A的体积百分比为25%、流动相B的体积百分比为75%；

35分钟时，流动相A的体积百分比为30%、流动相B的体积百分比为70%；

60分钟时，流动相A的体积百分比为50%、流动相B的体积百分比为50%；

65分钟时，流动相A的体积百分比为65%、流动相B的体积百分比为35%；

70分钟时，流动相A的体积百分比为95%、流动相B的体积百分比为5%；

80分钟时，流动相A的体积百分比为95%、流动相B的体积百分比为5%。

在其中一个实施例中，步骤(3)中的色谱条件还包括：

流速：0.8-1.2mL/min；

进样量：2-20μL。

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述流速为1mL/min,所述进样量为10μL。

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述色谱柱为Welch Materials XB-C₁₈柱，规格为4.6×260mm,5μm，或Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为4.6×250mm,5μm。。

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述柱温为30℃。

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述流动相B为甲酸体积百分比为0.02%甲酸-水溶液。

上述消渴丸HPLC指纹图谱建立方法得到的HPLC指纹谱图中有12个特征共有峰，其中10号峰为大豆素参照峰，最强峰为4号峰，图谱总长度为78分钟，具体如下：

1号峰，保留时间为13.837分钟，相对保留时间为0.2184；峰面积为581.0910，相对峰面积为0.2566；

2号峰，保留时间为17.823分钟，相对保留时间为0.2813；峰面积为444.5910，相对峰面积为0.2000；

3号峰为3′-羟基葛根素，保留时间为29.488分钟，相对保留时间为0.4654；峰面积为986.5500，相对峰面积为0.4252；

4号峰为葛根素，保留时间为35.372分钟，相对保留时间为0.5583；峰面积为5942.3160，相对峰面积为2.5649；

5号峰为3′-甲氧基葛根素，保留时间为36.998分钟，相对保留时间为0.5839；峰面积为1474.1900，相对峰面积为0.6362；

6号峰为大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖，保留时间为39.204分钟，相对保留时间为0.6187；峰面积为842.2190，相对峰面积为0.3641；

7号峰为大豆苷，保留时间为40.906分钟，相对保留时间为0.6456；峰面积为1090.1780，相对峰面积为0.4715；

8号峰，保留时间为54.680分钟，相对保留时间为0.8630；峰面积为301.5630，相对峰面积为0.1309；

9号峰，保留时间为57.767分钟，相对保留时间为0.9117；峰面积为1085.8930，相对峰面积为0.4613；

10号峰为大豆素，保留时间为63.362分钟，相对保留时间为1.0000；峰面积为2340.8880，相对峰面积为1.0000；

11号峰为五味子酯甲，保留时间为73.174分钟，相对保留时间为1.1549；峰面积为273.2360，相对峰面积为0.1188；

12号峰为五味子甲素，保留时间为74.116分钟，相对保留时间为1.1697，峰面积为161.8080，相对峰面积为0.0704。

本发明是在对消渴丸整方进行***化学成分研究，并通过高效液相色谱法鉴定了消渴丸主要色谱峰结构的基础上，提供了一种可指认消渴丸多指标成分的HPLC指纹图谱的构建方法。所述HPLC指纹图谱建立方法专属性强、操作简便、具有优异的稳定性、精密度和重现性，可较全面地检测消渴丸中多种主要有效成分，从而构建科学合理的消渴丸HPLC指纹图谱，进而更全面准确地监控消渴丸的质量，完整、准确地评价消渴丸的安全性、有效性、稳定性和质量均一性。

附图说明

图1为实施例1中消渴丸主要化学成分的分离流程图；

图2为实施例1的3′-羟基葛根素的ESI-MS图；

图3为实施例1的3′-羟基葛根素的核磁共振氢谱图；

图4为实施例1的3′-羟基葛根素的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图5为实施例1的葛根素的ESI-MS图；

图6为实施例1的葛根素的核磁共振氢谱图；

图7为实施例1的葛根素的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图8为实施例1的3′-甲氧基葛根素的ESI-MS图；

