【発明の詳細な説明】
植物における花の誘導の制御およびその使用法 発明の背景
高等植物は、栄養成長、そしてその後の生殖発達の期間からなる生活環を有す
る。被子植物における生殖は、花の誘導(喚起作用)で始まる発達プロセスである
。これは、茎頂***組織(根より上のほとんどの植物部分を生じる一組の***細
胞)が葉の産生を停止し、そして花の産生を開始する時点である。Bernier,G．(1
988)、花の喚起作用および形態形成の制御。Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mole
c.Biol．39：175-219。しかし、植物の開花を誘導する分子的および遺伝子的制
御については、ほとんど何も知られていない。
植物における調節エレメントについてのさらなる情報が非常に必要である。こ
れらのエレメントについての知識の増加により、遺伝子が植物において生殖発達
を誘導する基礎的な機構に関する我々の理解は著しく深まるだろう。発明の要旨
本発明は、トウモロコシ植物のId遺伝子またはId遺伝子機能を示すその一部を
含む単離されたDNAを同定および提供する。本発明はさらに、Idまたはid★対立
遺伝子のDNAおよびその一部によってコードされるRNA、ならびにアンチセンス(
相補的)DNAおよび/またはRNAあるいはその一部を提供する。a）50％より高い相
同性を示すか、または適度なストリンジェンシーの条件下で、Id遺伝子のジンク
フィンガー領域にハイブリダイズする、またはb）70％以上の相同性を示すか、
または適度なストリンジェンシーの条件下で、Id遺伝子にハイブリダイズし、そ
してId型(生殖期の開始)機能を示す、Id相同物またはその等価物といわれる核酸
もまた、本発明に包含される。さらに、他の植物における調節遺伝子を検出およ
び／または増幅するための核酸プローブおよびプライマーも含まれる。従って、
本発明のDNAは、Id遺伝子、またはその一部、配列番号１の全てまたは一部を含
むId遺伝子、または相同DNAを含む。
本発明は、さらに、本明細書中に記載のポリペプチドを含む植物起源のIdタン
パク質またはIdタンパク質の一部であるポリペプチドを含む。全ての植物種由来
のIdタンパク質、または類似の調節機能(生殖誘導)を示す相同物は、本発明に包
含され、そして本明細書中で使用される場合、用語Idタンパク質に包含される。
本明細書中に記載のアミノ酸配列に対して80％以上の相同性を示すアミノ酸配列
は、相同ポリペプチドと考えられる。
他の局面において、本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドに結合する抗
体に関する。このような抗体は、植物中の調節活性の部位を位置付けるのに使用
され得る。Idタンパク質と付加的ペプチド(例えば、タンパク質タグ)とを含む融
合タンパク質もまた、植物中のIdタンパク質／タンパク質相互作用の部位を検出
するために使用され得る。
さらなる局面において、本発明は、栄養段階から開花段階への移行の選択され
た時期を有する植物を産生する方法を提供する。出願人は、活性なAc転位因子が
存在する場合、植物に栄養成長を停止させ、そして他のid変異体より早く開花さ
せるid遺伝子の新規の対立遺伝子(id★)を作製した。本明細書中に示すように、
活性なAc因子を有するid★/id★植物は、より少ない栄養節(vegetative node)を
示し、そしてAc因子の無いid★/id★植物またはid対立遺伝子をコードする植物
より早く開花する。
本発明は、植物中での開花誘導を改変させる産物をコードするid遺伝子の新規
の変異体に関し、そしてトウモロコシ第１染色体に由来する4.2kbのId SacIフラ
グメントの一部のヌクレオチド配列を提供する。高度なストリンジェンシーの条
件下で、SacIフラグメントまたはその一部にハイブリダイズするDNA、および前
