CN104144692A - 致密壳聚糖膜材料的组合物、制备及用途 - Google Patents

Abstract

本发明描述了特别致密的壳聚糖的组合物及用于制备所述致密壳聚糖结构的新方法。所述新制备方法对中和的壳聚糖聚合物同时采用了压缩和真空，从而产生特别致密的壳聚糖薄膜或膜材料。所述致密的壳聚糖薄膜或膜组合物具有多种物理和临床上值得关注的品质，适用于在动物、哺乳动物或人体上或其体内的多种医学应用。

Description

致密壳聚糖膜材料的组合物、制备及用途

公开领域

本发明涉及致密的壳聚糖薄膜或膜材料及其制备方法。这些材料可用于医学工业、科技工业及其它工业中。

背景

功能性生物材料研究已经集中在开发用于创伤愈合和组织工程的改进的支架。已经对许多生物可降解聚合物作为支架用于创伤愈合和组织工程应用进行了研究，并且包括合成聚合物，如聚己内酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乙二醇)；及天然聚合物，如藻酸盐、明胶、胶原蛋白、淀粉及壳聚糖。其中，天然来源的聚合物特别值得关注，因为作为生物结构的天然组分，其在生物和化学上类似于天然组织。在这一情形中，已经发现壳聚糖可作为诸多应用中的引人注目的候选物，并且除抗细菌、抗真菌及止血特性外，还具有独特的生物特性，包括生物相容性、对于有害糖产物的生物降解性、无毒、生理学惰性、对于蛋白质的显著亲和力。

有记录的壳聚糖应用应回溯到19世纪，Rouget在1859年论述壳聚糖的脱乙酰基形式时。几丁质(壳聚糖的原材料)是含量最丰富的有机材料之一，每年通过生物合成产生的量仅次于纤维素。它是动物，尤其是甲壳动物、软体动物及昆虫的外骨骼的一种重要成分。它还是某些真菌细胞壁中的主要原纤维聚合物，并且可以由微藻产生。脱乙酰基化的几丁质衍生物被称为“壳聚糖”。当这两个术语首次在19世纪(1800’s)使用时，据信几丁质和壳聚糖实际上常常是作为截然不同、充分确定的独特并且无变化的化学物质存在，其中几丁质是完全乙酰基化的并且壳聚糖是完全脱乙酰基化的组合物。然而，约一个世纪之后，发现术语“几丁质”和“壳聚糖”事实上是不明确的。这些术语实际上是指展现明显不同的物理和化学特性的化合物的家族，而非指充分确定的化合物。这些差异归因于这些产品的不同分子量和不同乙酰基化程度。

壳聚糖是线性多糖，由通过β(1-4)糖苷键连接的葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺单元构成，大体上呈糖单元线形式。取决于来源和制备程序，其分子量一般在10kDa到超过1000kDa范围内。壳聚糖聚合物的分子量通常是由粘度确定并且以厘泊(Centipoise，CPS)或毫帕(mPas)为单位表示，并且可以在约5mPas到3000mPas范围内。葡糖胺的含量被视为脱乙酰基化的程度(degree of deacetylation，DD)并且可以在30％到95％范围内。呈结晶形式的壳聚糖通常不可溶于超过pH7的水溶液中，然而，在稀酸(pH<6.0)中，葡糖胺上的质子化游离氨基促进该分子的溶解(Kim,Seo等,2008)。一般来说，壳聚糖具有三种类型的反应性官能团，分别是在C(2)、C(3)及C(6)位置处的氨基以及伯羟基和仲羟基。这些基团允许对壳聚糖进行修饰以用于特定应用，其可以制备适用于组织工程应用的各种支架。壳聚糖的化学性质又为共价和离子修饰提供许多可能，从而允许广泛调整机械和生物特性。

几丁质加工

如以上所提到的，几丁质存在于众多分类组内。然而，市售的几丁质通常是从海洋甲壳动物(如褐虾(shrimp))分离的。甲壳动物的壳由30-40％蛋白质、30-50％碳酸钙及20-30％几丁质组成，并且还含有脂质性质的颜料，如类胡萝卜素(虾青素、虾黄素(astathin)、角黄素、叶黄素及β-胡萝卜素)。这些组分的比例随物种和季节而变化。

当通过酸处理溶解碳酸钙，随后碱提取使蛋白质变性并溶解，并且随后进行脱色步骤来提取几丁质时，通过去除虾青素主要获得无色到灰白色产物。该制备方法是影响样品特征的一个因素。早期的研究已经清楚地证实，这些产物的具体特征(Mw、DD)取决于工艺条件。然而，市售的几丁质典型地通过第一步骤的脱蛋白质随后第二步骤的脱矿质来制备。在这些条件下，提取到“崩解的几丁质”，其中几丁质失去了天然结构。另一方面，当在第一步骤中发生脱矿质时，提取到“压缩的几丁质”，其中天然链和纤维状结构是完整并且稳定的。由任一壳聚糖提取方法制备的壳聚糖都适用于本发明。另外，本发明不限制来自天然、半合成或合成来源的壳聚糖来源。

几丁质脱乙酰基化成为壳聚糖

壳聚糖是通过水解几丁质的乙酰胺基来制备。由于糖环中C2-C3取代基的反式布置赋予的这些基团的抗性，这通常是通过苛性碱水解处理来进行的(Horton和Lineback1965)。通常需要在强碱水溶液中对几丁质进行热处理来得到部分脱乙酰基化的几丁质(DD超过70％)，称为壳聚糖。通常，在高温(100℃)下使用浓度为30-50％(w/v)的氢氧化钠或氢氧化钾。这种苛性氢氧化物/热方法同时具有减少或去除潜在的细菌内毒素的作用，这对于所得壳聚糖材料的生物医学医用的是有益的。

取决于几丁质的来源和壳聚糖的制备方法，壳聚糖DD可以在56％-99％范围内(Abou-Shoer2010)。影响脱乙酰基化程度的因素包括碱浓度、先前处理、几丁质的粒度及密度。实际上，在单次碱处理中可以实现的最大DD为约75-85％(Roberts1998)。一般来说，在脱乙酰基化期间，条件必须是适于在合理时间内使几丁质脱乙酰基化而得到壳聚糖的条件，该壳聚糖(随后)可溶于稀乙酸中。很明显，有关壳聚糖精细结构的首要因素是DD值的化学多分散性(Roberts1998)。在壳聚糖脱乙酰基化期间，发生聚合物链的降解。具有低DD值(75-85％)的壳聚糖支架呈现较规则的结构，并且孔隙相当均匀并与多边形横截面平行(Tigli和Gumusderelioglu2008)。对于具有高脱乙酰基化程度(>85％)的支架，侧向孔隙连通性低得多。还进行了膨胀研究，但未发现DD与膨胀比之间的关系。针对壳聚糖支架的机械测试显示，在较高DD下，机械强度较高。支架的生物可降解性也取决于DD。

壳聚糖的解聚

在某些应用中使用壳聚糖的主要局限是其高粘度和在中性pH下的低溶解度。低Mw壳聚糖和低聚物可以通过水解聚合物链来制备。对于某些特定应用，已经发现这些较小的分子更有用。壳聚糖解聚可以化学方式、酶促方式或物理方式进行。化学解聚主要是通过使用HCl进行的酸水解或通过使用HNO₂和H₂O₂进行的氧化反应来执行。已经发现，就HNO₂攻击脱乙酰基化葡糖胺单元的氨基，随后使相邻糖苷键裂解来说，该方法是特异性的(Prashanth和Tharanathan2007)。在酶促解聚的情况下，通过如几丁质酶、壳聚糖酶、葡糖酶及一些蛋白酶等若干种酶来制备具有高水溶性的低分子量壳聚糖。已知能够使壳聚糖解聚的多种非特异性酶，包括溶菌酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶及果胶酶。以此方式，允许在温和条件下进行区位选择性解聚(Aranaz,Mengibar等,2009)。

壳聚糖的Mw与其膨胀行为之间不存在相关性(Roldo,Hornof等,2004；El-Kamel,Ashri等,2007)。拉伸强度(tensile strength，TS)、断裂伸长率百分比(EB％)及弹性模量(elastic modulus，EM)是指示薄膜的强度和弹性的重要参数。已经建立了用于评价薄膜或膜的物理参数的ASTM国际标准测试方法(ASTM2002；ASTM2006)。中等Mw的壳聚糖薄膜具有最高的TS和EM值，随后是高Mw和低Mw的壳聚糖薄膜(El-Kamel,Ashri等,2007)。另一方面，低Mw的壳聚糖薄膜获得最高的EB％，随后是高Mw和中等Mw的壳聚糖薄膜。

