CN104109682A - 一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用 - Google Patents
一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用。本发明采用同源序列法，在拟南芥果胶裂解酶序列的基础上，通过cD NA-RACE技术，克隆获得了甘蓝型油菜果胶裂解酶BnPL基因的c DNA、基因组DNA、编码区，并在此基础上利用基因组步移法获得了BnPL基因的启动子。本发明利用重组载体进行BnPL基因的原核表达，表明该基因具有果胶裂解酶活性；通过构建BnPL的反义表达载体，说明BnPL具有促进角果开裂的功能；通过BnPL基因的启动子驱动GUS基因表达，说明BnPL基因的功能可能与细胞的分离相关。这些结果都表达BnPL基因参与细胞分离过程，利用反义技术操作BnPL基因能够创造抗裂角的植物材料。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物基因工程领域。具体涉及一种果胶裂解酶BnPL及其编码基因和应用。
背景技术
油菜角果开裂是构成油菜减产的主要因素之一，也是当前机械化收获中最突出的问题。生产上由裂角造成的损失一般为10％-20％，当收获期遇到多雨和高温天气时损失将高达50％。油菜易裂角不利于机械化收获，提高油菜角果的抗裂角能力是机械化收获过程中急需解决的重大问题，加强油菜抗裂角性状的研究对油菜生产的可持续性发展具有重要意义。
果胶是植物细胞壁的主要组成部分，能在细胞之间的相互连接过程中发挥作用，在维持植物细胞壁的结构上具有重要意义。另外，果胶也能作用于植物的抗病性状和信号转导。果胶裂解酶基因是一类能降解果胶质的酶的总称，广泛存在于微生物和植物组织中，果胶裂解酶基因能通过对半乳糖醛酸的β碳原子上的基团进行转移和消除机制使半乳糖醛酸的α-1,4键断裂，是一种能降解细胞壁的裂解酶基因，在植物的生长和发育过程中，伴随着细胞壁的修饰和成分的改变与降解。果胶裂解酶基因通过降解细胞壁的果胶来发挥这一作用。在植物中，果胶裂解酶基因首先在番茄的花发育过程中被分离出来，且具有花发育特性。果胶裂解酶基因能降解花粉细胞壁中的果胶物质，从而导致花粉细胞壁的松弛而使花粉管萌发。在拟南芥中，果胶裂解酶基因不仅能影响组织的腐烂还能诱导拟南芥植株的抗病体系。
在跃变型果实中，果胶裂解酶基因能影响果实的硬度。在成熟香蕉的果实中分离出了两个果胶裂解酶基因基因Pel-1和Pel-2，这两个基因都只在成熟的角果中表达，在绿色的角果和叶，根中都不表达，显示这两个果胶裂解酶基因在果实的成熟和软化过程中具有重要作用。在草莓中构建了35S启动子驱动的反义表达果胶裂解酶基因基因的载体转化草莓，在反义表达果胶裂解酶基因基因的阳性草莓株系中，果胶裂解酶基因基因的表达水平比对照低30％，表型体现为其产量降低，成熟果实果胶裂解酶含量比对照低，果实更硬。对其中的2个转反义基因的转基因株系进行了细胞学结构观察，发现转反义果胶裂解酶基因的果实中细胞之间间隙比对照要小，两个相邻细胞之间的结合能力更强，果实更耐存储。这些实验证明果胶裂解酶基因能控制相邻细胞之间的连接，对维持果实细胞间的结合能力具有重要作用。
由于甘蓝型油菜裂角涉及到离区细胞的降解，果胶裂解酶基因在油菜角果发育中可能起到一定的作用，因此通过反向遗传学的方法研究果胶裂解酶基因基因的功能，对创造和培育抗裂角性强的油菜品种具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因，本发明提供了这个基因的核苷酸序列和其蛋白质的氨基酸序列。该基因参与细胞分离过程，利用反义技术操作BnPL基因能够创造抗裂角的植物材料。
本发明的另一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因的制备方法，该方法根据拟南芥的果胶裂解酶基因(AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列数据库中找到了三个匹配较好的序列，根据这三个EST序列设计引物，以甘蓝型油菜cDNA为模板进行PCR，对PCR产物进行测序后，根据扩增出的序列片段设计RACE引物进行RACE反应，扩增全长cDNA序列，从而得到全长cDNA序列。以全长cDNA序列设计特异引物，以油菜基因组DNA为模板扩增BnPL基因的全长序列。
本发明的再一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因启动子的制备方法，根据果胶裂解酶BnPL基因的全长序列设计引物，通过基因组步移法在甘蓝型油菜品系R2中扩增并拼接出果胶裂解酶BnPL启动子序列。根据拼接出的果胶裂解酶BnPL启动子的拼接序列设计特异引物，扩增出该基因的启动子全长序列。