图9为实施例1的3′-甲氧基葛根素的核磁共振氢谱图；

图10为实施例1的3′-甲氧基葛根素的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图11为实施例1的大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖的ESI-MS图；

图12为实施例1的大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖的核磁共振氢谱图；

图13为实施例1的大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图14为实施例1的大豆苷的ESI-MS图；

图15为实施例1的大豆苷的核磁共振氢谱图；

图16为实施例1的大豆苷的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图17为实施例1的大豆素的ESI-MS图；

图18为实施例1的大豆素的核磁共振氢谱图；

图19为实施例1的大豆素的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图20为实施例1的五味子酯甲的ESI-MS图；

图21为实施例1的五味子酯甲的核磁共振氢谱图；

图22为实施例1的五味子酯甲的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图23为实施例1的五味子甲素的ESI-MS图；

图24为实施例1的五味子甲素的核磁共振氢谱图；

图25为实施例1的五味子甲素的DEPT图与核磁共振碳谱图；

图26为实施例2的20批消渴丸的HPLC色谱图；

图27为实施例2的消渴丸HPLC标准指纹图谱；

图28为实施例2的对照品与消渴丸供试样品溶液主要色谱峰对比的色谱图；

图29为实施例2的消渴丸HPLC标准指纹图谱中主要色谱峰与其结构的紫外吸收匹配图；

图30为实施例2的可化学指认的消渴丸HPLC指纹图谱。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步的阐述。

供试样品来源：广州白云山中一药业有限公司；

仪器：Bruker AV-400型核磁共振仪(美国Bruker公司)；Finnigan LCQAdvantage MAX型质谱仪(Thermo Finnigan公司)；Agilent1200分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent1260制备型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);

色谱测定中所用到的试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

实施例1治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸主要化学成分的分离、纯化以及结构鉴定

消渴丸制丸前药粉加质量百分比浓度为75%的乙醇，超声提取两次，第一次加制丸前药粉10倍重量的75%乙醇，第二次加8倍量75%乙醇，每次超声提取30min，取上清液，浓缩至密度约为1.10g/cm³，得到消渴丸醇提物。将消渴丸醇提物加适量水混悬，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂后得乙酸乙酯萃取物400g。

如图1所示，取消渴丸醇提乙酸乙酯萃取物400g，进行硅胶（100-200目）柱层析，依次用V(氯仿):V(甲醇)为100:0、97:3、95:5、9:1、85:15、8:2、7:3、6:4、5:5、0:100进行梯度洗脱，经薄层色谱检识合并相同馏分，得到10个部分，标记为Fr.A～J。Fr.D析出沉淀，沉淀经反复重结晶，得到化合物10。Fr.C进行硅胶（100-200目）柱层析，依次用V(石油醚):V(乙酸乙酯)为100:0、95:5、9:1、85:15、8:2、7:3、5:5、0:100进行梯度洗脱，经薄层色谱检识合并相同馏分，得到8个部分，标记为Fr.Ⅰ～Ⅷ。Fr.Ⅰ～Ⅶ分别析出沉淀，沉淀经反复重结晶，分别得到化合物11～16。其中Fr.Ⅴ进行反相键合硅胶柱层析，用甲醇-水（10%甲醇～90%甲醇）进行梯度洗脱，经薄层色谱检识合并相同馏分，得到8个部分，标记为Fr.1～8。Fr.1经过两次Sephadex LH20柱层析，及制备型HPLC分离，得到化合物17。Fr.2～5放置分别析出沉淀，沉淀经反复重结晶，得到化合物18～21。

Fr.G与Fr.H进行硅胶（200-300目）柱层析，依次用V(氯仿):V(甲醇)为100:0、9:1、85:15、8:2、7:3、5:5、0:100进行梯度洗脱，经薄层色谱检识合并相同馏分，得到8个部分，标记为Fr.a～h。Fr.a经过两次Sephadex LH20柱层析，分别得到化合物5和7。Fr.e、Fr.f放置分别析出沉淀，沉淀经反复重结晶，分别得到化合物4和3。Fr.g经制备型HPLC分离，得到化合物6和22。