記DNAのいずれかから転写されるRNAまたは対応するRNAもまた含まれる。好まし
くは、DNAは、図４に示されるDNA(配列番号３)である。
別の局面において、本発明は、新規のid対立遺伝子を産生する方法および植物
中の他のId対立遺伝子または他の調節遺伝子を検出する方法を提供する。Id遺伝
子の相同物は、多細胞および単細胞藻類を含む植物界全体で同定され得る。
本発明のさらに別の局面は、植物、種子、植物組織培養物、および/または植
物の一部のその後の成長において、開花誘導のタイミングを改変させ、改変もし
くは外因的に導入されたId対立遺伝子またはId対立遺伝子の一部を含むDNAを含
有する植物、種子、植物組織培養物、および植物の一部を提供する。
本発明はまた、花の喚起作用の時期が改変されたトランスジェニック植物に関
する。発芽から開花までの期間が対応する天然に存在する植物または野生型(自
生種)植物よりも短いトランスジェニック植物が提供される。あるいは、開花が
遅滞するかまたは開花しない植物が提供される。本明細書中で使用されるように
、用語「トランスジェニック植物」は、野生型(自生種)植物もしくは公知の変異
体において存在しないDNAまたはRNAのいずれかまたは天然に存在するDNAの付加
的コピーまたは逆方向コピーを含む植物、および本明細書中に記載のように導入
された植物、ならびに花の喚起作用時期を改変された植物をもたらす上述の任意
の改変を含む植物を包含する。一つの実施態様において、このようなトランスジ
ェニック植物は、被子植物(単子葉植物および双子葉植物の両方)であるトランス
ジェニック植物を包含する。トランスジェニック植物は、DNAが導入されたトラ
ンスジェニック植物、および種子、栄養繁殖、細胞、組織培養物またはプロトプ
ラスト培養物などから産生されたそれらの子孫を包含する。
本発明のトランスジェニック植物は、花の喚起作用に不可欠なタンパク質の全
てまたは一部をコードするDNAを含み、そして、それが植物細胞に存在する場合
、改変した花の喚起作用（同一品種の非形質転換植物よりも早い栄養成長の停止
および開花の開始、またはより遅い開花または花の誘導の欠如のいずれか）を生
じる。DNAは、花の誘導に必要なタンパク質をコードするセンスまたはアンチセ
ンス方向における外因性DNAまたは花の誘導に必要なタンパク質の改変形態をコ
ードするような様式で改変されている外因性DNAであり得る。開花の開始を担う
植物の内因性DNAの特異的変異誘発または標的化変異誘発もまた、改変された花
の誘導を生じる。花の喚起作用に必要な改変タンパク質をコードする外因性DNA
および特異的変異誘発によって変異している花の喚起作用に必要な内因性DNAは
、これらの配列が少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加を含
み、そして少なくとも１つのアミノ酸残基によって、対応する野生型タンパク質
と異なるタンパク質をコードするので、対応する野生型(天然に存在する)DNAと
は異なる。(本明細書中で使用されるように、用語「ヌクレオチド」は、「核酸
」と
交換可能に使用される。)遺伝子エレメント(例えば、活性なAc配列を有するまた
は有さないDs配列)の挿入は、特に有用である。
外因性DNAは、周知の方法(例えば、Agrobacterium介在性形質転換、マイクロ
プロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment)、マイクロ
インジェクション、またはエレクトロポレーション(以下を参照のこと))により
、標的植物の植物細胞内に導入される。導入された外因性DNAまたは特異的な変
異誘発によって変異された内因性Id DNAを保有するこのような細胞は、花の誘導
を改変したトランスジェニック植物の再生のために使用され得、従って、種子産