本发明的再一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性中的应用途径。
本发明的技术方案通过以下方法实现：
一种果胶裂解酶BnPL基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，总长度1416bp，共编码471个氨基酸。
一种果胶裂解酶BnPL基因，其表达蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
所述的果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性中的应用。
所述的果胶裂解酶BnPL基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
所述的果胶裂解酶BnPL基因启动子在植物角果发育调控中的应用。
1、一种果胶裂解酶BnPL基因通过以下步骤获得：
步骤1，BnPL基因全长cDNA序列的克隆
a.根据拟南芥果胶裂解酶基因(AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列数据库中找到三个匹配较好的序列：GR462449.1，GR453547.1，GR463150.1，根据这三个EST序列设计引物扩增得到了一个小片段的序列，经拼接后作为模板进行引物设计：PL-F-1(5’-CGAGGAAGAGGACGACATTGAG-3’)和PL-R-1(5’-CGAATCCTCGGCATCCTCTG-3’)；
b.以甘蓝型油菜品系R2角果发育期RNA反转的cDNA为模板进行PCR扩增，转化送至英骏生物技术服务有限公司(上海)测序。
c.为获得基因的全长序列，利用RACE技术扩增全长cDNA序列，使用扩增出的序列片段设计RACE引物：PL-RACE-5(5’-TCCATCGGCCTGTCCTCTAAACC-3’)和PL-RACE-3(5’-GTACAGGACCACAGGAGGCAAACG-3’)，进行RACE反应。对扩增产物测序拼接后获得BnPL基因全长cDNA序列：如SEQ ID NO.2所示，长度为1796bp，其中包含178bp的5’UTR，172bp的3’UTR，另外还存在一个32bp的polyA尾巴。
步骤2，获取BnPL基因全长DNA序列
a.根据该基因的cDNA全长序列设计引物，引物组合为Mq-Pectate-5-3:(5’-CGGATCCATGGAGACAGCTAGGCTTTTC-3’)，Mq-Pectate-3-1:(5’-CCGGAATTCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3’)；
b.以油菜品系R2的基因组DNA为模板PCR获得BnPL全长基因片段将该片段回收测序，获得序列BnPL全长DNA基因序列，如SEQ ID NO.3所示，其总长度为2468bp，由3个内含子和4个外显子组成。
2、果胶裂解酶BnPL基因启动子的获得
步骤1，根据果胶裂解酶BnPL基因的全长序列,设计6条特异性引物：SP1(5’-ACTCATCGGTCTCCGCAACA-3’)、SP2(5’-GGAATCAAACTGGCAATACAAATCAC-3’)、SP3(5’-TTTCTGTTTGGTAGATGAACCGTATT-3’)、SP11(5’-TCGCAGACTAATGGGTTGGTAAA-3’)、SP12(5’-ACGACGCCGCTTGAGTG-3’)和SP13(5’-CCTTATAGACGCCAGCCACGA-3’)。
步骤2，利用油菜基因组DNA为模板，基因组DNA的核苷酸序列，使用Genome-walking试剂盒(Takara公司)通过基因组步移扩增油菜BnPL启动子序列：
第一次步移以试剂盒提供的AP2引物作为上游引物，以SP1、SP2、SP3引物分别作为下游引物进行3轮热不对称PCR反应；
第二次步移以试剂盒提供的AP4引物作为上游引物，以SP11、SP12、SP13引物分别作为下游引物进行3轮热不对称PCR反应。
对两次步移后的PCR片段测序后进行序列拼接，获得启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，序列总长度为1955bp。
3、载体构建
1)果胶裂解酶BnPL基因反义载体的构建