所述制备型HPLC的色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

流动相：20～45%（v/v）甲醇水溶液；

柱温：20～40℃；

检测波长：280nm；

流速：5～8mL/min；

进样量：0.01～0.2mL。

采用波谱学的方法鉴定消渴丸中含有的化学成分分别为3′-羟基葛根素3、葛根素4、3′-甲氧基葛根素5、大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖6、大豆苷7、大豆素10、五味子酯甲11、五味子甲素12、刺芒柄花素、3′-甲氧基大豆素、毛蕊异黄酮、葛根素木糖苷、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、十七烷酸、5-羟基麦芽酚、3,4-二羟基苯乙酮和咖啡酸甲酯；其中，指纹图谱可化学指认化合物的光谱和理化数据如下：

3′-羟基葛根素3：白色粉末(甲醇)，熔点：216～217℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：433[M+H]⁺。ESI-MS图如图2所示。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：10.38(1H，s，7-OH)，9.53(1H，s，4'-OH)8.97(1H，s，3'-OH)，8.29(1H，s，H-2)，7.94(1H，d，J=8.8Hz，H-5)，6.99(1H，d，J=8.8Hz，H-6)，7.03(1H，d，J=1.9Hz，H-2')，6.76(1H，d，J=8.1Hz，H-5')，6.81(1H，dd，J=8.1Hz，1.9Hz，H-6')，4.81(1H，d，J=9.8Hz，H-1″)，3.17～4.99(m，糖上各质子)。3′-羟基葛根素的核磁共振氢谱图如图3所示。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ：174.9(C-4)，161.1(C-7)，155.9(C-9)，152.6(C-2)，1445.3(C-4')，1444.8(C-3')，126.3(C-5)，123.3(C-3)，123.0(C-1')，119.8(C-6')，116.7(C-10)，116.7(C-5')，115.4(C-6)，115.4(C-2')，112.7(C-8)，81.8(C-5″)，78.8(C-3″)，73.5(C-1″)，70.5(C-2″)，70.8(C-4″)，61.4(C-6″)。3′-羟基葛根素的核磁共振碳谱图如图4所示。

葛根素4：白色簇晶(甲醇)，熔点：186～187℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：417[M+H]⁺。葛根素的ESI-MS如图5所示。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：9.53(1H，s，4'-OH)，8.34(1H，s，H-2)，7.94(1H，d，J=8.8Hz，H-5)，7.39(2H，d，J=8.6Hz，H-2'，H-6')，6.98(1H，d，J=8.8Hz，H-6)，6.80(2H，d，J=8.6Hz，H-3'，H-5')，4.81(1H，d，J=9.5Hz，H-1″)，4.52～4.98(4H，m)，3.16～4.01(6H，m)。葛根素的核磁共振氢谱图如图6所示。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ：174.9(C-4)，161.1(C-7)，157.1(C-9)，157.1(C-4')，152.7(C-2)，130.0(C-2')，130.0(C-6')，126.2(C-5)，123.1(C-1')，122.5(C-3)，116.9(C-10)，115.5(C-6)，115.0(C-3')，115.0(C-5')，112.7(C-8)，81.9(C-5″)，78.7(C-3″)，73.4(C-1″)，70.7(C-4″)，70.5(C-2″)，61.6(C-6″)。葛根素的核磁共振碳谱图如图7所示。

3′-甲氧基葛根素5：白色粉末(甲醇)，熔点：215～216℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：447[M+H]⁺。3′-甲氧基葛根素的ESI-MS图如图8所示。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：9.09(1H，s，4'-OH)，8.40(1H，s，H-2)，7.96(1H，d，J=8.8Hz，H-5)，7.17(1H，d，J=1.9Hz，H-2')，7.04(1H，dd，J=8.2，1.9Hz，H-6')，6.99(1H，d，J=8.8Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=8.2Hz，H-5')，4.82(1H，d，J=9.8Hz，H-1″)，3.80(3H，s，OCH₃)，3.17～4.99(m，糖上各质子)。3′-甲氧基葛根素的核磁共振氢谱图如图9所示。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ：174.9(C-4)，161.2(C-7)，156.4(C-9)，153.0(C-2)，147.2(C-3')，146.4(C-4')，126.3(C-5)，123.1(C-1')，123.0(C-6')，115.7(C-6)，115.2(C-10)，115.2(C-5')，113.1(C-2')，112.7(C-8)，81.9(C-5″)，78.8(C-3″)，73.5(C-1″)，70.8(C-2″)，70.5(C-4″)，61.3(C-6″)，55.7(3'-OCH₃)。3′-甲氧基葛根素的核磁共振碳谱图如图10所示。

