CN105385439B - 检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针，其特征在于，其结构式为：

Description

检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针及其制备与应用
技术领域
本发明属于荧光探针材料及其制备领域，特别涉及一种检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
汞是典型的有毒的过渡金属离子，可造成生物神经***的永久性损伤。由于汞高的毒性而被广泛的关注，汞的产生主要来源于自然的和人为的原因，如海洋和火山的喷发，生活垃圾的焚烧和采矿，特别是节能荧光灯的使用造成汞污染的进一步加剧，尤其是环境中的汞在空气中被氧化成水溶性的二价汞离子，随着水流进入江河湖海中，经过水底微生物而变成甲基汞，存在于各种藻类中间，通过食物链在生物组织里高度富集，对自然界和人类具有较大的危害。
汞原子与生物体有很强的结合性(通常含有N，S，O元素)的能力，与生物分子形成配合物，能够引起酶的巯基、蛋白质结块等，破坏生物体分子结构。同时汞也是一种不可生物降解的重金属元素，汞元素及其化合物通过皮肤呼吸及食物链沉积在肝脏、大脑和其他器官中，在人体中无法正常代谢排出，产生慢性中毒，损害肠道、肾及神经***，引起各种疾病。1953年在日本熊本县水俣镇发生的“水俣病”即是典型的汞公害病。重金属污染已成为目前环境污染检测中的重大污染源之一，因此发展可在水溶液环境中检测汞离子的快速、简单、灵敏的检测方法，对水体环境中重金属的检测具有重要意义。
目检测汞元素主要的方法：原子吸收光谱法、中子活化分析法、原子发射光谱法、X射线荧光光谱法、溶出伏安法、双硫腙比色法、涂层压电传感器发和等离子体感应光谱法等。由于上述方法的劣势(专业性强，步骤复杂，耗时，仪器贵重)，荧光化学传感器离子检测拥有众多的优点，它有望取代传统的方法，如测试速度快，设备简单，“裸眼”可视检测，价格低廉，分子结构易于修饰优化，灵敏度高等优点。近年来有许多关于小分子荧光探针法检测汞离子的报道(Sensors and Actuators B：Chemical，2015，210，519-532)，但是由于重金属离子固有的荧光猝灭性质，使得发展高灵敏度的荧光探针具有一定的挑战性。另外用于水体环境的荧光探针，不仅要保证水溶性良好，尤其应用于生物环境的荧光探针，不仅水溶性好，而且还要求在正常的生理环境条件下能够工作，有利于可见光激发而防止紫外光对细胞造成的损失。罗丹明B类荧光染料是一种很好的生物荧光物质，具有良好的光物理性质，其吸收和发射都在长波处(＞550nm)，荧光量子产率高，摩尔消光系数大，背景干扰小等优点，因此在发展荧光探针方面具有重要应用前景。
中国专利201410058568.9“一种检测汞离子的反应型罗丹明荧光探针及其制备方法”，以罗丹明B和水合肼为原料合成罗丹明酰胺，然后和乙醛酸反应得到水溶性良好的产物，对汞离子具有高度的选择性，其它常用离子都无明显的干扰，可在pH＝5-10的环境中应用于生物荧光成像和水样的检测；中国专利201310163699.9“汞离子荧光传感器及其合成方法和应用”，以罗丹明B和水合肼为原料反应生成罗丹明·酰胺，然后加入异氰酸酯反应合成汞离子的荧光荧光传感器；中国专利201410029789.3“一种用于检测水环境中金属离子含量的有机化合物及其应用”，以N-[2-(N’N’-二(烷基巯乙基)氨基苯氧乙基]-N-烷基巯乙基-2-烷氧基苯胺作为离子络合体，适用于各种环境中金属离子浓度的连续检测，尤其对汞离子的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测汞离子的荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针对汞离子有很好的选择性，在环境检测方面具有较好的使用效果。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针，其特征在于，其结构式为：
上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法包括：
步骤1：将2-溴甲基吡啶氢溴酸盐和叠氮化钠溶于溶剂中，搅拌反应3-4h，萃取，洗涤，干燥，旋蒸，即得产物4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛；
步骤2：将对羟基苯甲醛和溴丙炔以及催化剂溶于溶剂中，加热回流3-4h，冷却，萃取，干燥，旋蒸，真空干燥，即得2-叠氮甲基吡啶；
步骤3：将4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛和2-叠氮甲基吡啶，在氮气的保护下，溶于混合溶剂中，加入催化剂，搅拌反应20-24h，萃取，干燥，旋蒸，进行柱层析，即得产物R；
步骤4：将罗丹明B溶于溶剂中，加入水合肼，加热回流1-3h，冷却到室温，旋蒸，加入盐酸，调节pH，过滤，烘干，即得罗丹明酰胺；
