CN104151325A - 以罗丹明荧光团为母体的荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以罗丹明荧光团为母体的荧光探针及其制备方法。该荧光探针的结构式： 或 。本发明所涉及的荧光探针的制备方法，反应条件温和，合成步骤少简单，产物产率高，且原料价廉易得。本发明所涉及的荧光探针可应用于环境污染物及尿液中铜离子的检测，具有抗干扰能力强、响应时间短、选择性和灵敏度高等优点，检测限可低至nM级别。此外，本发明所涉及的荧光探针可应用于活细胞内Cu2+的荧光成像，在生命体中Cu2+的荧光检测，与Cu2+相关的疾病的早期诊断及致病机理研究上具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光分子探针及其制备方法，特别是一种以罗丹明荧光团为母体的荧光探针及其制备方法。
背景技术
铜元素是人体中必不可少的微量元素，在神经***、基因表达、蛋白质的构建等方面起着重要的作用。人体内缺铜容易造成缺铜性贫血、小儿发育不良、记忆力减退、反应迟钝、妇女***等，长时间缺铜还会造成动脉硬化，导致冠心病的发生。另一方面，过量的铜摄入也会产生毒性，这是由于铜催化产生了活泼的含氧物种能够造成其他生物分子等的氧化损伤。因此，细胞内铜的稳态平衡的失调将会导致其生长和代谢的紊乱，甚至引起严重的疾病和死亡。与铜相关的疾病包括Menkes 综合症、Wilson 症、阿尔茨海默病、ALS 病等。
相对于原子发射光谱法（AES）、原子吸收光谱法（AAS）、原子荧光光谱法（AFS）以及电化学方法等检测方法，荧光检测法具有灵敏度高、实时检测、对样品基本无损伤等优点，目前用于荧光检测的常见荧光团主要有罗丹明类荧光团、萘酰亚胺类荧光团、荧光素类荧光团等。其中，罗丹明及其衍生物由于具有较高的吸光系数、较强的荧光量子产率及光化学稳定性等良好的特点，已经被广泛应用于离子探针的设计。
目前已存在的有机分子探针主要还存在以下几个问题：I. 合成方面，探针分子的设计合成还存在结构复杂、步骤较繁琐、产率较低的不足。II. 荧光检测方面，部分有机分子探针存在检测灵敏度低、响应时间长、抗干扰能力低等问题。因此，设计合成新型的荧光探针分子，实现铜离子的痕量检测和细胞内荧光成像，将具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有有机探针分子存在的不足，提供一类以罗丹明荧光团为母体的荧光探针。
本发明的目的之二在于提供该荧光探针的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下反应机理：
；
或者
根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：
一种以罗丹明荧光团为母体的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式：
或 。
一种制备上述的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 将水杨醛与环氧氯丙烷按照2:1~5:1的摩尔比溶于水中，回流反应4 h，冷却后过滤得到产物，然后用重结晶的方法纯化得到1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇，其结构式为：；
b. 将罗丹明B或罗丹明6G与水合肼按照1:10~1:40的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，然后加热回流8 h，得到的产品利用硅胶柱层析分离得到罗丹明B酰肼或罗丹明6G酰肼，其结构式为：或；
c. 将上述步骤a所得的1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇与步骤b所得的罗丹明B酰肼按照1:3~1:10的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，加热回流24 h，旋转蒸发除去溶剂，利用硅胶柱层析分离得到罗丹明B衍生物探针分子。
上述的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针在待测物中铜离子的痕量检测中的应用。
上述的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针在实现活细胞内铜离子的荧光成像中的应用。
本发明的荧光探针用于待测物中铜离子的痕量检测，具有如下特征：1.选择性好，可实现单一铜离子检测，不存在共存离子影响；2. 灵敏度高，检测限低至纳摩尔级别；3. 响应时间快，反应瞬间完成，可实现实时检测；4.荧光及颜色变化肉眼可见。