大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖6：白色粉末(甲醇)，熔点：189～190℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：549[M+H]⁺。大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖的ESI-MS图如图11所示。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：9.53(1H，s，4'-OH)，8.32(1H，s，H-2)，7.93(1H，d，J=8.8Hz，H-5)，7.40(2H，d，J=8.6Hz，H-2'，H-6')，6.98(1H，d，J=8.8Hz，H-6)，6.80(2H，d，J=8.6Hz，H-3'和H-5')，5.07(1H，d，J=9.5Hz，H-1″)，4.78(1H，d，J=3.2Hz，H-1″′)，3.17～4.07(m，糖上各质子)。大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖的核磁共振氢谱图如图12所示。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ：174.9(C-4)，161.4(C-7)，157.2(C-9)，157.2(C-4')，152.6(C-2)，130.1(C-2')，130.1(C-6')，126.3(C-5)，123.1(C-3)，122.6(C-1')，116.7(C-10)，115.0(C-6)，115.0(C-3')，115.0(C-5')，112.5(C-8)，109.1(C-1″′)，80.1(C-5″)，78.8(C-3″′)，78.8(C-3″)，73.4(C-1″)，73.2(C-4″′)，70.7(C-2″)，70.6(C-4″)，68.4(C-6″)，63.0(C-5″′)。大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖的核磁共振碳谱图如图13所示。

大豆苷7：无色针状结晶(甲醇)，熔点：234～235℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：439[M+Na]⁺。大豆苷的ESI-MS图如图14所示。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：9.53(1H，s，4'-OH)，8.35(1H，s，H-2)，8.01(1H，d，J=8.9Hz，H-5)，7.37(2H，d，J=8.5Hz，H-2'，H-6')，7.19(1H，d，J=2.10Hz，H-8)，7.10(1H，dd，J=8.9，2.1Hz，H-6)，6.78(2H，d，J=8.5Hz，H-3'和H-5')，5.06(1H，d，J=5.0Hz，H-1″)，4.58～5.43(4H，m)，3.12～3.70(6H，m)。大豆苷的核磁共振氢谱图如图15所示。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ：174.3(C-4)，160.9(C-7)，156.8(C-9)，156.6(C-4')，152.9(C-2)，129.6(C-6')，129.6(C-2')，126.5(C-5)，123.2(C-3)，121.8(C-1')，118.0(C-10)，115.1(C-6)，114.5(C-5')，114.5(C-3')，102.9(C-8)，99.5(C-1″)，76.7(C-5″)，75.9(C-3″)，72.7(C-2″)，69.2(C-4″)，60.2(C-6″)。大豆苷的核磁共振碳谱图如图16所示。

大豆素10：无色针状结晶(甲醇)，熔点：314～315℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：277[M+Na]⁺。大豆素的ESI-MS图如图17所示。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：10.79(1H，br s，7-OH)，9.53(1H，br s，4'-OH)，8.28(1H，s，H-2)，7.96(1H，d，J=8.8Hz，H-5)，7.37(2H，d，J=8.8Hz，H-2'，H-6')，6.93(1H，dd，J=8.8，2.20Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=2.2Hz，H-8)，6.80(2H，d，J=8.8Hz，H-3'和H-5')。大豆素的核磁共振氢谱图如图18所示。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ：174.7(C-4)，162.5(C-7)，157.4(C-4')，157.2(C-9)，152.0(C-2)，130.1(C-2')，130.1(C-6')，127.3(C-5)，123.5(C-1')，122.6(C-3)，116.6(C-10)，115.1(C-6)，115.0(C-3')，115.0(C-5')，102.1(C-8)。大豆素的核磁共振碳谱图如图19所示。