步骤5：将产物R和罗丹明酰胺溶于溶剂中，加入乙酸，加热回流反应5-6h，反应结束后，旋蒸，即得检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针(RHPT)。
优选地，所述的步骤1-4中的溶剂分别为N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、叔丁醇和水的混合物、乙醇，步骤5中的溶剂为乙醇。
优选地，所述的步骤1中的2-溴甲基吡啶氢溴酸盐和叠氮化钠的摩尔比为1∶2.5～3。
优选地，所述的步骤1中的萃取为：在反应体系中加入水，用二氯甲烷萃取，步骤1中的溶剂、水和二氯甲烷的体积比为1∶0.2～0.5∶5～10。
优选地，所述的步骤2中催化剂为碳酸钾，对羟基苯甲醛、溴丙炔以及催化剂的摩尔比为1∶0.4～0.45∶0.4～0.45。
优选地，所述的步骤2中的萃取为：在反应体系中加入水，用二氯甲烷萃取，步骤2中的溶剂、水和二氯甲烷的体积比为1∶0.2～0.3∶0.5～1。
优选地，所述的步骤3中的催化剂为CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠，所述的4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛、2-叠氮甲基吡啶、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠的摩尔比为1∶0.5～1∶0.5～0.8∶0.8～1。
优选地，所述的罗丹明B、水合肼和盐酸的摩尔比为1∶0.02～0.05∶0.03～0.05。
优选地，所述的步骤4中的调节pH为使用氢氧化钠调节pH＝9.0-10.0。
优选地，所述的步骤5中产物R、罗丹明酰胺和乙酸的摩尔比为1∶0.8～1∶0.02～0.03。
本发明还提供了上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的应用方法，其特征在于，包括：将不同浓度的汞离子的水溶液分别加入含有上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的pH＝4.0-12.0的H3PO4/H2PO4 -的缓冲体系中，测定荧光强度，激发波长为560nm，发射波长为577-580nm，以汞离子的浓度为横坐标，荧光强度的变化为纵坐标作图，得到线性工作曲线；将含有汞离子的污水加入含有上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的pH＝4.0-12.0的H3PO4/H2PO4 -的缓冲体系中，通过测定污水中的汞离子的荧光强度即可得到溶液中汞离子的含量。
优选地，所述的H3PO4/H2PO4 -的缓冲体系的pH＝7.0。
本发明含有罗丹明B基的酰胺基团，中间含有碳氮双键和***吡啶的引入，其中的一些基团对汞离子具有识别作用。其机理在于：由于C＝N双键的异构化，加入离子后，分子的刚性改变和共轭性改变对于汞在荧光增强的同时颜色红移，颜色改变有利于提高探针的灵敏性。其制备路线如图7所示。本发明所述的新型荧光探针RHPT自身荧光很弱，在汞离子的条件下，经过560nm可见光激发，580nm处的荧光信号显著增强，通过记录荧光强度即可检测汞离子的浓度。荧光探针RHPT在pH＝7.0的缓冲溶液中对汞离子可进行高选择性检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的荧光探针对汞离子有很好的选择性和灵敏度，在环境检测方面具有较好的使用效果。
(2)本发明虽然合成步骤比较多，但反应条件比较简单，设备要求简单易于操作，合成的荧光探针对汞离子具有较好的选择性和灵敏度。在溶液中加入汞离子前后颜色区别大，可进行现场实时定性及半定量的目视比色法检测。
附图说明
图1为荧光探针加入汞离子前后的紫外变化图谱；在图1中，横坐标为紫外吸收波长(nm)，纵坐标为吸光度。
图2a和2b分别为荧光探针加入汞离子前后的荧光变化图谱；在图2中，横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图3为(浓度为10μM)在乙腈溶液中对汞离子的荧光光谱响应图。在图3中，横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度；图中插图为Hg2+浓度增加与荧光强度的趋势图(激发波长在560nm)。
图4为(浓度为10μM)在乙腈溶液中对不同的金属离子(Cu、Co、Mn、Mg、Fe、Ba、Ca、K、Na、Ni、Pb、Cd)选择干扰性检测的荧光响应图；在图4中，横坐标为不同的金属离子，纵坐标为荧光强度。
图5为(浓度为50μM)与汞离子络合比的Job-Plot曲线；横坐标为c[Hg2+]/c[Hg2++探针]，纵坐标为荧光F-F0，其中F、F0是在560nm的荧光发射强度。
图6为(浓度为50μM)的探针溶液使用磷酸二氢盐/磷酸盐缓冲溶液配置了一系列不同pH的缓冲溶液，然后向探针溶液中加入一定量的汞离子，检测荧光强度横坐标为荧光发射波长(nm)，纵坐标为荧光强度。
