CN103202226A - 白菜组培苗快速高效生根方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白菜组培苗快速高效生根方法，它包含以下步骤：（1）配制适宜的生根培养基；（2）接种；（3）培养；（4）炼苗移栽。本发明确定了快速高效生根的培养基成分及其浓度，该方法通过选择合适的生根培养基，建立了一种高效的白菜组培苗的生根体系，具有操作简单、成本低廉、稳定高效，大大提高组培苗的成活率等优点。

Description

白菜组培苗快速高效生根方法

技术领域

本发明涉及白菜组培苗快速高效生根技术，具体是指一种白菜组培苗快速高效生根方法。

背景技术

组织培养是扩繁速度较快的繁殖方法，组培苗生根是组织培养的重要环节，组培苗生根数量和质量是直接关系到组培苗移栽成活的关键；将组培苗从培养瓶中移出时，组培苗根部附着的含糖培养基质能否在不伤根的前提下快速高效与根系分离是组培苗用于大量生产的重要条件。

固化剂在培养基中起固定支撑作用，植物组培传统上多以琼脂作为固化剂，卡拉胶因具有良好的凝固性且价格相对便宜、配制出来的培养基比较透明、使用方法简单等优点，也广泛应用于植物组织培养，杜雪玲等（2006）研究发现进口植物凝胶（phytagel）是更好的固化剂，但价格昂贵。

目前白菜组培苗的生根研究主要集中在激素种类组合筛选和浓度增减上，对生根培养基固化剂的筛选未见报导，都是以琼脂、卡那胶等作为固化剂。以琼脂等作为白菜生根培养基的固化剂时，由于固体琼脂培养基很紧密地附着在组培苗根的表面，很难用水洗净。如不将根上附着的培养基洗净，则因培养基中含有蔗糖或白糖，很容易使根发霉腐烂，降低组培苗的成活率；要洗净则又很容易损伤根系，也降低组培苗的成活率，且费工费时。生产上迫切需要一种既能对外植体起到支撑作用，利于生根，又容易洗脱的生根培养基。

发明内容

本发明的目的是提供一种白菜组培苗快速高效生根方法，与目前通用的方法相比，避免了生根中分枝根不多、附着在根上的培养基不易洗脱的弊端，利用珍珠岩和少量琼脂作为培养基中的固体支撑物，生根质量好、洗脱速度快，价格便宜，能节省大量人力物力；且确定了生根培养基中适宜的琼脂浓度、珍珠岩的用量，以及激素的种类和浓度。

为实现上述目的，本发明提供的白菜组培苗快速高效生根方法，依次包括配制生根培养基、接种、培养和炼苗移栽的过程，其特征在于：

（1）配制生根培养基：将常规MS培养基中的大量元素含量减半、微量元素及其他成份含量不变，作为基本培养基；向基本培养基中添加琼脂、蔗糖、萘乙酸、吲哚乙酸和去离子水，混合配制成培养液；然后将培养液倒入盛装有珍珠岩颗粒的培养瓶中，使珍珠岩颗粒能够被培养液完全浸透而无过剩溶液溢出；再对其进行湿热灭菌处理，自然冷却形成生根培养基，且在生根培养基中如下组份的质量体积比控制在琼脂1~3g/L、蔗糖28~30g/L、萘乙酸0.05~0.15mg/L、吲哚乙酸0.01~0.05mg/L、珍珠岩颗粒80~120g/L；

（2）接种：在培养瓶中的培养基上插出小洞，将白菜组培苗切下的带有叶片的茎尖基部放入小洞中，用旁边的培养基填实茎尖基部空隙；

（3）培养：将接种好的培养瓶放在培养室内进行生根培养；

（4）炼苗移栽：生根培养21±2天后，将培养瓶置于室内靠窗处，于自然条件下炼苗，使白菜组培苗逐渐适应外部环境，炼苗后将苗从瓶中取出．用流水冲洗净根上的含糖培养基质后定植。

作为优选方案，所述步骤（1）中，选用珍珠岩颗粒的粒径为3~5mm；控制湿热灭菌温度为121℃、时间为15min。

作为优选方案，所述步骤（2）中，在培养瓶中的培养基上插出2~3个小洞，其大小恰好能放进白菜组培苗茎尖基部，白菜组培苗茎尖基部带有2~3片叶。

作为优选方案，所述步骤（3）中，生根培养的条件为温度（25±2）℃、光照强度（2500±150）Lx、光照时间（14±3）h。

作为优选方案，所述步骤（4）中，炼苗时间为不松膜炼苗2d、松膜炼苗2d，揭开封口膜炼苗3d。

本发明的优点在于：

其一，按步骤进行生根的方法与传统生根培养基相比，产生根的侧根数量多，根的质量较好。

其二，确定了用珍珠岩和适当浓度的琼脂相配合作为外植体的支撑物，在移栽时培养基容易从根上洗脱，洗脱速度快，不损伤根系，提高了组培苗移栽成活率，用珍珠岩代替大部分琼脂，清洗效率高，节省了大量人力物力，使培养成本降低。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