生または種子を用いない無性生殖手段(すなわち、挿し木、組織培養など)のいず
れかによって付加的植物の供給源となる。
本発明はまた、改変された花の誘導時期を有する植物、改変された花の誘導を
生じる植物中に存在する外因性DNAまたはRNA、および改変された花の発達を有す
る組換え植物を産生するのに有用なDNAまたはRNAを含有するベクターまたは構築
物を産生する方法に関する。花の誘導に必要なタンパク質をコードする外因性DN
AまたはRNA(例えば、センス方向のId DNA)、または花の発達に必要なタンパク質
の改変形態をコードするような様式で改変されている外因性DNA(例えば、改変さ
れたid★DNA)を含有する植物によって産生された種子もまた、本発明の主題であ
る。
本明細書中に記載の研究は、Id遺伝子、ゲノム配列、またはその一部を利用可
能にする。これは、出願人により決定され、そして植物の開花の誘導において重
要な役割を持つ。この遺伝子は、単子葉植物、特に、最も商業的に貴重なイネ科
植物の一つであるトウモロコシに由来する。この遺伝子によりコードされるポリ
ペプチドは、トウモロコシにおいて、栄養成長から生殖器官の発達への切り替え
を起こす調節タンパク質である。さらに、多くの他の植物におけるように、トウ
モロコシにおいて、このタンパク質の効果は、これらの植物における老化の開始
を示す。
コーンは、小麦に比べてより多くの降雨を必要とし、そしてほとんどのトウモ
ロコシ栽培品種は、長期の生長期を必要とする。本明細書中に記載の研究はまた
、トウモロコシの生長を可能にし、そして開花前に長い生長期を必要とする他の
緯
度依存性植物が、短い生長期を有する地理的地域において生長し得る。従って、
この植物は、開花を誘導され得、そして最初の霜の前に種子をつける。同様に、
開花誘導は、長期の温暖な気候を有する地域で生長する短季の植物について延期
され得る。過剰の栄養量(vegetative mass)および炭水化物の結果として、これ
らの植物は、より多くのおよび／またはより大きい花を生産し得、その結果より
多くの種子を産生し得る。または、植物は、開花を防げられさえもされ得、それ
ゆえ栄養価の高いサイレージ生物量を提供し得る。
別の局面において、本発明は、トウモロコシとモロコシのハイブリッドの産生
において雄穂除去の必要性を排除する手段を提供する。図面の簡単な説明
図１は、indeterminateおよびBz2(bronze穀粒色素形成)遺伝子の位置、ならび
にDs2のトランスポゾン挿入の部位を示す第１染色体の地図である。
図２は、Id遺伝子のDNAを含むゲノム配列(配列番号１)である。
図3A〜3Fは、図２のゲノム配列および推定アミノ酸配列ａ、ｂ、およびｃ(そ
れぞれ、配列番号４、５、および２)である。Ds2トランスポゾン挿入は、ヌクレ
オチド168で起こる。
図４は、Id遺伝子の一部を含有する4.2kbのSacIフラグメントの保存されたモ
チーフの制限地図である。Ds2トランスポゾン挿入の位置および制限部位NsiIとS
acIとの間のゲノム配列(配列番号３)を示す。
図５は配列番号３によってコードされるポリペプチド配列(配列番号４)を示す
。(タンパク質配列の一部を示すORFはまた、ジンクフィンガータンパク質と相同
性を示す部分である。)
図６は、トウモロコシId遺伝子ORFと真核動物種の公知のジンクフィンガータ
ンパク質との比較である。
図７は、Id遺伝子ORF由来のDs2の切除によって産生されたフレームシフト、そ
の結果生じた２つのヌル(null)変異体(id-X1およびid-X2)を示す。
図8A〜8Bは、トランスジェニック単子葉植物(図8A)またはトランスジェニック
双子葉植物(図8B)の産生のために、弱いプロモーターをId cDNAと融合させ、早
期に開花する系統の開花を遅延させるIdアンチセンス構築物の概略図を示す。
図9A〜9Bは、トランスジェニック単子葉植物(図9A)またはトランスジェニック