图7为本发明的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备路线图。
图8为实施例2得到的线性工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例中所用的2-溴甲基吡啶氢溴酸盐的纯度为95～99％。叠氮化钠的纯度为95～99％。溶剂N，N-二甲基甲酰胺的纯度为95～98％。萃取剂二氯甲烷的纯度为95～98％。干燥剂无水硫酸镁的纯度为95～99％。对羟基苯甲醛的纯度为95～99％。2-叠氮甲基吡啶的纯度为95～99％。萃取剂二氯甲烷的纯度为95～98％。催化剂碳酸钾的纯度为95～99％。溶剂丙酮的纯度为95～98％。干燥剂无水硫酸镁的纯度为95～99％。叔丁醇的纯度为95～98％。萃取剂乙酸乙酯纯度为95～98％。催化剂五水硫酸铜的纯度为95～99％。催化剂抗坏血酸钠的纯度为95～99％。干燥剂无水碳酸氢钠的纯度为95～99％。罗丹明B的纯度为95～99％。水合肼的纯度为95～98％。溶剂乙醇的纯度为95～98％。氢氧化钠的纯度为95～99％。溶剂乙醇的纯度为95～98％，溶剂乙酸的纯度为95～98％。以上百分数为质量百分数。
实施例1
一种检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针，其结构式为：
上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法为：
(1)中间体1的合成：
在50mL三颈瓶中将0.50g(1.9mmol)的2-溴甲基吡啶氢溴酸盐和0.39g(5.9mmol)的叠氮化钠溶于10mL的DMF溶剂中，室温下搅拌反应4h，反应结束后，加入5.0mL的水后，再用50.0mL的CH2Cl2萃取，上层为黄色澄清溶液，下层为淡粉红色混浊状液体，下层为有机层，收集并合并有机层，用大量水洗(洗去过量的NaN3)，用无水MgSO4干燥半小时，有机溶剂用旋转蒸发仪蒸去，得到黄色的油状物(4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛)。产率：60-80％。1H NMR(300MHz，CDCl3)：8.61(d，J＝4.2Hz，1H)，7.73(td，J＝1.8，7.8Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.26(m，1H)，4.50(s，2H)。
(2)中间体2的合成：
在500mL三颈瓶中将0.30g(0.25mol)对羟基苯甲醛和7.7mL(0.98mol)溴丙炔以及14.00g(0.98mol)的K2CO3做催化剂溶于150mL的丙酮溶剂中，80℃下加热回流(用TCL点板跟踪)大约需要4h。冷却到室温，加入37.0mL水后，用100.0mL CH2Cl2萃取，合并有机层，用无水MgSO4干燥半小时，用旋转蒸发仪蒸去溶剂，放入20℃真空干燥箱内烘干至恒重，得到淡黄色产物(2-叠氮甲基吡啶)。mp：85-86℃，产率96％。FTIR(KBr)：v＝3210cm-1(C≡CH)，2122cm-1(C≡C)，1668cm-1(C＝O)，1603cm-1，1577cm-1，1508cm-1，1453cm-1(C＝C)，3070cm-1(Ar-H)，2836cm-1(CH)，1250cm-1(C-O).1HNMR(400MHz，CDCl3)：9.87(s，1H，-CHO)，7.70(d，J＝8.8Hz，2H，Ar-H)，6.96(d，J＝9.0Hz，2H，Ar-H)，4.68(s，2H，O-CH2)，2.51(s，1H，C≡CH)。
(3)中间体3的合成：
在250mL三颈瓶中加入0.32g(2.0mmol)的4-(2炔基丙氧基)苯甲醛和0.26g(2.0mmol)的2-叠氮甲基吡啶，在N2的保护下，溶于体积比为1∶1的叔丁醇和水的混合溶液30.0mL中，加入5mol％的CuSO4·5H2O和10mol％的抗坏血酸钠作为催化剂，在室温下搅拌反应24h。应后得到黄色的产物，用30.0mL乙酸乙酯进行萃取，合并有机层，用无水Na2SO4干燥半小时，旋干得到棕色的油状物。在进行柱层析得到白色固体(产物R)。产率70％。mp：106-107℃。FTIR：v＝3139cm-1(C＝CH)，3075cm-1(Ar-H)，2847cm-1，2864cm-1(C-H)，1681cm-1(C＝O)，1603cm-1，1577cm-1，1508cm-1，1476cm-1(C＝C)，1577cm-1，1422cm-1(Py-H)，1392cm-1(C-H的面内弯曲)，1254cm-1(C-O)，870cm-1，835cm-1(Ar中C＝H的倍频峰)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：9.88(s，1H，-CHO)，8.55(d，J＝3.2Hz，1H)，8.3(s，1H)，7.90(d，J＝6.0Hz，2H)，7.26(d，J＝8.6Hz，2H)，7.84(t，J＝8.60Hz，1H)，7.37(t，J＝5.8Hz，1H)，7.32(d，J＝8.0Hz，1H)，5.76(s，2H)，5.30(s，2H)。