五味子酯甲11：白色粉末(甲醇)，熔点：112～113℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：559[M+Na]⁺。五味子酯甲的ESI-MS图如图20所示。

¹H-NMR(Pyridine-d₅，400MHz)δ：7.27-7.78(-COPh)，6.84(1H，s，H-4)，6.41(1H，s，H-11)，5.90(1H，s，H-6)，5.86(2H，s，-OCH₂O-)，3.86，3.68，3.65，3.49(3H，s，OCH₃×4)，3.10(1H，dd，J=13.7，9.6Hz，H-9α)，2.36(1H，d，J=13.7Hz，H-9β)，2.26(1H，m，H-8)，1.57(3H，s，7-CH₃)，1.39(3H，d，J=7.1Hz，8-CH₃)。五味子酯甲的核磁共振氢谱图如图21所示。

¹³C-NMR(Pyridine-d₅，100MHz)δ：165.6(C=O)，152.8(C-1)，152.6(C-3)，149.8(C-12)，142.6(C-2)，141.5(C-14)，137.1(C-10)，135.1(C-13)，133.8(C-4')，133.6(C-5)，130.9(C-2')，130.4(C-6')，130.4(C-1')，128.9(C-3')，128.9(C-5')，123.3(C-15)，122.8(C-16)，113.2(C-4)，103.4(C-11)，101.5(-OCH₂O-)，86.5(C-6)，72.9(C-7)，61.2(2-OCH₃)，61.1(1-OCH₃)，59.1(14-OCH₃)，56.2(3-OCH₃)，44.1(C-8)，37.5(C-9)，29.7(C-18)，20.0(C-17)。五味子酯甲的核磁共振碳谱图如图22所示。

五味子甲素12：白色粉末(甲醇)，熔点：113～114℃，其化学结构式为：

光谱数据如下：

ESI-MS m/z：417[M+H]⁺。五味子甲素的ESI-MS图如图23所示。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ：6.51(2H，d，J=2.18Hz，H-4和H-11)，3.56(6H，s)，3.85(3H，s)，3.86(6H，s)，3.87(3H，s)，2.53(2H，m，H-6)，2.26(1H，dd，J=13.0，9.5Hz，H-9α)，2.03(1H，d，J=13.0Hz，H-9β)，1.88(1H，m，H-8)，1.77(1H，m，H-7)，0.96(3H，d，J=7.1Hz，7-CH₃)，0.71(3H，d，J=7.1Hz，8-CH₃)。五味子甲素的核磁共振氢谱图如图24所示。

¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δ：153.0(C-2)，151.8(C-1)，151.7(C-13)，151.6(C-14)，140.3(C-3)，139.9(C-16)，139.3(C-12)，134.1(C-15)，123.5(C-10)，122.5(C-5)，110.6(C-11)，107.3(C-4)，61.1(OCH₃)，61.1(OCH₃)，60.7(OCH₃)，60.7(OCH₃)，56.1(OCH₃)，56.1(OCH₃)，41.0(C-7)，39.3(C-9)，35.8(C-6)，33.9(C-8)，22.0(C-18)，12.9(C-17)。五味子甲素的核磁共振碳谱图如图25所示。

刺芒柄花素的结构式为：

3′-甲氧基大豆素的结构式为：

毛蕊异黄酮的结构式为：

葛根素木糖苷的结构式为：

黄芪甲苷的结构式为：

黄芪皂苷Ⅱ的结构式为：

十七烷酸的结构式为：CH₃(CH₂)₁₃CH₂CH₂COOH

5-羟基麦芽酚的结构式为：

3,4-二羟基苯乙酮的结构式为：

咖啡酸甲酯的结构式为：

实施例2治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC指纹图谱

(1)、对照品溶液的制备

分别取3′-羟基葛根素3、葛根素4、3′-甲氧基葛根素5、大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖6、大豆苷7、大豆素10、五味子酯甲11、五味子甲素12适量，精密称定，加甲醇溶解各自稀释成浓度为0.01～0.1mg/mL的溶液，用微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