双子葉植物(図9B)の産生のために、構成的プロモーターをId cDNAと融合させ、
遅く開花する系統に早い開花を誘導するIdセンス構築物の概略図を示す。
図10A〜10Bは、トランスジェニック単子葉植物(図10A)またはトランスジェニ
ック双子葉植物(図10A)の産生のために、干ばつ誘導性プロモーターをId cDNAと
融合させ、干ばつに応答して開花を遅延させるIdアンチセンス構築物の概略図を
示す。
図11A〜図11Dは、開花しないかまたは開花を遅延させたトランスジェニック植
物の産生のために、GAL4結合部位(GB)を単子葉植物(図11A)または双子葉植物(図
11B)におけるId cDNAと融合させたIdアンチセンス構築物、およびGAL4遺伝子を
単子葉植物(図11C)または双子葉植物(図11D)における強いプロモーター(CaMV 35
S)または弱いプロモーターに融合するIdアンチセンス構築物の概略図を示す。発明の詳細な説明
生殖成長の間、植物は、受精に達する花の発達のプログラムに入り、その後種
子を産生する。老化は、引き続いて起こることもあり、または起こらないことも
ある。トウモロコシ植物(またはその近縁系統、モロコシ)は、通常、特定の数の
栄養構造(例えば、葉)を生産し、その後生殖構造(花)を産生し、そして結局植物
の老化を受けるようにプログラムされている。しかし、Id遺伝子のindeterminat
e(id)変異についてホモ接合体であるトウモロコシ(Zea mays)植物は、このプロ
グラムの実行において欠陥があり、そしていくつかの発達表現型を示す：1)栄養
から生殖への移行は、栄養期が延長され、結果として長い(または不確定の)寿命
を有する植物(すなわち、それらは通常の植物よりずっと遅く開花するか、また
は全く開花しない)ように改変され；2)栄養期は、発達の生殖期に拡張し、そし
て異常な花の発達を起こす；すなわち、雌性の花(雌穂)は、栄養特性を示し、そ
して通常不稔性であり、そして雄性の花(雄穂)は、花の組織の特性を有する組織
から新規の発育枝を発生するように完全な発達復帰を受け得る。後者の場合、花
の組織を含む末端で分化した細胞が、栄養組織に再分化し、そして増殖性成長を
再開する。Singleton,W.R.、J.Heredity,37:61-64(1946)；Galinat,W.C.およびN
aylor,A.W.（1951）Am.J.Bot．38:38-47。これらの表現型は、正常なId遺伝子の
機能が、植物の生活環における特定の期間で栄養成長を抑制し、そして生殖成長
の開始のシグナルを送ることを示唆する。Id機能の欠如は、この移行を作製し損
ない、そして栄養発達の延長を引き起こす。
従って、正常なId機能は、トウモロコシにおける栄養から生殖への移行(すな
わち、花の誘導または喚起作用)において重要である。遺伝子データおよび分子
データは、トウモロコシおよび他の植物において、Id遺伝子が栄養発達から生殖
発達への切り替えにおける重要な役割を果たす調節タンパク質をコードすること
を示唆する。この調節のメカニズムを理解することは、本来の内部コントロール
または環境の効果とは無関係に開花し、そして種子を産生するように設計された
特殊化した植物を産生するための基礎を提供する。実際、Id遺伝子の相同物を利
用する同一のメカニズムが、無種子植物(non-seed plant)(例えば、藻類)におけ
る胞子産生を制御することが可能である。
用語「Id」は、トウモロコシの正常な(野生型)遺伝子を意味する；一方、「id
」は、Id遺伝子の改変された(変異体)形態をいう。植物における生殖期の開始を
引き起こすポリペプチドをコードする植物の単離DNAは、ゲノムDNAまたはcDNAで
あり得る。本発明に含まれるDNAは、単子葉植物(イネ科植物)由来である；特記
されるものは、トウモロコシ由来のId遺伝子である。