根据本发明，该类荧光探针用于铜离子检测的待测物，包括但不限于环境污染物样本及人体尿液样本。
根据本发明，该类荧光探针铜离子荧光成像所选用的活细胞，包括但不限于Hela细胞。
本发明所提供的一类以罗丹明荧光团为母体的荧光探针的制备方法，反应条件温和，合成步骤少，产物产率高，原料价廉易得。本发明所提供的荧光探针对铜离子响应时间短、选择性和灵敏度高，检测限低至nM级别，并且可用肉眼来识别荧光及颜色的变化，是一种良好的检测铜离子的荧光探针。本发明所提供的荧光探针还可应用于活细胞内Cu2+的荧光成像和在生命体中Cu2+的荧光检测，在与Cu2+相关疾病的早期诊断及致病机理研究上具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是实施例2中选择性实验的紫外-可见吸收光谱。
图2是实施例2中滴定实验的荧光光谱。
图3是实施例3中罗丹明B衍生物探针分子的细胞荧光成像。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明。这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
实施例1：罗丹明B衍生物探针分子的制备
（1）将水杨醛与环氧氯丙烷按照2:1~5:1的摩尔比溶于水中，加热反应4 h，冷却后过滤得到产物，然后用重结晶的方法纯化得到1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇。
（2）将罗丹明B与水合肼按照1:10~1:40的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，然后加热回流8 h，得到的产品利用硅胶柱层析分离得到罗丹明B酰肼。
（3）将上述步骤（1）制备的1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇与上述步骤（2）制备的罗丹明B酰肼按照1:3~1:10的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，加热回流24 h，旋转蒸发除去溶剂，利用硅胶柱层析分离得到罗丹明B衍生物探针分子，然后采用核磁共振仪（Bruker AVANCE 500MHz 型核磁共振仪，Bruker 公司，瑞士）对制得的罗丹明B衍生物的纯品进行核磁共振分析，具体分析结果如下：
1H NMR：δ(氘代DMSO) 9.14（s，2H，N=C-H）， 7.90（m, 2H, ArH）， 7.57（m, 6H, ArH）， 7.29（m, 2H, ArH）， 6.99（t, 2H, ArH）， 6.29-6.50（m, 12H, ArH）， 4.30-4.54 (m, 5H, CH2CHCH2)， 3.35（s，1H，OH）, 3.23(q, 16H, NCH 2 CH3), 1.09(t,24H,NCH2 CH 3 ).
实施例2：罗丹明6G衍生物探针分子的制备
（1）将水杨醛与环氧氯丙烷按照2:1~5:1的摩尔比溶于水中，加热反应4 h，冷却后过滤得到产物，然后用重结晶的方法纯化得到1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇。
（2）将罗丹明6G与水合肼按照1:10~1:40的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，然后加热回流8 h，冷却过滤后将固体用去离子水反复洗涤得到罗丹明6G酰肼。
（3）将上述步骤（1）制备的1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇与上述步骤（2）制备的罗丹明6G酰肼按照1:3~1:10的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，加热回流24 h，旋转蒸发除去溶剂，利用硅胶柱层析分离得到罗丹明6G衍生物探针分子，然后采用核磁共振仪（Bruker AVANCE 500MHz 型核磁共振仪，Bruker 公司，瑞士）进行核磁共振分析，具体分析结果如下：
1H NMR：δ(氘代DMSO): 9.20（s，2H，N=C-H），7.94（m, 2H, ArH）， 7.60（m, 6H, ArH）， 7.30（m, 2H, ArH）， 6.97（t, 2H, ArH）， 6.27-6.51（m, 12H, ArH）， 4.33-4.56 (m, 5H, CH2CHCH2)， 3.32（s，1H，OH）, 3.20(q, 8H, NHCH 2 CH3), 1,87(s,12H,ArCH3)，1.12(t,12H,NHCH2 CH 3 ).