孔隙变化的影响

基于壳聚糖的支架的机械特性取决于孔隙大小和孔隙取向。通过将壳聚糖溶液冷冻并冻干，或通过如“内部鼓泡法(internal bubblingprocess，IBP)”等方法可以形成呈互连多孔结构的壳聚糖，在IBP方法中，将CaCO₃添加到壳聚糖溶液中，通过使用适合模具产生特定形状的壳聚糖-CaCO₃凝胶(Chow和Khor2000)。针对水合样品的拉伸测试显示，与无孔壳聚糖膜(5-7MPa)相比较，多孔壳聚糖膜具有大幅减小的弹性模量(0.1-0.5MPa，其中兆帕单位＝N/mm²)。多孔膜的可伸长性(最大应变)随孔隙大小和孔隙取向而在类似于无孔壳聚糖的值(约30％)到超过100％之间变化。多孔膜展现出复合材料所特有的应力-应变曲线，具有两个截然不同区域：在低应变下的低模量区和在高应变下转变到高2-3倍的模量。据报道，这些多孔结构的拉伸强度在30-60kPa范围内(Madihally和Matthew1999)。

Chen和Hwa报道了所用壳聚糖的分子量和其结晶度对于壳聚糖膜机械特性的影响(Chen和Hwa1996)。也就是说，由于可能存在缠结差异，所用壳聚糖的分子量越低，则所制备的壳聚糖膜的拉伸强度越低。换句话说，使用较低分子量的壳聚糖产生较少缠结。壳聚糖的结晶度差异可能归因于另一因素。所用壳聚糖的分子量越低，则所得膜的焓越小。这些表明，该膜的较低拉伸强度是由低分子量壳聚糖制备的壳聚糖膜中的结晶度较低引起。

生物可降解性

壳聚糖不存在于哺乳动物中，但可以在体内被若干酶降解，最值得注意的是溶菌酶、几丁质酶和NAG酶(Dalian,da Luz Moreira等,2007；Kim,Seo等,2008)(Aranaz,Mengibar等,2009)(Niekraszewicz2005)。生物降解导致释放出不同长度的无毒寡糖，这些寡糖随后可以结合到糖胺聚糖和糖蛋白中、进入代谢路径或被***掉。溶菌酶，存在于哺乳动物组织中并且涉及到先天免疫性的非特异性糖苷水解酶，似乎对几丁质和壳聚糖的降解起到重要作用。降解动力学似乎与结晶程度呈逆相关，而结晶程度主要受DD控制。另外，乙酰基的分布也影响生物降解性，因为乙酰基不存在或其均匀分布(无规而非嵌段分布)引起极低的酶降解速率。

最后，若干研究报道，链长度(Mw)也影响降解速率。有关基于壳聚糖的材料和医疗装置的降解速率的了解和控制是特别值得关注的，因为降解在许多小分子和大分子释放应用中及功能组织再生应用中是必不可少的。在某些应用中，支架降解的速率应当反映新组织形成的速率或适合于生物活性分子(例如天然化合物、药物、生物制品、核酸、疫苗及免疫效应物)的控制释放。因此，了解并控制每种材料降解的机制和速率是很重要的。

降解速率还影响生物相容性，因为极快的降解速率将释放(并且潜在地累积)氨基糖，这些糖可能引起轻度的炎性反应。具有低DD的壳聚糖样品会诱发急性程度较高的炎性反应，而具有高DD的壳聚糖样品因降解速率低而诱发极少反应。经显示，降解可随DD降低而增加。换句话说，一般而言，通过增加乙酰基化可增进降解(Lim,Song等,2008)。Kofuji等通过观察在溶菌酶存在下壳聚糖溶液粘度的变化，研究了各种壳聚糖的酶促行为(Kofuji,Qian等,2005)。他们发现，具有低DD的壳聚糖倾向于更迅速地降解。然而，其他作者报道，降解的差异是由壳聚糖分子中乙酰胺基的分布不同引起。这是由脱乙酰基化条件的差异所致，这些条件的差异通过改变分子间或分子内排斥力来影响壳聚糖溶液的粘度。因此，可以得出结论，仅从DD无法估算出降解速率。

生物相容性

壳聚糖显示出极佳的生物相容性，但这一特性取决于样品的特征(例如，天然来源、制备方法、Mw及DD)。尽管消化(口腔/胃肠)酶可以部分地降解壳聚糖，但当口服施用时，它不被吸收。出于这一原因，认为壳聚糖无法通过口服途径供生物利用。壳聚糖在小鼠中的LD50为约16g/kg，具有极高剂量并且伴有可忽略的急性毒性。据报道，壳聚糖的毒性取决于DD。Schipper等报道，DD高于35％的壳聚糖显示低毒性，而DD低于35％(即，几丁质)引起剂量依赖性毒性(Schipper,Varum等,1996)。另一方面，壳聚糖的Mw不影响毒性(Schipper,Varum等,1996)。

已经在体外用心肌细胞、内皮细胞和上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、软骨细胞及角质形成细胞来证明壳聚糖的细胞相容性(Aranaz,Mengibar等,2009)。这一特性似乎与样品的DD相关。当该聚合物的正电荷增加时，由于游离氨基的存在，壳聚糖与细胞之间的相互作用也增加。角质形成细胞和成纤维细胞在具有不同DD的若干壳聚糖薄膜上的粘附性和增殖取决于两个因素：DD和细胞类型。在两种细胞中，细胞粘附百分比明显取决于DD，随这一参数而增加。细胞类型也是影响粘附的一个因素，成纤维细胞更有利，这些细胞展现的负电荷表面比角质形成细胞多。另一方面，通过增加DD，增殖明显减少。因此，在创伤愈合和生物应用中细胞粘附与细胞增殖的平衡需要适当的DD。

含有不同Mw壳聚糖的壳聚糖薄膜具有不同的粘附力，但统计学分析揭露，薄膜之间的生物粘附力无显著差异。相反，Roldo等显示，中等Mw壳聚糖的最大脱附力比低Mw壳聚糖和高Mw壳聚糖要高(Roldo,Hornof等,2004)。

含残留蛋白质的不纯几丁质和壳聚糖会在一些个体内引起过敏反应，如过敏症。样品中蛋白质的含量取决于样品的来源并且尤其是制备方法。当如以上所描述(例如，酸随后强碱加上热处理)来制备时，纯化的壳聚糖是非致敏性的。尽管0.2-0.3％的人群表现出对海洋甲壳动物过敏(Osterballe,Hansen等,2005；Osterballe,Mortz等,2009)，但尊敬的作者Riccardo Muzzarelli博士针对壳聚糖得出以下结论：

目前将几丁质解释为致敏性物质是不明智的，需要进行更多的临床研究和遗传研究。螃蟹、褐虾、对虾(prawn)和龙虾(lobster)几丁质，以及所有等级的壳聚糖一旦经过纯化，就不应被视为“甲壳动物衍生物”，因为分离程序已经在一定程度上去除了蛋白质、脂肪和其它污染物，由此容许将其分类为化学品，不管其起源如何。[(Muzzarelli2010)第305页]

已经鉴别出主要的褐虾过敏原为肌肉蛋白质原肌球蛋白……褐虾来源的葡糖胺是安全的，即使个体对原肌球蛋白过敏。Villacis等指出，由各种制造商制造的葡糖胺补充品不应含临床上相关水平的过敏原[76]。Gray等清楚地指出，“贝虾类过敏是由针对贝虾类肉中而不是壳中的抗原的IgE抗体引起；因此，服用葡糖胺补充品对于贝虾类过敏的患者应当是安全的”[77]。[(Muzzarelli2010)第300页]

另外，就纯化的壳聚糖作为“创伤敷料”产品内的材料来说，Muzzarelli博士指出：

“在实验和临床前手术试验中，使用几丁质/壳聚糖和其衍生物从未导致过敏或其它疾病。”[(Muzzarelli2010)第304页]

止血的考虑

壳聚糖的Mw还影响红细胞的结合或凝集(Mi,Shyu等,2001；Ishihara,Obara等,2006；Pang,Chen等,2007；Aranaz,Mengibar等,2009；Zhang,Xia等,2010)。在近期的论文中，对于固态壳聚糖与壳聚糖乙酸生理盐水溶液进行了比较性研究(Jian,Feng等,2008)。测试了Mw为2000到400kDa并且DD为90％到70％的若干壳聚糖样品。发现固态壳聚糖和“壳聚糖乙酸生理盐水溶液”遵循不同的止血机制。当将血液与壳聚糖乙酸生理盐水溶液混合时，红细胞凝集并且这些细胞变形。与在100-1,000kDa之间范围内的Mw的影响相比较，壳聚糖乙酸生理盐水中的DD，尤其是高DD，对于红细胞的异常凝集和变形具有显著影响。然而，这一现象在固态壳聚糖中未观察到。具有高DD的固态壳聚糖结合更多的血小板并且止血作用更强。