a.使用的引物组合为Fanyi-3-1:(5’-CGGATCCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3’)和Fanyi-5-1:(5’-CCGGAATTCATGGAGACAGCTAGGCT-3’)；
b.以油菜cDNA为模板扩增，片段回收后***到PMD18简易T载体中，经M13引物测序；
c.确定序列的完整性后，利用BamHI/EcoRI对重组载体进行酶切，同时也利用BamHI/EcoRI对原始PBI121载体进行酶切，切除掉GUS基因序列；
d.将两个带有BnPL基因的酶切片段亚克隆入PBI121表达载体，使外源基因序列取代载体中的报告基因GUS的位置，其中正义载体为正向方向取代，而反义载体为反向方向取代。
2)果胶裂解酶BnPL基因启动子重组载体的构建
a.将引物MQ-promoter-5-101和MQ-promoter-3-3(序列见上文)在油菜基因组DNA的扩增产物回收，***到PMD18简易T载体中，经M13引物测序；
b.确定序列的完整性后，利用ClaI/XbaI对重组载体进行酶切，同时也利用ClaI/XbaI对原始PBI121载体进行酶切，切除掉35S序列；
c.然后将带有BnPL启动子的酶切片段克隆入PBI121表达载体，使BnPL启动子取代载体中的35S启动子序列。
4、植物转化
重组的含目标果胶裂解酶BnPL基因及其启动子的新质粒PBI121表达载体导入农杆菌(EHA105)，通过农杆菌介导法转化油菜和拟南芥，其中拟南芥利用花序浸染法转化花蕾，油菜利用组织培养法转化下胚轴。转基因植株的筛选采用含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基进行筛选，并通过PCR进行验证，采用的引物组合为Kan-5和Kan-3，扩增的目标基因为卡那霉素基因，转基因阳性植株经过连续两代选择，T3转基因植株被用作表型分析。
本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的目标基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。
本发明中所提到的植物包括水稻、小麦、玉米等受高温逆境影响较大的粮食作物，也包括油菜、大豆、棉花等经济作物，还包括夏季生长的黄瓜、番茄等蔬菜作物。
提取植物叶片DNA是常用的分子生物学技术，提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，构建本发明中所述的载体构建和将载体转染入植株所用到的酶切、连接、农杆菌介导法转化油菜下胚轴和侵染拟南芥花序等方法也是本领域中常用技术。
本发明中所用到的DNA Marker(100bp)、dNTPs(10mmol/L)均购自北京鼎国生物公司；总RNA提取液Trizol和RNA反转录试剂盒购于Invitrogen公司，DNase购于Promega公司，DNA回收纯化试剂盒购于OMEGA公司。其他试剂均为国产分析纯。克隆载体pMD18-T、大肠杆菌DH5α，Ex Taq聚合酶(5U/μL)购自宝生物工程(大连)有限公司。PBI121载体由申请人保存，油菜品系R2由中国农业科学院油料作物研究所油菜杂种优势利用课题提供。
本发明通过克隆果胶裂解酶BnPL基因，构建反义植物表达载体转化油菜和拟南芥，明确了该基因参与植物角果发育中的细胞分离过程，对于提高植物抗裂角性表现中起着重要的作用。利用反义技术操作，申请人可以利用该基因人工创造抗裂角的植物材料。反义载体转化拟南芥和油菜的阳性植株中，角果的抗裂性增强。
本发明通过克隆果胶裂解酶BnPL基因及其启动子，构建由该启动子驱动的含GUS基因的植物表达载体，转化拟南芥后GUS活性只在生殖生长阶段成熟的花药、花瓣柱头和角果中检测到，尤其在角果顶部、假隔膜及角果与果柄结合处。表明果胶裂解酶BnPL的启动子具有组织特异性，在植物角果发育调控中的表达有着重要作用。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社,1988)一书中所列的具体方法或者条件进行，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1一种果胶裂解酶BnPL基因的获得
1.1总DNA和总RNA的提取
采用CTAB法提取植物DNA；采用Triozol法提取植物的总RNA，使用DNase消化去除RNA中的DNA污染。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA和总RNA的质量。使用Takara公司的M-MLV RTase cDNA试剂盒，根据其说明书将2μg的总RNA被反转录成cDNA。