对照品纯度如表1所示：

表1对照品纯度

注：“S”为参照峰。

(2)、供试样品的制备

取消渴丸10颗，研细，精确称取0.2g细粉置于圆底烧瓶中，加入95%乙醇50mL，密塞，浸泡1小时，加热回流1小时，取出，放至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用50%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得。

(3)、高效液相色谱法测定

将步骤(2)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Welch Materials XB-C₁₈柱，规格为4.6×260mm,5μm；

柱温：30℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.02%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表2所示：

表2消渴丸HPLC的洗脱程序

流速：1mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：280nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，再采用消渴丸供试样品的色谱条件对各份对照品溶液进行测定，测定完成后，对比供试样品溶液和对照品溶液色谱峰的保留时间，同时采用二极管阵列检测器在190-400nm紫外区进行在线检测，对比供试样品和各个对照品的紫外吸收行为。对照品与消渴丸供试样品溶液主要色谱峰对比的色谱图如图28所示，消渴丸供试样品色谱图中主要色谱峰与其结构的紫外吸收匹配图如图29所示。

将供试样品的色谱图采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》（国家药典委2010 2.0版）模拟生成消渴丸HPLC指纹图谱。所得供试品HPLC指纹图谱至少包含11个特征峰和1个参照峰（S），根据对照品和供试样品色谱图保留时间和UV谱对照，可指认消渴丸HPLC指纹图谱中的主要色谱峰。各特征峰的保留时间和相对于参照峰的相对保留时间见表3。

表3消渴丸HPLC指纹图谱特征峰的保留时间和相对保留时间

注：“S”为参照峰；“-”为结构未知。

其中，建立指纹图谱的最低所需要的样本量一般以15批以上为宜，本发明所检测的消渴丸样品为20批。

20批消渴丸均由广州白云山中一药业有限公司生产，批号分别为NO1479、NO2020、PO2111、PO1310、NO1324、NO1431、NO2258、NO1554、PO1136、PO1242、PO1195、PY0003、MO0082、LO3597、PO1216、PO1246、PO2145、PO2013、PO1510、NY0011。

按照步骤(2)制备供试样品溶液，采用步骤(3)的色谱条件进行测定，所得的20批消渴丸的指纹图谱如图26所示。

分析所得20批消渴丸指纹图谱的检测数据，计算各特征峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，检测结果见表4、5。

表4二十批消渴丸HPLC指纹图谱的相对保留时间检测结果

注：“S”为参照峰。

表5二十批消渴丸HPLC指纹图谱的相对峰面积检测结果

注：“S”为参照峰。

将20批消渴丸指纹图谱中各特征峰相对保留时间和相对峰面积的平均值，分别作为消渴丸HPLC标准指纹图谱各特征峰相对保留时间和相对峰面积，详见表6。

表6消渴丸的HPLC标准指纹图谱数据

注：“S”为参照峰。

将20批消渴丸的HPLC的指纹图谱叠加，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》（国家药典委2010 2.0版）软件进行分析，采用中位数法，时间窗0.1，以10号峰为参照峰，经多点校正自动匹配后生成消渴丸的HPLC标准指纹图谱。所述消渴丸的HPLC标准指纹图谱如图27所示。

所述的采用中药色谱指纹图谱相似度评价***软件模拟生成消渴丸的标准HPLC指纹图谱为常规方法进行操作：将20批消渴丸HPLC指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》软件进行分析，采用中位数法，时间窗0.1，以10号峰为参照峰，经多点校正自动匹配后生成消渴丸的HPLC标准指纹图谱，确定了12个共有峰。对比12个共有峰与各个对照品的紫外吸收行为，确定了8个可化学指认的共有峰所代表的化合物，即构建了可化学指认的消渴丸HPLC指纹图谱，所述可化学指认的消渴丸HPLC指纹图谱如图30所示。