市售的含有壳聚糖和其盐形式的众多医疗装置产品都可用于控制出血(例如，酸性的冻干壳聚糖海绵)。这些装置典型地作为创伤敷料或“绷带”而用于创伤的外表面(参见以下参考文献：FDA批准的装置)。

粘膜粘附

若干因素会影响壳聚糖的粘膜粘附，如生理学变量和壳聚糖的物理化学特性。粘膜是由称为粘蛋白的糖蛋白构成的，由于具有水杨酸残基而富含负电荷。在胃部，壳聚糖由于酸性环境而带正电荷，并因此，它可以通过静电力与粘蛋白相互作用。这一联合的程度取决于粘蛋白中存在的水杨酸的量以及壳聚糖的Mw和DD。已经发现，当壳聚糖的Mw增加时，粘蛋白层中的渗透性也增加，并由此使粘膜粘附增强(Lehr,Bouwstra等,1992)。另一方面，较高的DD导致分子电荷密度增加，并且粘附特性变得更相关(He,Davis等,1998)。

抗微生物活性

壳聚糖的一个固有特性是，它赋予针对广谱细菌的显著抗细菌活性(No,Park等,2002；Jou,Yuan等,2007)。Aimin等(Aimin,Chunlin等,1999)已显示，壳聚糖可以降低兔中由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)实验性诱发的骨髓炎的感染率。这与由氨基赋予壳聚糖的阳离子性和细菌细胞壁上的阴离子有关。带正电的壳聚糖与带负电的微生物细胞壁之间的相互作用导致细胞内成分的漏出。壳聚糖与DNA的结合以及mRNA合成的抑制是经由壳聚糖渗透到微生物细胞溶质中并且干扰mRNA和蛋白质的合成而发生(Liu,Guan等,2001)。

还提出了其它机制。壳聚糖可以通过充当螯合剂，使金属、微量元素或必要养分无法用于供生物体以正常速率生长来抑制微生物生长。壳聚糖还能够与絮凝蛋白质相互作用，但这一作用具有高的pH依赖性。

此外，壳聚糖还具有抗真菌特性。若干作者已经提出，壳聚糖针对丝状真菌的抗微生物作用可以通过比较直接地扰乱膜功能来解释。然而，尚不了解壳聚糖的抗微生物活性是由生长抑制作用(抑真菌作用)还是细胞死亡(杀真菌作用)引起。

抗氧化活性

壳聚糖已经显示出针对不同自由基物质的显著清除能力，其结果与用市售的抗氧化剂所获得的结果相当。基于清除1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、羟基、过氧化物及烷基自由基的能力，对由螃蟹壳几丁质制备的DD为90％、75％和50％的样品进行评价。结果揭露，具有较高DD的壳聚糖展现出最高的清除活性(Park,Je等,2004)。另一方面，针对超氧化物和羟基自由基来分析不同大小的壳聚糖以及其硫酸盐衍生物。发现壳聚糖的Mw与活性之间呈负相关。壳聚糖硫酸化衍生物对于过氧化物自由基呈现较强的清除效应，但Mw最低的壳聚糖显示出比其它壳聚糖显著的亚铁离子螯合效力。金属离子的螯合作用是壳聚糖能够被视为潜在天然抗氧化剂的原因之一。壳聚糖可以通过螯合***中存在的亚铁离子，由此消除其促氧化活性或其向铁离子的转化来延迟脂质氧化(Peng1998)。

壳聚糖的当前应用

壳聚糖(天然的阳离子多糖)和其盐形式(例如，乙酸盐、乳酸盐、氯化物、磷酸盐等)作为用于多种应用，尤其是食品、医疗装置、化妆品及护发产品和药物中的无毒并且生物可降解的生物聚合物，已经引起了相当大的关注(Johnson和Nichols2000)。

就食品来说，近年来，壳聚糖由于能够结合脂肪而被用于非处方药，如多种营养补充产品中的膳食补充品或降胆固醇剂。已经鉴别出壳聚糖为天然来源的通用生物聚合物，由于其针对食物变质微生物的抗微生物作用及抗氧化特性而用于食品防腐。pH依赖性溶解度使其能够使用水处理而成形为各种形状(例如珠粒、薄膜和膜)。已经描述，珠粒和颗粒适用于树脂、填料、吸收剂、吸附剂及绝缘材料(Smith1994)(Unger和Rohrbach1996)。已有大量文献证明，使用壳聚糖涂层作为保护屏障可延长许多水果和蔬菜的储存性。

壳聚糖结构的当前医学应用

壳聚糖因其生物特性而被用于创伤愈合管理(例如，创伤敷料和“绷带”)、可植入装置***(如整形外科和牙周复合物、供组织再生用的支架)及药物递送***和DNA递送***中的研究和/或商业产品中。

多年来，壳聚糖作为生物可降解的天然生物聚合物，已经被用作生物相容性创伤敷料。基于壳聚糖的材料具有高度生物相容性，无毒并且仅存在早期、轻度、巨噬细胞占优势的炎性反应。一般来说，壳聚糖的独特化学和生物特性、生物降解特征及生物相容性使其在生物医学应用中引起注意。含壳聚糖的产品当前可用于医药市场上，典型地如用于促进创伤愈合的US FDA的I类医疗装置创伤敷料或“绷带”。基于壳聚糖的产品在国际上的应用甚至可能比美国更广泛。

纯化的壳聚糖在人体中的安全性

纯化的壳聚糖在人体中的安全性已经广泛报道(Illum1998；Baldrick2010)。已经在各种情形中证实在人体中的安全性：

1.FDA批准的装置：纯化的壳聚糖是众多US FDA批准的I类医疗和牙科装置的组分，并且在大多数情况下是作为主要组分。它是以各种成品形式使用，如颗粒、绷带和纱布中的薄膜组分，及冻干的“海绵”。FDA510(k)售前通知列出的I类产品的实例包括HemCon绷带、HemCon牙科敷料、HemoHalt止血贴创伤敷料、Aquanova超强吸收敷料、CELOX可溶袋中的局部止血颗粒及ChitoGauze。

2.GRAS食品添加剂：壳聚糖以各种壳聚糖制造商(例如Primex)“自确定的”水平作为食品添加剂被视为一般认为安全的(Generally Accepted as Safe，GRAS)。据我们所知，遵循完整FDA评述，在“未加评论”的更高水平下的GRAS名称尚未出现过。壳聚糖被科学界认为可安全用于食品中，不过有一点需注意：摄取的壳聚糖对膳食脂质具有亲和力并且可以减少胃肠道的脂质吸收。

3.化妆品与消费者皮肤护理产品：壳聚糖被列于化妆品原料国际命名(International Nomenclature of Cosmetic Ingredients，INCI)中。壳聚糖和其各种盐形式(例如乳酸盐、乙醇酸盐、抗坏血酸盐、甲酸盐及水杨酸盐)及其它有机衍生物被列为用于化妆品和消费者皮肤护理产品中的成分并且被众多供应商使用。然而，壳聚糖尚未通过化妆品原料评估(Cosmetics Ingredients Review，CIR)进行评价。为安全起见，这一行业专家小组评价了数量极其有限的化妆品原料的安全性。据我们所知，壳聚糖未被专家组考虑在内，并且科学界认为它用于消费者皮肤护理产品和化妆品是安全的。

组织工程

组织工程是多学科的科学，包括材料工程和分子/细胞生物学中尝试开发衰竭组织和器官的生物替代品的基本原理。在最全面意义上，组织工程试图制造身体的活体代用部分。Langer和Vacanti(Langer和Vacanti1993)报道，用于工程化生物替代品的最常用方法是基于活细胞、信号分子和聚合物支架。细胞合成新组织的基质并且代替患病或受损组织起作用，而支架为细胞能够有效实现其任务(如粘附、增殖和分化)提供适合的环境。信号分子的功能是帮助并促进细胞再生新组织。支架不仅提供了形成所设计的组织的临时三维构架，而且还提供空间填充和生物活性信号分子的控制释放。为了在组织工程中执行这些不同的功能，支架应当满足以下要求：(1)与组织的生物相容性和促进细胞粘附的环境；(2)以对应于新组织形成速率的最佳速率进行生物降解；(3)无毒并且无免疫原性；(4)最佳的机械特性；及(5)适于在支架内以及在支架与局部环境之间运输气体、代谢物、养分及信号分子的足够孔隙率和形态。