供试材料：

供试的白菜为兔耳白白菜（为普通的青梗菜，市场有销售，公众可轻易获得）、上海青小白菜和红菜薹组培无根苗。

生根培养基材料：琼脂、蔗糖、1/2MS、珍珠岩（粒度3～5mm）、萘乙酸、吲哚乙酸、去离子水。

1/2MS培养基就是大量元素母液减半，MS是我们常用的基本培养基，其无机盐与离子的浓度较高，是较为稳定的平衡培养液，但是硝酸盐含量较高，被广泛的用于器官、花药、细胞核原生质体培养。而1/2MS是将MS的大量元素减半其他不变而配置的培养基，这主要是降低无机盐浓度，作用和MS大致相同，只是适合不同植物不同要求而已。

萘乙酸

英文通用名1-naphthlcetic acid，其他名称 a-萘乙酸。萘乙酸毒性对人畜低毒。大鼠急性口服LD50为1000-5900mg/kg，对皮肤和粘膜有刺激作用。

萘乙酸是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞***与扩大，诱导不定根形成，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植株内，随营养流输导到全株。适用于谷类作物，增加分蘖，提高成穗率和千粒重；棉花减少蕾铃脱落，增桃增重，提高质量。果树促开花，防落果、催熟增产。瓜果类蔬菜防止落花，形成小籽果实；促进扦插枝条生根等。萘乙酸在植物组培中很是常用，用于诱导细胞***和根的分化。

吲哚乙酸

又名吲哚-3-乙酸，英文通用名indole-3-acetic acid，是一种能调节植物生长和发育的植物激素。

吲哚乙酸是一种有机物。纯品是无色叶状晶体或结晶性粉末。遇光后变成玫瑰色。熔点165-166℃（168-170℃）。易溶于无水乙醇、醋酸乙酯、二氯乙烷，可溶于***和丙酮，不溶于苯、甲苯、汽油及氯仿。不溶于水，其水溶液能被紫外光分解，但对可见光稳定。其钠盐、钾盐比酸本身稳定，极易溶于水。易脱羧成3-甲基吲哚（粪臭素）。在组织培养中，被用于诱导细胞的***和根的分化。

实施例一：

无根组培苗为上海青白菜组培芽苗。以将MS培养基的大量元素减半的培养基为基本培养基，添加：琼脂1g/L、蔗糖28g/L、珍珠岩（粒度3mm）80g/L、萘乙酸0.05mg/L、吲哚乙酸0.01mg/L、去离子水。先在培养瓶中加入4g洗净凉干的珍珠岩，然后添加50ml培养液，121℃湿热灭菌15分钟，自然冷却备用。

先用镊子在培养瓶中的培养基上插出3个小洞，大小以放进外植体茎尖基部为宜，将3个带有2片叶的茎尖基部放入小洞中，用周边的培养基填实茎尖基部空隙即可。然后将接种好的玻璃瓶放在培养室进行生根培养，培养条件为：温度25℃、光照强度2500Lx、光照时间14小时。培养21天后统计根的数量和质量。一级根数目为直接着生在组培苗基部的根的数量，二级根为一级根上长出根，三级根为二级根上着生的根，以根白色、根粗短且多为好，多、细为较好，颜色发暗、少、细且长的为差。

生根培养后组培苗的一级根、二三级根数目分别为3.05和42.25条/株，根质量好。组培苗根上的含糖培养基清洗速度为1.0株/分钟，移栽成活率为99%。

实施例二：

无根组培苗为免耳白小白菜组培芽苗。以将MS培养基的大量元素减半的培养基为基本培养基，添加：琼脂2.0g/L、蔗糖29g/L、珍珠岩（粒度4mm）100g/L、萘乙酸0.1mg/L、吲哚乙酸0.03mg/L、去离子水。先在培养瓶中加入5g洗净凉干的珍珠岩，然后添加50ml培养液，121℃湿热灭菌15分钟，自然冷却备用。

先用镊子在培养基上插出2个小洞，大小以放进外植体茎尖基部为宜，将2个带有3片叶的茎尖基部放入小洞中，用周边的培养基填实茎尖基部空隙即可。然后将接种好的玻璃瓶放在培养室进行生根培养，培养条件为：温度25℃、光照强度2500Lx、光照时间14小时。培养22天后统计根的数量和质量。一级根数目为直接着生在组培苗基部的根的数量，二级根为一级根上长出根，三级根为二级根上生的根，以根白色、根粗短且多为好，多、细为较好，颜色发暗、少、细且长的为差。

生根培养后组培苗的一级根、二三级根数目分别为3.58和43.78条/株，一级根粗壮，二级、三级根多。组培苗根上的含糖培养基清洗速度为1.2株/分钟，移栽成活率为99.2%。

实施例三：

无根组培苗为红菜薹组培芽苗。以将MS培养基的大量元素减半的培养基为基本培养基，添加：琼脂3.0g/L、蔗糖30.0g/L、珍珠岩（粒度5mm）120g/L、萘乙酸0.15mg/L、吲哚乙酸0.05mg/L、去离子水。先在培养瓶中加入6g洗净凉干的珍珠岩，然后添加50ml培养液，121℃湿热灭菌15分钟，自然冷却备用。