实施例3：以罗丹明B 衍生物作为荧光探针分子对铜离子进行检测
（1）称取实施例1中制备的罗丹明B衍生物探针分子，配成1×10-5 M的乙醇溶液。
（2）配制各种金属离子的浓溶液（0.1M），包括干扰离子如Na+，K+，Mg2+， Ca2+，Ba2+，Zn2+，Li+，Mn2+，Co2+，Hg2+等，及待检测离子Cu2+。
（3）选择性实验中，分别取一定当量的各种金属离子加入到2.0 mL的罗丹明B衍生物溶液中，然后进行吸收光谱及荧光光谱测试。 结果见附图2。
（4）滴定实验中，用移液管吸取2.0 mL罗丹明B衍生物置于1.0 cm×1.0 cm石英比色皿中，用微量进样器依次向溶液中加入Cu2+溶液，每加入一次进行一次光谱测试。结果见附图3。
（5）竞争实验中，先将某种干扰离子加入到2.0 mL罗丹明B衍生物溶液中，再加入Cu2+，然后进行光谱测试。
实施例4：罗丹明B 衍生物应用于细胞成像
（1）对照组，配1×10-5 M的罗丹明B衍生物探针分子的RPMI. 1640溶液培养液；
（2）将Hela 细胞在上述培养液中培养0.5小时；
（3）实验组，首先，用10 μM的Cu2+溶液培养Hela 细胞0.5小时，然后，再用10 μM的探针培养液培养0.5小时；
（4）用PBS缓冲液冲洗细胞3次，将没有被细胞吸收的培养液洗去；
（5）将培养后的细胞在共聚焦显微镜上进行成像，用543 nm的激光激发，观察细胞荧光成像，结果如图4。
图1为实施例3中用罗丹明B衍生物进行紫外-可见光谱的选择性滴定实验，从图中可以清楚地看出本发明中合成的罗丹明B衍生物探针分子对于Cu2+具有很好的选择性。
图2为实施例3中罗丹明B衍生物的荧光滴定光谱，从图中可以看出随着Cu2+的不断增加，罗丹明B衍生物溶液的荧光强度也随之线性增加。
图3为实施例4中罗丹明B 衍生物应用于细胞成像的结果。从图中可以看出，由本发明合成的罗丹明B衍生物探针分子可以成功的应用于细胞层次来检测细胞内的Cu2+。当用罗丹明B衍生物探针分子培养预先用铜离子培养过的细胞后，通过荧光共聚焦显微镜可以观察到细胞发出明显的荧光，从而可以看出本发明合成的探针分子可以成功的检测细胞内的铜离子，这对于今后研究生命体中与Cu2+相关疾病的早期诊断及致病机理具有重要的意义。
如上所述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，采用与其相同或相似方法所得到的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针用于细胞内铜离子荧光成像，均在本发明保护范围内。
Claims (4)
1.一种以罗丹明荧光团为母体的荧光探针，其特征在于该荧光探针的结构式：
或 。
2. 一种制备根据权利要求1所述的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 将水杨醛与环氧氯丙烷按照2:1~5:1的摩尔比溶于水中，回流反应4 h，冷却后过滤得到产物，然后用重结晶的方法纯化得到1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇，其结构式为：；
b. 将罗丹明B或罗丹明6G与水合肼按照1:10~1:40的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，然后加热回流8 h，得到的产品利用硅胶柱层析分离得到罗丹明B酰肼或罗丹明6G酰肼，其结构式为：或；
c. 将上述步骤a所得的1,3-二（2-甲醛基苯氧基）-2-丙醇与步骤b所得的罗丹明B酰肼按照1:3~1:10的摩尔比混合均匀，并溶于乙醇中，加热回流24 h，旋转蒸发除去溶剂，利用硅胶柱层析分离得到罗丹明B衍生物探针分子。
3.一种根据权利要求1所述的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针在待测物中铜离子的痕量检测中的应用。
4.一种根据权利要求1中所述的以罗丹明荧光团为母体的荧光探针在实现活细胞内铜离子的荧光成像中的应用。
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