壳聚糖是组织工程中最有前景的生物材料之一，因为它提供了一组截然不同的有益物理化学和生物特性，使其适用于各种类别的器官(如皮肤、骨骼、软骨、肝、神经及血管)的组织再生。近期进行的再生组织工程研究提出了使用支架来支撑并组织受损的组织，因为三维基质为细胞行为提供了更有利的周围环境。由于具有低免疫原活性、受控制的生物降解性及多孔结构，壳聚糖骨架成为设计组织工程***的颇具前景的材料。

已知如孔隙大小、形状和分布等微观结构对于细胞侵入、增殖及在组织工程中的功能具有显著影响。在支架上进行的细胞附着研究显示，较高的DD有利于细胞粘附(Seda Tigli,Karakecili等,2007)。然而，本公开涵盖56％到99％的壳聚糖DD。

支架的降解性在组织工程化细胞/材料构建体的长期性能方面起到关键作用，因为它影响到许多细胞过程，包括细胞生长、组织再生及宿主反应。如果将支架用于骨骼***的组织工程，那么支架生物材料的降解应当相对较慢，因为它需要维持机械强度直到组织再生完成或接近完成。降解速率也随时间而固有地影响机械特性和溶解特性。

近来，关注点集中在通过静电纺丝法来制备聚合纳米纤维，这是一项独特技术，因为取决于聚合物和加工条件，该技术能够制造出直径在数微米到数十纳米范围内的壳聚糖纳米纤维。静电纺丝向聚合物溶液或熔体的毛细液滴施加高电压以克服液体表面张力，并由此能够形成比常规纤维纺丝方法更精细的纤维。这些纳米纤维模拟天然细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的结构和功能，并且在组织工程中作为支架材料来恢复、维持或改善人体组织的功能而引起极大关注，因为这些材料具有若干有用的特性，如高比表面积和高孔隙率。近期已经尝试通过静电纺丝来制备基于壳聚糖的纳米纤维结构，并取得了不同程度的成功。Min等(Min,Lee等,2004)制造出平均直径为110nm并且直径在40nm到640nm范围内(通过SEM图像分析测量)的几丁质和壳聚糖纳米纤维。Bhattarai等(Bhattarai,Edmondson等,2005)进一步推断，这些基于壳聚糖的纳米纤维促进软骨细胞和成骨细胞粘附并且维持特征性细胞形态。

创伤愈合

几丁质和壳聚糖使免疫细胞和炎性细胞(例如，PMN和巨噬细胞)、成纤维细胞及血管内皮细胞活化。这些效应与样品的DD相关，几丁质呈现的作用比壳聚糖弱。Okamoto和同事报道，壳聚糖在实验动物模型中影响创伤修复的所有阶段(Okamoto,Shibazaki等,1995)。在发炎阶段，壳聚糖具有独立于正常凝血级联的独特止血特性。在体内，这些聚合物还可以刺激成纤维细胞增殖并且调节嗜中性粒细胞和巨噬细胞的迁移行为，从而改良后续修复过程，如纤维素增生和再上皮化(Okamoto,Shibazaki等,1995；Kosaka,Kaneko等,1996)。Kosaka等报道，壳聚糖的细胞结合和细胞活化特性在其潜在作用方面起到关键作用。这些研究进一步证实了壳聚糖适合作为创伤愈合材料，其中将细胞接种到基于壳聚糖的支架上将提供生物相容并且有活力的组织工程化植入物。

壳聚糖低聚物还展现出创伤愈合特性(Minagawa,Okamura等,2007)。已经提出，其创伤愈合特性是归因于其能够通过影响成纤维细胞生长因子来刺激成纤维细胞产生。随后的胶原蛋白产生进一步促进了***的形成(Howling,Dettmar等,2001)。

已经对几丁质寡糖在创伤愈合中的潜在作用以及其针对慢性肠病的能力进行研究(Deters,Petereit等,2008)。壳聚糖低聚物和单体的创伤愈合作用特别值得关注，因为在体内溶菌酶将壳聚糖聚合物降解成这些较小的分子。

已经发现，基于壳聚糖的植入物引起最少的外来物反应，具有极少或无纤维包覆。典型的愈合过程伴随正常肉芽组织的形成，通常伴随血管生成加速。壳聚糖具有促进真皮快速再生及加速创伤愈合的有利特性，适合于从简单的创伤敷料到复杂的人工皮肤基质的多种应用。在巨噬细胞样细胞降解壳聚糖植入物的过程中，已经报道壳聚糖可刺激抗炎性细胞因子级联(Chellat,Grandjean-Laquerriere等,2005)。

理想的皮肤敷料应控制创伤中蒸发的水以最佳速率损失。正常皮肤的经皮水分损失(transepidermal water loss，TEWL)速率为每天204g/m²，而角质层和表皮损伤的受损皮肤的TEWL速率可以在每天279g/m²(对于“一度”烧伤)到每天5138g/m²(对于缺乏表皮的肉芽状创伤)范围内。创伤敷料的水蒸气渗透性应当防止过度脱水以及渗出物的积累。推荐的每天2500g/m²的速率(在受损皮肤损失率的中间范围内)将提供适当水平的水分，同时无创伤脱水的风险。取决于膜浇注之前渗透蒸发(per-evaporation)的时间，所制造的不对称壳聚糖膜的水分损失数据在每天2109到2792g/m²范围内(Mi,Shyu等,2001)。海绵样底层的高孔隙率使水蒸气的吸附增加，并且致密皮肤层的厚度减小使得水分子的扩散增加，由此引起水蒸气传递速率的增加。

药物递送***

壳聚糖在工业中的一项重要应用是开发药物递送***，如纳米粒子、水凝胶、微球体、薄膜及片剂。由于具有阳离子性，壳聚糖能够与多阴离子反应，得到聚合电解质络合物。药物应用包括经鼻、眼、口、***、肠胃外及透皮药物递送。需考虑的壳聚糖的三个主要特征为：Mw、DD及纯度。当壳聚糖链变短(低Mw壳聚糖)时，这些链可以直接溶解于水中，这特别适用于特定生物医学应用，当pH保持在约7.0，或略低(约5.5-6.5)时特别适用于皮肤病学或消费者皮肤护理应用。

在药物递送中，选择具有某些特征的理想壳聚糖类型可用于开发持续药物递送***，延长药物活性持续时间，改善治疗效率并减少副作用。壳聚糖的物理化学特征对于选择适当壳聚糖作为药物递送媒介物的材料特别重要。

由于控制壳聚糖基质的装载和释放特征的疏水相互作用的变化，故DD控制壳聚糖中的结晶度和疏水性(Draget1996)。Zhang等还报道，已显示高壳聚糖DD和窄聚合物Mw分布对于控制粒度分布至关重要(Zhang,Oh等,2004)。

Desai和Park观察到，当用于制备微球体的壳聚糖Mw增加时，维生素C的释放速率变低(Desai和Park2006)。他们研究了释放动力学并且发现它遵循菲克扩散定律(Fick's law of diffusion)。

就体外释放研究来说，含有低Mw和中等Mw壳聚糖的薄膜所释放的药物量类似，但用高Mw壳聚糖制备的薄膜则较低。考虑到壳聚糖的摩尔质量与其溶液的粘度之间的直接关系，这一特性是可预测的。通过增加聚合物的粘度，使得药物穿过所形成的凝胶层向释放介质中的扩散延迟(El-Kamel,Ashri等,2007)。

基因递送

由于带有正电荷，壳聚糖能够与带负电荷的分子(如DNA)相互作用。这一特性在1995年首次被用于制备基因递送***的非病毒载体(MacLaughlin,Mumper等,1998)。与病毒载体相比较，使用壳聚糖作为基因递送的非病毒载体提供了若干益处。主要的是，壳聚糖不产生内源重组、致癌作用并且仅引起轻度的免疫反应。另外，壳聚糖/质粒DNA复合物可以容易地以低成本制备。

壳聚糖的Mw是壳聚糖/DNA复合物制备中的一个关键参数，因为转染效率与壳聚糖Mw明显相关。高分子量壳聚糖产生极为稳定的复合物，但转染效率极低。为了改善转染效率，近期的研究检查了低Mw壳聚糖和低聚物在基因递送载体中的应用。为了获得高水平转染，似乎必须实现细胞外DNA保护(在高Mw下较佳)与有效细胞内解包装(在低Mw下较佳)之间的精细平衡。Lavertu等研究了若干个壳聚糖Mw与DD的组合，发现使用具有10kDa分别与92％DD和80％DD的两个壳聚糖组合具有高转染效率(Lavertu,Methot等,2006)。