先用镊子在培养基上插出3个小洞，大小以放进外植体茎尖基部为宜，将3个带有2片叶的茎尖基部放入小洞中，用周边的培养基填实茎尖基部空隙即可。然后将接种好的玻璃瓶放在培养室进行生根培养，培养条件为：温度25℃、光照强度2500Lx、光照时间14小时。培养23天后统计根的数量和质量。一级根数目为直接着生在组培苗基部的根的数量，二级根为一级根上长出根，三级根为二级根上生的根，以根白色、根粗短且多为好，多、细为较好，颜色发暗、少、细且长的为差。以纯琼脂作为固化剂的普通培养基（MS培养基+琼脂7.5g/L、蔗糖27/L、萘乙酸0.03mg/L）为对照。

数据处理：

所有数据均采用SPSS11.5（LSD，p<0.05）进行统计分析处理。

结果与分析：

不同培养基对生根数量和质量的影响

表一、不同生根培养基生根数量和质量统计表

注：同一列小写字母表示0.05水平的差异，字母相同者差异不显著。

表一显示，用纯琼脂作为固化剂的生根培养基的一级根、二、三级根数目分别为2.15和23.6条/株，而用本发明的培养基分别为3.05和41.62条/株，显著高于前者，而且后者根质量为好等次。

不同生根培养基培养的试管苗的培养基清洗速度和成活率

表二、不同生根培养基的试管苗培养基清洗速度和成活率统计表

注：同一列小写字母表示0.05水平的差异，字母相同者差异不显著。

表二显示，用纯琼脂作为固化剂的普通培养基培养的试管苗根上的含糖培养基清洗速度为0.3株/分钟，成活率为85%，而用本发明的培养基培养的分别为1.4株/分钟和97.8%，显著高于前者。

结论：

研究结果表明，用纯琼脂作为固化剂的普通培养基培养试管苗生根的数量和质量、根上含糖培养基清洗速度和定植成活率与本发明的培养基培养的存在显著差异，后者显著好于前者。含糖培养基清洗速度提高使该方法成本大为降低，而且试管苗成活率提高了12.8%，这为白菜组培技术在生产上大规模应用打下了坚实的基础。

3个实施例表明，用本生根培养基培养的组培苗根的数量和质量、根上含糖培养基清洗速度和定植成活率都很高。含糖培养基清洗速度提高节约了大量劳动力，在现在劳动力成本快速增长的情况下特别有意义，另外用珍珠岩代替部分琼脂也降低了培养基成本，使组培苗生产成本大为降低，而且组培苗成活率得到了提高，这为白菜组培技术在生产上大规模应用打下了坚实的基础。

Claims (5)

1.一种白菜组培苗快速高效生根方法，依次包括配制生根培养基、接种、培养和炼苗移栽的过程，其特征在于：

（1）配制生根培养基：将常规MS培养基中的大量元素含量减半、微量元素及其他成份含量不变，作为基本培养基；向基本培养基中添加琼脂、蔗糖、萘乙酸、吲哚乙酸和去离子水，混合配制成培养液；然后将培养液倒入盛装有珍珠岩颗粒的培养瓶中，使珍珠岩颗粒能够被培养液完全浸透而无过剩溶液溢出；再对其进行湿热灭菌处理，自然冷却形成生根培养基，且在生根培养基中如下组份的质量体积比控制在琼脂1~3g/L、蔗糖28~30g/L、萘乙酸0.05~0.15mg/L、吲哚乙酸0.01~0.05mg/L、珍珠岩颗粒80~120g/L；

（2）接种：在培养瓶中的培养基上插出小洞，将白菜组培苗切下的带有叶片的茎尖基部放入小洞中，用旁边的培养基填实茎尖基部空隙；

（3）培养：将接种好的培养瓶放在培养室内进行生根培养；

（4）炼苗移栽：生根培养21±2天后，将培养瓶置于室内靠窗处，于自然条件下炼苗，使白菜组培苗逐渐适应外部环境，炼苗后将苗从瓶中取出．用流水冲洗净根上的含糖培养基质后定植。

2.根据权利要求1所述的白菜组培苗快速高效生根方法，其特征在于：所述步骤（1）中，选用珍珠岩颗粒的粒径为3~5mm；控制湿热灭菌温度为121℃、时间为15min。

3.根据权利要求1所述的白菜组培苗快速高效生根方法，其特征在于：所述步骤（2）中，在培养瓶中的培养基上插出有2~3个小洞，其大小恰好能放进白菜组培苗茎尖基部，白菜组培苗茎尖基部带有2~3片叶。

4.根据权利要求1所述的白菜组培苗快速高效生根方法，其特征在于：所述步骤（3）中，生根培养的条件为温度（25±2）℃、光照强度（2500±150）Lx、光照时间（14±3）h。

5.根据权利要求1所述的白菜组培苗快速高效生根方法，其特征在于：所述步骤（4）中，炼苗时间为不松膜炼苗2d、松膜炼苗2d，揭开封口膜炼苗3d。