实施例3治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的测定方法

(1)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉0.2g，加入85%乙醇50mL，加热回流30min，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用40%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得；

(2)、高效液相色谱法测定

将步骤(1)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Welch Materials XB-C₁₈柱，规格为4.6×260mm,5μm；

柱温：20℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.01%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序同实施例2：

流速：0.8mL/min；

进样量：15μL；

检测波长：225nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，其他步骤同实施例2。

实施例4治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的测定方法

(1)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉0.2g，加入95%乙醇50mL，加热回流60min，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用60%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得；

(2)、高效液相色谱法测定

将步骤(1)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Welch Materials XB-C₁₈柱，规格为4.6×260mm,5μm；

柱温：30℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.01%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；

流速：1mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：254nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，其他步骤同实施例2。

实施例5治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的测定方法

(1)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉0.2g，加入90%乙醇50mL，加热回流90min，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用50%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得；

(2)、高效液相色谱法测定

将步骤(1)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Welch Materials XB-C₁₈柱，规格为4.6×260mm,5μm；

柱温：50℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.1%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；

流速：1.2mL/min；

进样量：20μL；

检测波长：280nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，其他步骤同实施例2。

实施例6治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的测定方法

(1)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉0.2g，加入95%乙醇50mL，加热回流30min，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用50%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得；

(2)、高效液相色谱法测定

将步骤(1)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为4.6×250mm,5μm；

柱温：20℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.01%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；

流速：0.8mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：235nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，其他步骤同实施例2。

实施例7治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的测定方法

(1)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉0.2g，加入95%乙醇50mL，加热回流60min，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用50%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得；

(2)、高效液相色谱法测定

将步骤(1)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为4.6×250mm,5μm；

柱温：45℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.05%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；

流速：1mL/min；

进样量：20μL；

检测波长：365nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，其他步骤同实施例2。

实施例8治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的测定方法

(1)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉0.2g，加入95%乙醇50mL，加热回流90min，冷至室温，过滤，滤液减压浓缩至干，然后用50%甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，摇匀，经微孔滤膜过滤，即得；

(2)、高效液相色谱法测定

将步骤(1)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为4.6×250mm,5μm；

柱温：50℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.1%的甲酸-水溶液，梯度洗脱，洗脱程序同实施例2；

流速：1.2mL/min；

进样量：20μL；

检测波长：280nm。

采用上述方法检测消渴丸，得到色谱图，其他步骤同实施例2。

实施例9治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱建立方法的验证

1、仪器精密度试验

取批号为PO1310的消渴丸，按照实施例2中消渴丸供试样品的步骤(2)制备供试品溶液，连续进样6次，并采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，测定结果见表7和表8。

表7  PO1310消渴丸HPLC指纹图谱精密度考察结果（主要峰的相对保留时间）

注：“S”为参照峰。

表8  PO1310消渴丸HPLC指纹图谱精密度考察结果（主要峰的相对峰面积）

注：“S”为参照峰。

结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致（RSD＜3%），以第1次进样所得的指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》（国家药典委2010 2.0版）相似度评价***计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，见表9。

表9仪器精密度试验的相似度计算结果（n=6）

2、样品稳定性试验

取批号为PO1310的消渴丸，按实施例2中的步骤(2)制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h考察稳定性，并采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，共测6次，测定结果见表10、11。

表10  PO1310消渴丸HPLC指纹图谱稳定性考察结果（主要峰的相对保留时间）

注：“S”为参照峰。

表11  PO1310消渴丸HPLC指纹图谱稳定性考察结果（主要峰的相对峰面积）

注：“S”为参照峰。

结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致（RSD＜3%），以第1次进样所得的指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》（国家药典委2010 2.0版）相似度评价***计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，见表12。