Kiang等研究了在壳聚糖-DNA纳米粒子中壳聚糖脱乙酰基化程度对基因转染效率的影响(Kiang,Wen等,2004)。高度脱乙酰基化的壳聚糖(超过80％)释放DNA极慢。他们提出，使用DD低于80％的壳聚糖可以促进DNA的释放，因为该壳聚糖降低了电荷密度，可以增加与DNA形成的复合物的位阻，并且已知其可加速降解速率。他们报道，当DD从90％降低到70％时，荧光素酶报道基因表达增加。62％和70％脱乙酰基化的配制物引起的荧光素酶转基因表达比90％脱乙酰基化的壳聚糖高两个数量级。

壳聚糖膜

壳聚糖膜或薄膜的潜在和实际应用是作为阻隔膜用于在手术期间分离组织层。典型地使用了三种方法来制备具有低密度到高密度的膜状或薄膜状壳聚糖结构。这些制备方法是溶剂浇注、相分离及浸没-沉淀相转化(Madihally和Matthew1999；Hong,Wei等,2007)。对于全部三种方法，通过将适量的壳聚糖粉末(例如，75-90％DD/400-500mPas)溶解于1％(v/v)乙酸溶液中来制备不同浓度(例如，2-4％w/v)的壳聚糖溶液。接下来，将壳聚糖溶液浇注到定制的硅酮模具腔中。就这一点来说，这三种不同的方法(如下文所描述)彼此不同。

在相分离方法中，浇注的酸性壳聚糖溶液在-20℃下冷冻过夜，然后在10×10^-3毫巴下于-40℃下冷冻干燥48小时。然后，使冷冻干燥的壳聚糖材料脱模并且用1N NaOH处理4小时以使壳聚糖聚合物网络稳定，用蒸馏水反复洗涤，然后放入50℃烘箱中干燥。相分离方法产生相对较低密度的多孔“海绵”，并且孔隙大小可以加以控制(Mi,Shyu等,2001)(No等,2002)。

冷冻壳聚糖溶液产生两个或更多个截然不同的相-典型地将水冷冻成冰，并且壳聚糖生物材料移位到单独的固相中。需要另一个步骤来去除冷冻的溶剂(典型地为冰)，并且由此制得低密度多孔海绵，这是创伤敷料的常用形式。此法不会因冷冻干燥(即，冻干)和/或冷冻替代步骤而破坏纤维状结构。

对于溶剂浇注法，简单地在50℃烘箱中对浇注的酸性壳聚糖溶液进行干燥以去除溶剂，从而留下壳聚糖膜。在干燥之后，用1NNaOH处理壳聚糖膜4小时，用蒸馏水反复洗涤以去除任何微量的反应剂，然后放入50℃烘箱中干燥。在以此方法浇注溶液之后，当溶剂开始汽化时，聚合物溶液表面上的溶剂比内部的溶剂汽化快，使得聚合物浓度迅速增加，从而借助于胶状粒子而形成层状。在形成表面层之后，溶剂的汽化减慢。壳聚糖的溶解度不足以使***维持均匀溶液形式，并且引起相分离。从该均匀溶液分离的溶剂形成缺少聚合物的相，被富含聚合物的相包围。酸性溶剂与中和性碱的交换使聚合物网络稳定。

在第三种方法，即，浸没-沉淀相转化(immersion-precipitationphase inversion，IPPI)方法中，在50℃烘箱中使浇注的酸性壳聚糖溶液(部分地)脱水1小时以形成不对称膜，随后通过将其浸入0.2MNaOH溶液中24小时来使呈膜形式的壳聚糖聚合物稳定。然后用脱离子水反复洗涤所得膜，并且接着冷冻干燥48小时。IPPI方法产生具有三层的不对称多孔膜：致密的外层、不太致密的中间过渡层，然后是海绵状多孔层，全部都是可以控制的(Hong,Wei等,2007)。

有关壳聚糖和其用途的评述已经公开(Kato,Onishi等,2003；Niekraszewicz2005；Boateng,Matthews等,2008；Aranaz,Mengibar等,2009；Zhang,Xia等,2010)。

壳聚糖海绵的制备和用途描述于现有技术中：

(1)有关未压缩的冻干的中性海绵(Zhang,Cheng等,2006；SedaTigli,Karakecili等,2007；Blan和Birla2008)；及

(2)有关未压缩的冻干的非中性海绵(Tully-Dartez,Cardenas等,2010；McAdams,Block等,2011)。

还描述了若干其它增加壳聚糖材料的密度的方法，包括：

(1)将冻干的酸性海绵压缩到未指定的密度(McCarthy,Gregory等,2008；Gregory和McCarthy2009)；

(2)将冻干的酸性海绵压缩到小于或等于0.8g/cm3的指定密度(McCarthy,Gregory等,2008；Gregory和McCarthy2010；McAdams,Block等,2011；McCarthy,Gregory等,2011)；

(3)不对称空气干燥(Ma,Wang等,2001；Thein-Han和Stevens2004；Kuo2005；Kuo,Chang等,2006；Dallan,da Luz Moreira等,2007；Duan,Park等,2007；Hong,Wei等,2007；Pang,Chen等,2007；Kuo2008)(Ma等,2001)(Duan等,2007)；及

(4)静电纺丝随后轧制(Yeo,Jeon等,2005；Li和Hsieh2006；Park,Kang等,2006)。静电纺丝制造出较薄的中性壳聚糖纤维，这些纤维可以掺混在一起成为分层网状产品。静电纺丝技术不适用于本文所描述的本发明。

可以通过在需要或不需要光活化的情况下进行化学交联来加强壳聚糖结构(Masuoka,Ishihara等,2005；Obara,Ishihara等,2005)。然而，这些交联方法都不能将壳聚糖的密度增加到本文所描述的本发明的高密度范围。

不对称空气干燥通过使酸性溶剂从壳聚糖溶液暴露的表面蒸发来增加壳聚糖溶液的密度。当去除溶剂时，暴露的表面上壳聚糖的密度增加。这种增加壳聚糖密度的方法可以产生致密的膜状壳聚糖装置。利用这种方法存在的一个特殊问题是在模具内溶液的表面蒸发的不均匀性，以及在不压缩情况下可能达到的密度有限。仅仅使用空气干燥来制造致密壳聚糖膜结构的另一个问题在于，干燥的膜在润湿时过度膨胀，并且对于打算作为致密的阻隔薄膜的材料在临床上有问题。因此，不同于现有技术，本发明描述了制造高密度膜状壳聚糖材料的新方法，这些方法解决了当前的问题。

概述

截至目前，在手术和创伤愈合应用中使用纯化的壳聚糖作为阻隔膜受到了壳聚糖物理特性的限制。如现有技术中所描述来制备的壳聚糖可以产生薄膜、膜或海绵，其具有不足以用于医学应用的密度或其它物理特性。当根据医学应用典型地需要的，润湿达到易弯曲程度时，所制备的密度<0.6mg/cm³的壳聚糖具有的强度不足以可靠地支持手术安置期间的稳固缝合和操作。因此，已经开发出制造密度>0.6mg/cm³同时具有其它有益特性的壳聚糖膜的新方法。这一高密度壳聚糖薄膜或膜提供了可靠地应用于临床的必要强度和操作性能。具体地说，本发明的高密度壳聚糖薄膜或膜具有适用于医学领域的优良拉伸强度、缝合保留(即，对抽出式缝合的抗性)、弹性、适合厚度及形状记忆(即，适应性)，并且当再水合时仍存在有限的膨胀。

在已知用于增加壳聚糖密度的若干方法中，最常用方法包括冻干的壳聚糖海绵的压缩。尽管可以使用足够的压力将冻干的壳聚糖支架压缩成高密度，但这一常用程序的缺点在于，压缩的冻干支架在再润湿后保持形状记忆，并且过度重绕成在临床上作为膜不可接受的厚度。通过这一压缩冻干海绵的方法不可能限制润湿之后重绕的厚度及在膜状结构中维持足够的密度，并因此不适于制备强度足以用于临床操作和缝合的致密膜。因此，本发明描述了制备约0.6-1.6g/cm³并且厚度小于2mm的致密壳聚糖膜的新方法，并且本发明除去了在压缩之前制造海绵的常用步骤。