(4)中间体4的合成：
在250mL三颈瓶中，称取1.2g的罗丹明B，溶于30mL乙醇中，在室温下逐滴加入3.0mL质量浓度为85％的水合肼溶液，滴加完了后，80℃加热回流2h，溶液从紫色慢慢变为黄色澄清溶液，反应结束后，冷却到室温，溶剂旋干后加入1M HCl 50.0mL，在慢慢滴加1MNaOH大约70.0mL，pH约为9.0-10.0，溶液由红色变为粉红色，沉淀减压过滤并用15.0mL的水洗三次，得到产物烘干，得到粉红色粉末(罗丹明酰胺)。产率：90％。mp：171-172℃。FTIR：v＝3424cm-1(-OH)，3415cm-1(-NH2)2969cm-1，2928cm-1(C-H)，1696cm-1(C＝O，1615cm-1，1547cm-1，1514cm-1，1374cm-1(C＝C)，1357cm-1(CH的面内弯曲振动)，1219cm-1，1118cm-1(C-C)，819cm-1，787cm-1，699cm-1(苯环上CH伸缩振动的倍频峰)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：1.16(t，12H，NCH2CH3)，3.34(q，8H，NCH2CH3)，3.61(bs，2H，NH2)，6.29(dd，2H，xanthene-H)，6.42(d，2H，xanthene-H)，6.48(d，2H，xanthene-H)，7.11(m，1H，Ar-H)，7.45(m，2H，Ar-H)，7.94(m，1H，Ar-H)。
(5)荧光探针的制备
在250mL三颈瓶中，称取0.15g(0.50mmol)的BPT(产物R)加入10.0mL乙醇加热溶解，再称取0.23g(0.50mmol)罗丹明酰胺(RHD)，把其溶于5.0mL乙醇(呈淡粉色)，慢慢滴加到三颈瓶中，加入3～4滴乙酸，加热至80℃，回流反应5-6h，用TCL点板跟踪，反应结束后，用旋转蒸发仪蒸干，得到***的固体(检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针)。产率：89％。Mp：199-200℃。FTIR：v＝2970cm-1(C-H)，1716cm-1(C＝O)，1613cm-1，1547cm-1，1514cm-1，1466cm-1(C＝C)，1264cm-1(C-O)，1235cm-1，1219cm-1(C-C)1118cm-1，1005cm-1，758cm-1(苯环上H的CH伸缩振动的倍频峰)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：1.20(t，12H，NCH2CH3)，3.75(q，8H，NCH2CH3)，5.20(s，2H，OCH2)，5.76(s2H，CH2)，5.65(s，1H)，5.71(s，1H)，6.88(s，1H，CH＝N)，6.90(s，1H，Ar-H)，7.12(s，1H，triazole-H)，7.15(s，2H，xanthene-H)，7.19(d，2H，xanthene-H)，7.28(d，1H，Pyridine-H)，7.45(d，2H，Ar-H)，7.50(t，1H，Ar-H)，7.69(t，1H，Ar-H)，7.77(d，2H，xanthene-H)，7.87(t，1H，Pyridine-H)，8.01(d，1H，Ar-H)，8.60(d，1H，xanthene-H)，8.63(d，1H，Pyridine-H)。
配制探针溶液浓度为10μM，以及探针浓度和离子浓度分别为10μM和100μM的溶液，在紫外吸收光谱下检测，结果如图1所示。
配制探针溶液浓度为10μM，以及探针浓度和离子浓度分别为10μM的溶液，激发峰为560nm处激发，测得激发峰和发射峰，结果如图2a和2b所示。
固定探针溶液的浓度为10μM，再加入不同的汞离子浓度，汞离子分别从0到1000μM，分别检测其荧光强度，结构如图3所示。
配制探针溶液浓度为10μM，各种离子的浓度也为10μM。分别用荧光检测探针加入不同离子的荧光强度，以及荧光探针加入汞离子后再加入不同离子总溶液的荧光强度，结果如图4所示。
固定RHPT和Sn2+的浓度和为50μM。然后分别让RHPT和Sn2+的浓度比按照0∶10；1∶9；2∶8；3∶7；4∶6；5∶5；6∶4；7∶3；8∶2；9∶1；10∶0.分别在同一狭缝下，检测其荧光强度。然后配制溶液的一系列的浓度分别为0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50μM的溶液用荧光检测其荧光强度，进行数据处理，结果如图5所示。