表12样品稳定性试验的相似度计算结果

以上结果表明，供试品溶液在24h内测稳定。

3、方法重复性试验

取批号为PO1310的消渴丸，按照实施例2中的步骤(2)平行制备6份供试品溶液，采用实施例2中的步骤(3)的色谱条件进行测定，测定结果见表13、14。

表13  PO1310消渴丸HPLC指纹图谱重复性考察结果（主要峰的相对保留时间）

注：“S”为参照峰。

表14  PO1310消渴丸HPLC指纹图谱重复性考察结果（(主要峰的相对峰面积）

注：“S”为参照峰。

结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰的峰面积基本一致（RSD＜3%），以第1次进样所得的指纹图谱作为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》（国家药典委2010 2.0版）相似度评价***计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，测定结果见表15。

表15方法重复性试验的相似度计算结果（n=6）

以上方法学考察结果表明，用本方法建立消渴丸的HPLC指纹图谱，样品稳定性、仪器精密度、方法重复性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。

实施例10治疗糖尿病的中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱相似度的考察

1、20批消渴丸的测定和HPLC标准指纹图谱的获得

二十批消渴丸均由广州白云山中一药业有限公司生产，批号分别为NO1479、NO2020、PO2111、PO1310、NO1324、NO1431、NO2258、NO1554、PO1136、PO1242、PO1195、PY0003、MO0082、LO3597、PO1216、PO1246、PO2145、PO2013、PO1510、NY0011。

按照实施例2的步骤(2)制备供试品溶液，采用步骤(3)的色谱条件分别对20批消渴丸进行测定。

2、消渴丸HPLC指纹图谱相似度的考察

以实施例2中的消渴丸HPLC标准指纹图谱为参照，用《中药色谱指纹图谱相似度评价***2.0版》计算每批消渴丸HPLC指纹图谱的相似度。结果如表16所示。

表16二十批消渴丸HPLC指纹图谱相似度考察结果

由表16可以看出，20批消渴丸HPLC指纹图谱与消渴丸HPLC标准指纹图谱的相似度均大于0.90，表明所述消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法重复性好，相似度高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，所述消渴丸包括中药葛根、地黄、玉米须、天花粉、黄芪、南五味子、山药、化学药格列本脲，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、对照品溶液的制备

精密称取3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷元-8-C-芹糖(1→6)葡萄糖、大豆苷、大豆素、五味子酯甲、五味子甲素，分别加入甲醇溶解各稀释成浓度为0.01～0.1mg/mL的溶液，滤过，即得；

(2)、供试样品的制备

精确称取消渴丸细粉，加入85-95％乙醇，加热回流，冷至室温，过滤，浓缩，然后用40-60％甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，即得；

(3)、高效液相色谱法测定

将步骤(2)的供试样品进行高效液相色谱法测定，色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；

柱温：20-50℃；

流动相：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸体积百分比为0.01％-0.1％的甲酸-水溶液，梯度洗脱；

检测波长：235-280nm；

洗脱程序以如下体积浓度配置进行：

0分钟时，流动相A的体积百分比为2％、流动相B体积百分比为98％；

10分钟时，流动相A的体积百分比为5％、流动相B的体积百分比为95％；

20分钟时，流动相A的体积百分比为22％、流动相B的体积百分比为78％；

25分钟时，流动相A的体积百分比为25％、流动相B的体积百分比为75％；

35分钟时，流动相A的体积百分比为30％、流动相B的体积百分比为70％；

60分钟时，流动相A的体积百分比为50％、流动相B的体积百分比为50％；

65分钟时，流动相A的体积百分比为65％、流动相B的体积百分比为35％；

70分钟时，流动相A的体积百分比为95％、流动相B的体积百分比为5％；

80分钟时，流动相A的体积百分比为95％、流动相B的体积百分比为5％。

2.根据权利要求1所述的治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中的色谱条件还包括：

流速：0.8-1.2mL/min；

进样量：2-20μL。

3.根据权利要求2所述的治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述流速为1mL/min,所述进样量为10μL。

4.根据权利要求1所述的治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述色谱柱为Welch Materials XB-C₁₈柱，规格为4.6×260mm,5μm，或Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为4.6×250mm,5μm。

5.根据权利要求1所述的治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述柱温为30℃。

6.根据权利要求1所述的治疗糖尿病中药复方制剂消渴丸HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述流动相B为甲酸体积百分比为0.02％的甲酸-水溶液。