本发明的本质是膜状壳聚糖材料的制备和用途，该材料比冻干的壳聚糖海绵致密，并且具有另外的特性，如适当的拉伸强度、缝合保留(即，对抽出式缝合的抗性)、弹性及足够的形状记忆(即，适应性)，并且当再水合时仍存在有限的膨胀，这与先前描述的壳聚糖材料明显不同。本发明不限制来自天然、半合成或合成来源的几丁质或壳聚糖来源。

产生本发明的关键步骤是：

1)将酸性壳聚糖溶液浸泡在强碱中，直到该材料中的所有酸都被中和，并且所得凝固的壳聚糖凝胶具有碱性pH。本发明不排除在中和之前进行空气干燥。为了维持每单位面积所希望的壳聚糖浓度，优选地约0.3-0.5g壳聚糖溶液/cm²，在所述中和过程期间，使用模具或模型来保留壳聚糖溶液是优选的。在所述中和之前，优选在模具中冷冻壳聚糖溶液以使在中和过程期间每单位面积壳聚糖的浓度稳定并且促进在中和之前排除聚合物。在壳聚糖从表面损失并且改变均匀壳聚糖结构之前，优选使用化学领域的技术人员惯用的强碱(优选为1-2摩尔浓度的氢氧化钠)使冷冻的壳聚糖悬浮物从冷冻壳聚糖悬浮物的外部向内部聚合。

2)去除固体壳聚糖凝胶中的水或液体，同时压缩壳聚糖。脱水优选是在凝固的壳聚糖凝胶内的强碱与缓冲水溶液或水交换之后进行。脱水优选是在真空中在热存在下进行。脱水优选是在真空下在热存在下时，通过半透膜(例如，赛璐玢(Cellophane)或类似的纤维材料)减少溶剂相(例如，水、缓冲水溶液)来进行。压缩优选是用均匀地分散于壳聚糖凝胶上的25英寸Hg的最低线性压力进行。

本发明的一个重要的独特方面是将压缩与脱水过程组合，由此使凝胶在压缩期间发生脱水。本发明的另一独特方面是在脱水期间凝胶的pH呈中性或碱性。

从以下具体实施方式的评述并且通过参照所附权利要求，可以更清楚地了解并理解本发明的这些和其它目的、特征及益处。

详述

基于前述发现，本文提供了密度大于0.6g/cm³的新壳聚糖结构、制备组合物的方法及使用该组合物用于在本文献背景下所描述的医学应用的方法。制备壳聚糖结构的方法可通过以下三个连续步骤来表征：

a)提供水和壳聚糖的酸性溶液；

b)中和所述溶液以形成聚合壳聚糖的凝胶；

c)对该聚合壳聚糖凝胶同时进行脱水和压缩。

在一个优选实施方案中，所得高密度壳聚糖薄膜或膜组合物的密度大于0.6g/cm³，并且更优选大于0.8g/cm³。

在本发明的一个优选实施方案中，酸性溶液中所使用的壳聚糖起始物质为约70-95％DD。然而，本发明也允许56％-99％的DD。

在一个优选实施方案中，壳聚糖是以壳聚糖碱形式存在。然而，该壳聚糖也可以呈盐形式，如壳聚糖乙酸盐、壳聚糖琥珀酸盐、壳聚糖己二酸盐、壳聚糖氯化物、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖天冬氨酸盐、壳聚糖丙酮酸盐、壳聚糖磷酸盐、壳聚糖乙醇酸盐、壳聚糖抗坏血酸盐、壳聚糖水杨酸盐、壳聚糖甲酸盐或壳聚糖苹果酸盐。

在本发明的另一优选实施方案中，壳聚糖起始物质具有约400-500厘泊(CPS)或毫帕(mPas)的平均粘度。然而，本发明涵盖约5到3000mPas的壳聚糖起始物质粘度。

在本发明的一个优选实施方案中，壳聚糖溶解于1％乙酸中。然而，本发明也考虑除乙酸外的酸性溶剂并且溶剂百分比在0.1％-10％范围内。举例来说，pH低于5.0的适当有机酸，如甲酸、乙醇酸、柠檬酸或乳酸，也是适合的。其它适合的酸包括盐酸、谷氨酸、天冬氨酸、抗坏血酸、丙酮酸、苹果酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖醛酸、山梨酸及叶酸。

在本发明的一个优选实施方案中，该溶液中壳聚糖的浓度为2％-4％。然而，本发明涵盖0.1％到25％的壳聚糖浓度。

在本发明的另一优选实施方案中，在形成中性壳聚糖凝胶之前，将壳聚糖溶解于酸性溶剂中，保持7天(在中和之前存在或不存在冷冻步骤)。然而，本发明也考虑在即将形成中性壳聚糖凝胶之前或长达2年里所制备的壳聚糖溶液(在中和之前存在或不存在冷冻步骤)。

在本发明的一个优选实施方案中，将一定量壳聚糖溶液倒入一个模型或模具中，达到每平方厘米该模型或模具的面积约0.3-0.5g壳聚糖溶液的厚度。然而，本发明涵盖在冷冻之前模具或模型内低至0.1g/cm2或高达10g/cm2的壳聚糖溶液量。

在本发明的一个优选实施方案中，通过该模具或模型对该溶液施加振动来使壳聚糖溶液脱气。振动时间优选为10分钟。然而，本发明涵盖1秒到10天的振动时间。在替代性实施方案中，本发明涵盖通过施加真空来使壳聚糖溶液脱气。

在本发明的一个优选实施方案中，在模具或模型中冷冻壳聚糖溶液以使其变为凝固的壳聚糖悬浮物。在本发明的一个优选实施方案中，在约-80℃下冷冻壳聚糖溶液1小时。在替代性实施方案中，在约-20℃下冷冻壳聚糖溶液16小时。然而，本发明涵盖在0℃到-276℃范围内的温度下冷冻壳聚糖溶液，持续从1分钟到365天的足以使壳聚糖溶液冷冻的时间。本发明还涵盖在该方法的这一阶段中不冷冻壳聚糖溶液的可能。

在本发明的一个优选实施方案中，使凝固的(如果冷冻的话)壳聚糖悬浮物以固体形式脱模(从模具移出)，随后以固体形式浸入碱(如1-2M氢氧化钠)中，保持24小时以完全中和凝固的壳聚糖悬浮物内的酸性溶剂，从而产生聚合凝胶。然而，完全中和凝固的壳聚糖凝胶内的酸性溶剂所需的碱的浓度和体积，以及浸没的持续时间，可以根据凝固的壳聚糖悬浮物的大小和酸度而变化。本发明涵盖化学领域技术人员已知的若干种碱中的任一种，如氢氧化钠或氢氧化钾，浓度在0.1M到10M范围内，并且浸没时间在1分钟到3个月范围内。可以使用替代性氢氧化物，并且其包括氢氧化钙和氢氧化镁。

在本发明的一个优选实施方案中，在脱离子水或蒸馏水或者缓冲水溶液中洗涤具有碱性pH的中性壳聚糖凝胶24小时以使碱性溶液变为中性或基本上呈中性的pH(例如，pH5-11、5-9或5.5-7.5)。然而，本发明涵盖从1分钟到3个月的洗涤时间。本发明还涵盖在这一冲洗步骤期间使用连续流动的脱离子水或蒸馏水或者缓冲水溶液。本发明还涵盖根本不洗涤中性壳聚糖凝胶。

在本发明的一个关键方面中，从中性壳聚糖凝胶去除液体，同时压缩该壳聚糖。脱水优选是利用真空和热进行的。压缩优选是用25英寸Hg的最低线性压力进行的并且优选均匀地分散于壳聚糖凝胶上以获得均匀膜。然而，涵盖使用5-500英寸、10到100英寸或20到50英寸Hg的最低线性压力进行的压缩。脱水和压缩优选是在80℃温度下进行的。然而，本发明涵盖在2℃到150℃、40℃到120℃或50℃到100℃范围内的温度下对壳聚糖凝胶进行脱水和压缩。

当然，应了解，在称为除气的过程中，脱水和物理压缩可以在真空下自行发生或通过加热发生。施加的真空优选低于大气压力，并且低至0.6、0.4或0.2个大气压。

脱水和压缩优选进行4小时的时间。然而，本发明涵盖进行脱水和压缩在1分钟到3个月范围内的时间。

在本发明的一个优选实施方案中，在施加真空进行脱水之前，将中性壳聚糖凝胶放在半透膜之上或内部。该半透膜随后促进水蒸气在真空下散失，同时保持正在脱水和已经脱水的聚合壳聚糖的完整性。半透膜可选择性渗透水，同时在半透膜的边缘或边界内保留模制的壳聚糖凝胶，并且可以是赛璐玢或其它纤维膜或另一材料。脱水的高密度壳聚糖薄膜或膜随后可以从脱水过程期间使用的半透膜移出。