1.2BnPL基因全长cDNA序列的克隆
根据拟南芥果胶裂解酶基因基因(AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列数据库中进行同源性搜索，找到了三个匹配较好的序列，EST编号分别为GR462449.1、GR453547.1和GR463150.1，将这三个序列用CAP3软件拼接，以获得的序列为模板设计引物：PL-F-1(5’-CGAGGAAGAGGACGACATTGAG-3’)和PL-R-1(5’-CGAATCCTCGGCATCCTCTG-3’)，以甘蓝型油菜R2角果发育期RNA反转的cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95℃，2min；94℃，30s,55℃，30s,72℃，1min,共34个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收。将所得片段克隆至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选重组子，菌落PCR鉴定正确的阳性克隆，送至英骏生物技术服务有限公司(上海)测序，结果得到了一个822bp的序列。为获得基因的全长序列，利用RACE技术扩增全长cDNA序列，利用扩增出的822bp的序列设计RACE引物进行RACE反应，5’和3’RACE的引物分别为PL-RACE-5(5’-TCCATCGGCCTGTCCTCTAAACC-3’)和PL-RACE-3(5’-GTACAGGACCACAGGAGGCAAACG-3’)。3’RACE与5’RACE过程中cDNA第一条链的合成以及PCR反应体系的配置和扩增均按照Clontech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。主要组成成分为：cDNA第一链2.5μL，RACE引物(10μmol/L)1.0μL，UPM(10×)5.0μL，Master Mix41.5μL。PCR反应程序为：94℃，30s，72℃，3min，5个循环；94℃，30s,70℃，30s,72℃，3min，5个循环；94℃，30s，68℃，30s，72℃，3min，27个循环；共37个循环。PCR反应结束后，各取3’RACE和5’RACE产物5.0μL在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上检测，利用OMEGA公司的胶回收试剂盒回收RACE产物，经pMD18-T载体连接后克隆测序。结果表明3’RACE产物的长度为1322bp，5’RACE产物的长度为982bp。在3’RACE和5’RACE的产物中存在361bp的序列重复，经CAP3软件拼接后获得BnPL基因的全长序列，长度为1796bp，其中包含178bp的5’UTR，172bp的3’UTR，另外还存在一个32bp的polyA尾巴。
BnPL基因的全长cDNA序列，经ORF find软件分析表明其开放阅读框序列为179bp至1594bp，总长为1416bp，共编码471个氨基酸，得到了一种油菜果胶裂解酶基因，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。利用在线分析结构域软件http://smart.embl-heidelberg.de/smart分析表明该基因编码的蛋白具有果胶裂解酶基因结构域(domain)。将此序列在公共数据库NCBI上进行Blaxtp搜索比对寻找同源蛋白，结果表明，油菜的BnPL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的一些果胶裂解酶基因蛋白的相似性较高。为比较不同物种果胶裂解酶基因序列的同源性关系，提取了24个果胶裂解酶基因蛋白，其中含有6个拟南芥果胶裂解酶基因家族蛋白，涉及到18个物种。通过构建***发育进化树，结果表明BnPL与拟南芥的两个蛋白一致性非常高，对应的拟南芥的基因编号为At5g15110和At3g01270。拟南芥果胶裂解酶基因家族蛋白的序列在进化过程中发生了分化，可能导致了不同果胶裂解酶基因功能分化的原因。
1.3果胶裂解酶BnPL基因全长序列的PCR扩增