将所得的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针溶于乙腈溶剂中配成10μM的探针溶液，加入磷酸二氢盐/磷酸盐缓冲溶液配置了一系列不同(pH＝1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)pH的缓冲溶液，然后向探针溶液中加入1.0x10-4M的汞离子，检测不同pH条件下探针溶液荧光强度的变化(图6)。发现在pH＝1.0-3.0的时候荧光强度明显下降，pH＝4.0-12.0荧光强度变化不明显，探针溶液比较稳定，因此该荧光探针在乙腈溶剂中pH＝1.0-3.0以下受到酸性条件影响比较大，在pH＝4.0-12.0下探针溶液稳定有利于检测。
实施例2
应用实施例1中的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针检测污水中汞离子的含量的具体步骤为：
将1.0mL浓度为1.5x10-4M、3.0x10-4M、6.0x10-4M的汞离子的水溶液分别加入1.0mL含有重量浓度为1.0x10-5M的上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的pH＝7.0的H3PO4/H2PO4 -的缓冲体系中，测定荧光强度，激发波长为560nm，发射波长为580nm，以汞离子的浓度为横坐标，荧光强度的变化为纵坐标作图，得到线性工作曲线图8所示；
将1.0mL含有汞离子的污水加入1.0mL含有重量浓度为1.0x10-5M的上述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的pH＝7.0的H3PO4/H2PO4 -的缓冲体系中，通过测定污水中的汞离子的荧光强度即可得到溶液中汞离子的含量为1.0x10-6M。

Claims (8)

1.一种检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的结构式为：
，
其特征在于，所述的制备方法包括：
步骤1：将2-溴甲基吡啶氢溴酸盐和叠氮化钠溶于溶剂中，搅拌反应3-4 h，萃取，洗涤，干燥，旋蒸，即得产物2-叠氮甲基吡啶；
步骤2：将对羟基苯甲醛和溴丙炔以及催化剂溶于溶剂中，加热回流3-4 h，冷却，萃取，干燥，旋蒸，真空干燥，即得4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛；
步骤3：将4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛和2-叠氮甲基吡啶，在氮气的保护下，溶于混合溶剂中，加入催化剂，搅拌反应20-24h，萃取，干燥，旋蒸，进行柱层析，即得产物R；
步骤4：将罗丹明B溶于溶剂中，加入水合肼，加热回流1-3h，冷却到室温，旋蒸，加入盐酸，调节pH，过滤，烘干，即得罗丹明酰胺；
步骤5：将产物R和罗丹明酰胺溶于溶剂中，加入乙酸，加热回流反应5-6 h，反应结束后，旋蒸，即得检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针。
2.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的2-溴甲基吡啶氢溴酸盐和叠氮化钠的摩尔比为1：2.5～3。
3.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中催化剂为碳酸钾，对羟基苯甲醛、溴丙炔以及催化剂的摩尔比为1：0.4～0.45：0.4～0.45。
4.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的萃取为：在反应体系中加入水，用二氯甲烷萃取，步骤2中的溶剂、水和二氯甲烷的体积比为1：0.2～0.3：0.5～1。
5.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中的催化剂为CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠，所述的4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛、2-叠氮甲基吡啶、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠的摩尔比为1：0.5～1：0.5～0.8：0.8～1。
6.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的罗丹明B、水合肼和盐酸的摩尔比为1：0.02～0.05：0.03~0.05。
7.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤4中的调节pH为使用氢氧化钠调节pH=9.0-10.0。
8.如权利要求1所述的检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤5中产物R、罗丹明酰胺和乙酸的摩尔比为1：0.8～1：0.02～0.03。
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