在本发明的另一优选实施方案中，将中性的聚合壳聚糖凝胶浸入甘油溶液中，保持在1秒到10天范围内的时间，然后将其放到半透膜之上或内部进行真空脱水。另外，该甘油溶液优选在水中或缓冲水溶液中含有约5％到20％或10％的甘油。然而，本发明在这一过程期间也可以使用在1％到50％范围内的甘油浓度。

所得壳聚糖结构优选呈厚度小于10mm、5mm、2mm、1mm或甚至0.5mm的薄膜或膜的形式。如先前所述，该结构的密度优选超过0.6g/cm³，并且可以高达1.6g/cm³。在另一优选实施方案中，该结构的密度超过0.8g/cm³，并且可以高达1.6g/cm³。该薄膜或膜也可以通过其pH来表征，该pH优选在5.0到9.5的范围内。该薄膜或膜可以被切开或研磨并且以微粒形式使用，但由于其优良的物理特性(例如拉伸强度、弹性及对抽出式缝合的抗性)，优选以薄膜或膜形式使用。

在一个优选实施方案中，本发明的壳聚糖薄膜或膜不需要化学或光诱导交联步骤，并且仍获得>0.6g/cm³并且更优选>0.8g/cm³的脱水密度。然而，对于一些应用，包括化学或光诱导交联步骤可能提供一些益处，如降低生物降解可能性。

在另一实施方案中，所得本发明的致密壳聚糖结构具有的物理特性有益于用于动物、哺乳动物或人的生物医学程序中，如手术植入的薄膜或膜。当评估拉伸强度、弹性和/或对抽出式缝合的抗性时，致密的壳聚糖材料呈现优良的物理特征。已经建立了用于评价薄膜或膜的这些物理参数的ASTM国际标准方法(ASTM2002；ASTM2006)。这些具有微小修改的标准方法(例如，对于拉伸测试，根据ASTM标准方法D1708-06a，条带为半圆形而非半椭圆形模板图案，并且最小宽度为约2.5mm(ASTM2006)；对于抽出式缝合，条带的宽度为约5mm)已经被用于表征所得本发明的致密壳聚糖结构。

本发明公开了组合物，该组合物包含密度大于0.6g/cm³并且更优选地大于0.8g/cm³的呈薄膜或膜形式的壳聚糖。在另一优选实施方案中，该壳聚糖组合物的pH为5.0到9.5。在另一优选实施方案中，该壳聚糖组合物包括甘油。

最后，本发明提供了使用本发明的结构进行治疗的方法，并且因此可以定义为治疗方法，该方法包括：提供密度大于0.6g/cm³的壳聚糖组合物；及将所述组合物放置于动物体上或其体内。在优选实施方案中，该动物是哺乳动物或人，并且在另一优选实施方案中，使用前，该结构在水或缓冲水溶液中并且在存在或不存在一种或多种选自药物、生物剂、核酸、疫苗、免疫效应物或其盐的化合物的情况下发生水合作用。在另一优选实施方案中，该壳聚糖组合物用作物理阻隔薄膜或阻隔膜以分开动物体内的各个组织层。在另一优选实施方案中，在该动物、哺乳动物或人体上或其体内的薄膜或膜随时间而再吸收，并且其速率部分取决于该材料的DD和厚度。在另一优选实施方案中，该壳聚糖组合物在动物体上或其体内用作抗感染物理阻隔薄膜或阻隔膜。在本发明的另一优选实施方案中，该壳聚糖薄膜或膜可渗透水或水溶液中的小分子。在本发明的另一优选实施方案中，多种物理特性(例如，拉伸强度、弹性和对抽出式缝合的抗性)单独或与临床操作特征(例如，可润湿性、对于手术植入部位的适应性及可缝合性)的组合促进了所得致密壳聚糖薄膜或膜在动物、哺乳动物或人的临床环境中的优良易用性。

实施例

在中和之前冷冻壳聚糖溶液的优选方法中，在-80℃下，在模具中将约0.3-0.5g/cm²的壳聚糖溶液超低温冷冻一小时最终引起壳聚糖在暴露的顶部表面上聚合，当通过显微镜或扫描电子显微镜检查时，在该表面处具有编织的纤维状多孔结构。所得脱水薄膜或膜的总密度>0.6g/cm³并且更优选>0.8g/cm³，并且略有些不对称，在相对的底侧具有更光滑、不太像原纤维的表面。

在中和之前冷冻壳聚糖溶液的优选方法中，在-80℃下超低温冷冻明显超过一小时(例如，两小时)可以引起冷冻的壳聚糖凝胶以及最终膜结构的物理碎裂。

在存在冷冻的优选方法中，在中和之前，在模具内于-20℃下冷冻壳聚糖溶液使最终膜结构中编织结构的范围减小。不管冷冻温度如何，所得膜的密度>0.6g/cm³。

在中和前不冷冻壳聚糖溶液的情况下，所得经过压缩和脱水的膜不具有可见的编织原纤维结构。不管存在或不存在冷冻，所得膜的密度>0.6g/cm³。

在中和酸之前冷冻酸性壳聚糖溶液与脱水加压缩的关联将通过在利用和不利用冷冻过程情况下所产生的材料的机械特性进一步举例说明。在使用Instron试验机测量对抽出式缝合的抗性时，在不利用冷冻过程情况下制备的壳聚糖膜具有每毫米膜厚度2.0N±0.3N的较差抽出力，而在中和之前于-80℃冷冻温度下保持1小时所制备的具有相同组成的膜具有每毫米膜厚度4.5N±0.1N的优良的对抽出式缝合的抗性。

为了举例说明在脱水和压缩之前用碱将冷冻的壳聚糖悬浮物中和成半固体凝胶的重要性，有关在压缩酸性壳聚糖溶液的同时进行蒸发的尝试失败了。脱水加压缩需要半透膜(例如赛璐玢)来保留溶质(壳聚糖聚合物)，同时允许溶剂通过，其中在干燥的同时，壳聚糖的密度逐渐增加。无法通过半透膜对酸性壳聚糖溶液进行脱水的可能的原因是，粘滞的未聚合壳聚糖最后累积在膜表面处并且阻止了溶剂的通过。结果是无法对该溶液进行脱水，即使是在热存在下。出于相同原因，在冷冻酸性壳聚糖溶液之后也无法立即进行脱水和压缩。出于相同原因，也无法对潮湿的酸性壳聚糖海绵(通过将酸性壳聚糖悬浮物冻干来制备)进行脱水加压缩，从而无法通过真空脱水进行干燥。出于相同原因，也无法对潮湿、空气干燥的酸性壳聚糖结构进行脱水加压缩。在真空压缩之前，通过以碱中和来使壳聚糖悬浮物聚合是必要的。

为了举例说明蒸发和压缩中性壳聚糖凝胶的重要性，在压缩干燥的冻干酸性海绵方面的尝试引起壳聚糖膜结构碎裂。润湿干燥的压缩膜导致不可接受的重绕膨胀及未聚合膜结构的损失。

当将中性壳聚糖凝胶放入pH2.9的酸性溶液中20小时的时候引起壳聚糖凝胶结构瓦解，使得壳聚糖结构损失，举例说明了当壳聚糖溶液在强碱中聚合成凝胶之后维持pH高于5.0的重要性。

在pH4或更低的酸性环境中24小时之后致密壳聚糖薄膜或膜结构完全损失，举例说明了在中性壳聚糖凝胶脱水之后维持高于pH5.0的pH环境的重要性。

为了举例说明使中性壳聚糖凝胶而非冻干的海绵脱水和压缩的重要性，对润湿的中性冻干壳聚糖海绵进行压缩产生0.38g/cm³的不足壳聚糖密度。对干燥的中性冻干壳聚糖海绵进行压缩引起不足的壳聚糖密度(0.065g/cm³)。

为了举例说明同时进行脱水和压缩的重要性，在压缩期间在不进行适当脱水的情况下提供压缩的实验产生开裂并且不令人满意的壳聚糖最终结构。

在中和之前振动对酸性壳聚糖溶液的影响对最终膜结构无影响。

为了举例说明具有高密度的壳聚糖薄膜或膜的生物关联性，这些膜展现对小分子的渗透性。举例来说，使用Franz池技术，由4％壳聚糖溶液制备的高密度壳聚糖薄膜或膜可渗透磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)溶液中的亚甲基蓝和结晶紫(分别为Mw285和373)。这证实了这些薄膜或膜对所选小分子的渗透性。对于动物、哺乳动物或人体上或其体内的养分的渗透性可能具有生理学益处。