为了获得甘蓝型油菜BnPL基因的全长DNA序列，根据该基因的cDNA序列设计引物组合：Mq-Pectate-5-3:(5’-CGGATCCATGGAGACAGCTAGGCTTTTC-3’)，Mq-Pectate-3-1:(5’-CCGGAATTCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3’)。利用R2的基因组DNA为模板扩增BnPL基因的全长序列，PCR扩增体系为：20μL反应体系，含8.75μL的ddH2O,2μL的10×LAPCR缓冲液,4μL的2.5mmol/L的dNTP,2μL的MgCl2(25mM),1μLPCR引物10mmol/Lprimer,1μL100mmol/L的模板DNA，最后加入0.25μL的Takara LA Taq(5U/μL)。反应条件为：95℃，3min；94℃，45s；50℃，45s；72℃，3min；34个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收所得片段进行克隆和测序，结果获得了长度为2468bp的BnPL基因组序列。利用此序列及cDNA序列在网站http://gsds.cbi.pku.edu.cn/上分析比较，以确定外显子和内含子的位置，结果表明甘蓝型油菜BnPL基因由3个内含子和4个外显子组成。
实施例2BnPL基因启动子的扩增及载体构建
2.1BnPL基因启动子的扩增
利用油菜基因组DNA作为模板，使用Genome-walking试剂盒(Takara公司)扩增油菜BnPL启动子序列。根据BnPL基因的全长序列,设计6条特异性引物SP1(5’-ACTCATCGGTCTCCGCAACA-3’)、SP2(5’-GGAATCAAACTGGCAATACAAATCAC-3’)、SP3(5’-TTTCTGTTTGGTAGATGAACCGTATT-3’)、SP11(5’-TCGCAGACTAATGGGTTGGTAAA-3’)、SP12(5’-ACGACGCCGCTTGAGTG-3’)和SP13(5’-CCTTATAGACGCCAGCCACGA-3’)。第一次步移以试剂盒提供的AP2引物作为上游引物，SP1、SP2、SP3引物分别作为下游引物利用油菜品系R2的基因组DNA进行3轮热不对称PCR反应。最后一轮产物经回收纯化，并与T-载体连接，测序发现其长度为1018bp。由于序列较短，再次在已测序序列的基础上进行第二次步移。第二次步移以试剂盒提供的AP4引物作为上游引物，以SP11、SP12、SP13引物分别作为下游引物进行3轮热不对称PCR反应。第3轮PCR引物测序后表明其序列长度为1431bp。由于两次步移之间存在着重复序列，根据重复序列拼接后获得共2339bp的前导序列。(具体PCR过程严格按照试剂盒说明进行。PCR产物电泳检测、回收、克隆、测序同上。)
2.2果胶裂解酶BnPL基因启动子的载体构建
利用油菜品系R2的基因组DNA为模板，根据获得的2339bp前导序列设计引物组合MQ-promoter-5-101和MQ-promoter-3-3进行PCR，Mq-promoter-5-101:(5’-CATCGATGTGCTGATACCAGCGTAGTCA-3’)；Mq-promoter-3-3:(5’-CTCTAGATTTTTTTAATTTGATTACCCCTTTTTGCT-3’)，验证Genome-walking得到的启动子序列的真实性。PCR扩增体系为：共20μL反应体系，含10.75μL的ddH2O,2μL的10×ExTaq buffer,2μL的2.5mmol/L dNTP，2μL的MgCl2(25mM),1μL的10mmol/LPCR引物，1μL100mmol/L的cDNA，0.25μL的Takara Ex Taq(5U/μL)。反应条件为：95℃，2min；94℃，30s,60℃，30s,72℃，3min，共34个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，回收所得片段进行克隆和测序。结果表明步移的序列与通过常规PCR扩增得到的序列相同，由于引物MQ-promoter-5-101和MQ-promoter-3-3扩增的序列长度为1955bp，利用在线启动子分析软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html预测，表明此片段具备启动子的基本特征，能代表果胶裂解酶BnPL的启动子序列。
实施例3BnPL基因功能的原核表达验证