为进一步举例说明具有高密度的壳聚糖薄膜或膜的生物关联性，将活哺乳动物细胞接种于这些膜上并在培养物中维持至少3天。观察该膜两侧上的细胞结合和细胞相容性。还证实了增殖和细胞迁移的证据。如通过显微镜图像分析所测量，相对于较为多孔的表面(即，当在模具中时的顶部)，角质形成细胞迁移在较光滑的表面(即，当在模具中时的底部)上最明显。这些结果提供了体外生物相容性的证据。

为了进一步举例说明具有高密度的壳聚糖薄膜或膜的生物关联性，当通过手术将这些膜放到大鼠口腔上颚中完整厚度手术诱发的溃疡的底部处时，观察到哺乳动物模型中创伤愈合。愈合与上皮下基质中胶原蛋白的再发育和溃疡的再上皮化相关。在膜植入1到12周之后进行的组织学分析也指示，高密度壳聚糖是生物可相容的，同时也是生物可降解或可再吸收的。在动物、哺乳动物或人体上或其体内产生随时间再吸收的物理屏障具有临床效用。举例来说，不同组织(例如，骨骼对比软组织)之间的物理屏障可以促进在该薄膜或膜的相对侧上的差异愈合速率。另外，就体外酶降解速率来说，类似地预期体内再吸收速率(参见下文)取决于致密壳聚糖薄膜或膜的DD百分比和/或厚度。换句话说，降解速率可以至少部分通过改变DD百分比和/或厚度进行“控制”。

为了举例说明密度与临床功能和效用的关联，干燥壳聚糖薄膜或膜的密度与其它物理特性(如拉伸强度)之间存在强相关性。用具有微小修改的ASTM标准方法(例如，对于拉伸测试，根据ASTM标准方法D1708-06a，条带为半圆形而非半椭圆形模板图案，并且最小宽度为约2.5mm(ASTM2006)；对于抽出式缝合，条带的宽度为约5mm)已经被用于表征所得致密壳聚糖薄膜或膜。由本文要求保护的方法制备的致密壳聚糖薄膜或膜显示出膜密度与拉伸强度之间的直接相关性。一般来说，本发明的致密壳聚糖薄膜或膜当在一系列随制造批料变化的实验变量(例如，起始壳聚糖溶液的量、小于1mm并且典型地为0.2到0.6mm的干膜厚度、70％到95％的DD百分比、来自不同供应商的原材料，干燥后处理(如果有的话)等等)下进行测试时，在使用Instron试验机的测试中得到以下的典型物理特性范围：(a)约2到14N的最大拉伸载荷(约2.5mm最小宽度)；(b)约20到140MPa的最大拉伸应力(约2.5mm最小宽度)；及(c)约0.5到4.5N的抽出式缝合最大载荷(约5mm宽度)。

另外，举例说明本发明的致密壳聚糖薄膜或膜的物理特征与临床效用的相关性的是密度、拉伸强度、弹性及对抽出式缝合的抗性的组合，其中有一些或全部都是可缝合的可植入手术膜所希望的特征。

为了关于本文所公开并且要求保护的方法举例说明壳聚糖脱乙酰基化的关联，在37℃下于pH6.5的浓缓冲溶菌酶溶液中的降解对于70％DD膜在8天内完成，对于75％DD膜在11天内完成，对于80％和85％DD膜在18天内部分完成，并且在90％和95％膜中在这些条件下3周后仍不明显。这些结果指示，起始聚合材料(即，DD百分比不同的壳聚糖粉末)对于体外酶促降解的固有敏感性未被本发明的方法破坏，同时制造出致密壳聚糖薄膜或膜。另外，本发明的致密壳聚糖薄膜或膜当放入乙酸溶液或pH4或更低的缓冲溶液中时在无酶促降解作用情况下，保持对酸解聚(及增溶作用)的不稳定性。

为了举例说明在脱水步骤之前，用甘油溶液(例如10％或50％甘油水溶液)处理中性聚合壳聚糖凝胶的关联，所得薄膜或膜具有与在没有这一甘油溶液步骤情况下制造的薄膜或膜类似的高密度，并且具有有益的高拉伸强度、对抽出式缝合的抗性，及操作特征，如柔性和易于切割性。这一属性组合(即，物理特性和临床操作特征)提供了适用于动物、哺乳动物或人体上或其体内的具有极大效用的薄膜或膜材料。

在本申请通篇，提到了各种出版物。这些出版物的公开内容皆据此通过引用并入，以便更充分地描述本发明所属领域的现有技术水平。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本发明的范围或精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和变更。通过考虑本文所公开的本发明的说明和实践，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员将显而易见。预期这些说明和实施例仅被视为示例性的，而本发明的真实范围和精神是由所附权利要求书所指示。

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Claims (26)

1.一种制备密度大于0.6g/cm³的壳聚糖组合物的方法，其依序包括：

a)提供水和壳聚糖的酸性溶液；

b)中和所述溶液以形成聚合凝胶；及

c)对所述凝胶同时进行脱水和压缩。

2.如权利要求1所述的方法，其另外包括在步骤(c)之后，使所述凝胶在水或缓冲水溶液中在一种或多种化合物存在下再水合，所述化合物选自交联剂、药物、生物剂、核酸、疫苗、免疫效应物或其盐。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含厚度小于2mm的薄膜或膜。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述溶液包含水、乙酸及壳聚糖。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述壳聚糖是呈壳聚糖碱形式或呈盐形式，所述盐选自壳聚糖乙酸盐、壳聚糖琥珀酸盐、壳聚糖己二酸盐、壳聚糖氯化物、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖天冬氨酸盐、壳聚糖丙酮酸盐、壳聚糖磷酸盐、壳聚糖乙醇酸盐、壳聚糖抗坏血酸盐、壳聚糖水杨酸盐、壳聚糖甲酸盐及壳聚糖苹果酸盐。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述酸溶液包含选自以下的酸：甲酸、乙酸、乙醇酸、柠檬酸、乳酸、盐酸、谷氨酸、天冬氨酸、抗坏血酸、丙酮酸、苹果酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、葡糖醛酸、山梨酸、叶酸及其混合物。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述中和步骤(b)包括使所述溶液与氢氧化物盐接触，所述氢氧化物盐选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙及氢氧化镁。

8.如权利要求1所述的方法，其另外包括在中和步骤(b)之前，对所述酸性溶液进行冷冻。

9.如权利要求1所述的方法，其另外包括在脱水步骤(c)之前，在水或缓冲水溶液中对所述凝胶进行洗涤。

10.如权利要求1所述的方法，其另外包括在脱水步骤(c)之前，在水或缓冲水溶液中将所述凝胶洗涤达到5.5到7.5的pH。

11.如权利要求1所述的方法，其另外包括在脱水步骤(c)之前，将所述凝胶浸入1％到50％的甘油溶液中。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述脱水包括在压缩期间对所述凝胶施加真空。

13.如权利要求1所述的方法，其另外包括在所述脱水步骤(c)之前，使所述壳聚糖凝胶与选择性渗透水溶液的膜接触。

14.如权利要求1所述的方法，其中在2℃到150℃的温度下，在热存在下使所述壳聚糖凝胶脱水。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述压缩步骤(c)包括在所述壳聚糖凝胶上施加25英寸Hg的最低线性压力。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述壳聚糖薄膜或膜具有5.5到7.5的pH。

17.一种治疗方法，其包括：

a)提供密度大于0.6g/cm³的壳聚糖组合物；及

b)将所述组合物放置于动物体上或其体内。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述壳聚糖组合物具有大于0.8g/cm³的密度。

19.如权利要求17所述的方法，其中在所述放置步骤(b)之前，使所述组合物在水或缓冲水溶液中水合。

20.如权利要求17所述的方法，其中所述动物选自哺乳动物和人。

21.如权利要求17所述的方法，其中在所述放置步骤(b)之前，使所述组合物在水或缓冲水溶液中，在一种或多种化合物存在下水合，所述化合物选自药物、生物剂、核酸、疫苗、免疫效应物或其盐。

22.一种组合物，其包含密度大于0.6g/cm³的呈薄膜或膜形式的壳聚糖。

23.如权利要求22所述的组合物，其具有0.6g/cm³到1.6g/cm³的密度。

24.如权利要求22所述的组合物，其具有0.8g/cm³到1.6g/cm³的密度。

25.如权利要求22所述的组合物，其具有5.0到9.5的pH。

26.如权利要求22所述的组合物，其含有甘油。