根据获得的BnPL的cDNA序列设计引物组合扩增BnPL基因的编码区，引物为：Mq-Pectate-5-1(5’-CGCGGATCCATGGAGACAGCTAGG-3’)和Mq-Pectate-3-1(5’-CCGGAATTCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3’)。模板为油菜品系R2的角果发育期cDNA，PCR扩增体系为：总共20μL反应体系，包含10.75μL的ddH2O,2μL的10×Ex Taq buffer，2μL的2.5mmol/L dNTP，2μL的MgCl2(25mM),1μL的10mmol/L PCR引物，1μL100mmol/L的cDNA，0.25μL的Takara Ex Taq(5U/μL)。反应条件为：95℃，2min；94℃，30s,60℃，30s，72℃，1min,共34个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，***到PEASY-E原核表达载体(本实验室保存)，通过PCR验证其***方向，菌落PCR检验阳性菌落。采用自身引物MQ-PL-5-1和MQ-FUL-PL-3-1进行测序，确定序列的正确性和完整性。正向***的载体转化大肠杆菌BL21，进行原核表达。先使用含有氨苄的LB平板筛选阳性单克隆，挑出单克隆接种到2ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃下过夜。取0.5ml过夜培养的菌液接种到50ml含AMP的LB液体培养基中37℃培养3小时，使其OD600达到0.5。加入IPTG使其总浓度达到1mM进行诱导表达，37℃下继续培养。取利用IPTG分别诱导2小时、4小时、6小时、8小时和10小时的样品各1ml，12000rpm离心0.5分钟，弃上清液，加入100ul的1倍的SDS上样缓冲液，震荡混均，沸水中加热5分钟，12000rpm离心0.5分钟后进行电泳，采用标准的SDS-PAGE电泳过程进行电泳。通过IPTG诱导后，对诱导液进行沉淀和电泳，表明重组蛋白生成了一个62kD大小的蛋白质，通过IPTG诱导2小时，4小时，6小时的重组蛋白都能产生目标蛋白。且通过超声波处理后，在沉淀和上清中都能检测出目标蛋白，说明重组蛋白属于可溶性蛋白。
利用Ni柱进行重组蛋白的纯化，主要过程为：将诱导培养的大肠杆菌进行离心收集，重悬在GuNTA-0buffer中，另外加入1mM的PMSF进行悬浮细胞，加入溶菌酶，4℃过夜消化，利用超声波破壁，10000rpm离心10分钟，将上清缓慢分段加入Ni柱进行纯化，纯化步骤按照说明书进行。
酶活性检测采用标准的半乳糖醛酸法，过程为：取0.5ml待测液加入2.5ml含0.3％的多聚半乳糖醛酸的0.07M的Tris-HCl(PH＝8)，并加入30ul0.1M的CaCl2,37度下反应半小时，然后加入0.lml的1MNaOH终止反应；沸水加热5分钟后，10000rpm离心2分钟，取上清测定232nm的吸光值。设置阴性对照，上述过程中不加待测酶液，其他过程完全和上述过程相同。通过Ni柱对可溶性蛋白进行纯化，并进行了酶活性测定，结果表明重组蛋白在Ca离子作用下具有典型的果胶裂解酶基因活性。
实施例4植物转化试验
主要是通过构建反义表达载体进行拟南芥和油菜的转基因实验，以验证BnPL基因的功能。构建过程如下：使用的引物组合为Fanyi-3-1:(5’-CGGATCCTTAGCATGGTTTTCCGACC-3’)和Fanyi-5-1:(5’-CCGGAATTCATGGAGACAGCTAGGCT-3’)。采用KOD Plus聚合酶(TOYOBO)，PCR体系为20μL，主要包含11μL的ddH2O，2μL的10×PCR buffer for KOD Plus，2μL的2mmol/LdNTP，1μL的25μmol/L MgSO4，1μL的PCR引物，1μL100mmol/L的cDNA，最后加入1μL KOD Plus(1U/μL)酶。反应条件为：95℃，2min；94℃，30s,60℃，30s,72℃，2min,共34个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，***到PMD18简易T载体中，经M13引物测序，确定序列的完整性后，利用BamHI/EcoRI对重组载体进行酶切，同时也利用BamHI/EcoRI对原始PBI121载体进行酶切，切除掉GUS基因序列。然后将带有BnPL基因的酶切片段亚克隆入PBI121表达载体，使外源基因序列取代载体中的报告基因GUS的位置。将重组的含反义目标BnPL基因的新PBI121载体导入农杆菌(EHA105)，通过花序浸染法转化野生型拟南芥，通过组织培养法转化油菜下胚轴。转基因植物的筛选采用含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基进行，并通过PCR进行验证，采用的引物组合为Kan-5和Kan-3，扩增的目标基因为卡那霉素基因，采用的PCR扩增体系为：Dream PCR MIX10μL(购自Fermentas)，DNA模板1μL,正反向引物各2μL(10μM/L),ddH2O5μL。反应条件为：95℃，2min；94℃，30s,60℃，30s,72℃，1min,共34个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。转基因阳性植株经过连续两代选择，T3转基因植株用作表型分析。
提取转基因植株花蕾的RNA，反转录获得cDNA，利用引物组合pectate-75-f和pectate-244-r检测含反义BnPL基因表达载体的转基因植株中的果胶裂解酶基因的表达量。对表达了该反义基因的植株进行表型鉴定，以野生型作为对照。与野生型拟南芥相比，在反义表达的转基因阳性拟南芥植株后代的角果出现了变异，多数植株的角果变短，角果黄熟后不马上开裂甚至延长放置时间也不开裂，整个植株长时间放置不发生角果开裂想象。而野生型拟南芥角果一旦成熟变黄就全部自然开裂。含反义BnPL基因表达载体的转基因油菜植株的角果形态变化较小，与非转基因对照相比，反义表达BnPL基因植株的角果长度略微变小。利用随机碰撞法鉴定发现转基因植株的角果抗裂角性明显增强，碰撞10分钟后，转基因植株的角果仅有少数破裂，而非转基因对照植株的角果几乎全部破裂。
实施例5启动子组织特异性表达验证
利用BnPL基因的启动子构建表达载体，构建过程为：先采用引物MQ-promoter-5-101和MQ-promoter-3-3以油菜品系R2的DNA为模板进行PCR，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，***到PMD18简易T载体中。经M13引物测序，确定序列的完整性后，利用ClaI/XbaI对重组载体进行酶切，同时也利用ClaI/XbaI对原始PBI121载体进行酶切，切除掉35S序列。然后将带有BnPL启动子的酶切片段亚克隆入PBI121表达载体中，使BnPL启动子取代PBI121载体中的35S启动子序列。
对转基因阳性植株进行GUS染色分析。GUS母液混合液的配制：总体积为1L，主要含有磷酸二氢钠15.601g；NaEDTA3.7224g，亚铁***211.2mg，铁***164.7mg，TritonX-1001ml，剩余体积用水补足，最后使用NaOH将PH值调整为7.0，置棕色试剂瓶于4℃冰箱避光保存。X-Glux的配制：称量0.06g的干粉溶于1.5ml的N,N-二甲基甲酰胺，锡箔纸包裹后置-20℃冰箱保存备用。
取阳性植株的不同组织置入10ml的离心管中，加入GUS母液混合液8ml，然后加入100μl的X-Glux溶液，再加入800μl的甲醇后，将植物组织完全浸没，在37℃下过夜。隔夜后倒掉染液，先用75％的乙醇对材料进行脱色，再用无水乙醇进行脱色，每隔1小时换一次乙醇，直至组织透明，一般需要2至3次，然后将组织置50％的乙醇中5分钟后，最后将透明的组织放入纯水中，显微镜观察组织染色情况。
观察结果显示在根，茎，叶中都没有检测出GUS活性，只在花和角果中检测到了GUS活性，在幼小花蕾期检测不到GUS活性，只有当花蕾开放后，在开放的花瓣和成熟的花药中才开始能检测到其活性，在角果期，在角果皮和DZ区都能检测到GUS活性。说明GUS活性只在生殖生长阶段的组织中检测到，而在营养生长阶段的组织中检测不到，表明BnPL的启动子具有组织特异性，主要调控基因在花药、柱头及角果中的表达，尤其是在角果中的表达，在角果皮、离区及未成熟角果顶端、角果与花托结合处表达量较高，这些都是与细胞分离密切相关的部位，推测BnPL基因的的功能与细胞的分离相关，在植物角果的发育中起着重要作用。
Claims (5)
1.一种果胶裂解酶BnPL基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种果胶裂解酶BnPL基因，其特征在于：所述的果胶裂解酶BnPL基因的表达蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.一种果胶裂解酶BnPL基因的启动子，其特征在于：所述的启动子核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求1所述的一种甘蓝型油菜果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性中的应用。
5.根据权利要求3所述的一种果胶裂解酶BnPL基因的启动子在植物角果发育调控中的应用。
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