出願人は、1.3kbの転位因子Dissociation(Ds)のId遺伝子への挿入によって正
常なId遺伝子の機能の破壊を生じるid変異の新規の対立遺伝子を作製した。次い
で、変異id遺伝子(id★)の一部を含むクローンを、タグとしてDsを用いるトラン
スポゾンタギングの技術によって単離した。Hakeら、EMBO J.、８：15-22(1989)
：Federoffら(1984)PNAS 81:3825-3829。遺伝子(id★およびId)の一部の予備的
な配列分析は、Idが全ての真核生物に見出される転写因子のクラスに相同である
領域を含むことを示す。
転位遺伝因子(トランスポゾン)は、生物のゲノム中を所々に移動する一片のDN
Aである。これは、ある部位から切除され、そして別の部位(同じ染色体上または
異なる染色体上のいずれか)へ挿入される。転位因子の移動は、変異または染色
体の再配列を生じ得るので、他の遺伝子発現に影響し得る。
トランスポゾンAcおよびDsは、トウモロコシ中に存在する関連する転位因子の
ファミリーを構成する。Mobile DNA M.HoweおよびD.Berg編、Washington: ASM p
ress中、Fedoroff,N．（1989）Maize Transposable Elements.。Acは、別の部位
(同一の染色体上または異なる染色体上のいずれか)へのそれ自身の転位またはDs
の転位を促進し得る。Dsは、Acが同一の細胞内に存在しない場合、移動し得ない
。Acは自律性転位因子であり、そしてDsは、同一のファミリーの非自律性因子で
ある。
遺伝子の遺伝子座へのDsの挿入は、その遺伝子座での変異を生じる。例えば、
トウモロコシ穀粒中のＣ遺伝子座は、紫の色素の合成に必要な因子を生成する。
遺伝子座中のDs因子の挿入は、遺伝子を不活化し、穀粒を無色にする。しかし、
この変異は不安定である。活性なAc因子の存在下で、Dsはいくつかの細胞中の遺
伝子座から転位され、着色された細胞のセクター(sector)を生じ、その結果紫色
の斑点のある穀粒になる。
出願人は、Ds転位因子であるDs2の誘導体を使用して、Id遺伝子の新規変異体
を作製した。これは、第１染色体上の近くの遺伝子からのDs2の切除（活性なAc
の存在下での）、およびId遺伝子へのDs2の引き続く挿入により達成され、Id★
を作製した。
数世代の異系交配および戻し交配により、id★は活性なAc因子を伴うかまたは
伴わずに遺伝的背景に導入された。これらの実験からのデータは、活性なAc因子
を有するid★/id★植物は、Acを有しないid★/id★植物またはId植物ほど厳密で
ない表現型を有する；すなわち、これらは、栄養節（vegetative node）がより
少なく、そしてより早く開花する。この結果は、Ac因子が、成長の間、id★対立
遺伝子からのDs2因子の体細胞での切除を媒介する場合に予測される。切除は、I
dの機能を回復させ、そして正常な発達の部分的な回復をもたらす。さらに、こ
れらの植物が明瞭なセクタリングのパターン（すなわち、変異組織に並置する正
常組織の鮮明な境界）を示さないという観察は、Idが非細胞自律的に作用するこ
とを示唆する。この結果は、Id遺伝子産物が、それ自体拡散可能な因子であるか
、または拡散可能な因子の産生を調節するかのいずれかであることを意味する。
id★植物の開花に対するAcの効果を研究した上記の実験は、トウモロコシ植物
の開花時期が利用可能なid遺伝子産物の量によって量的に制御され得ることを実
証する。これらの系統由来の野生型（Id）植物は、植え付け後９〜11週で開花し
た。id★に関してホモ接合体の植物は、Acが存在しない場合、25週間後（この時
、霜のために実験を終了した）でも開花しなかった。id★に関してホモ接合体で
あり、かつAcも有する植物は、およそ15〜22週で開花した。Dsの切除は、Acの存
在によりこれらの植物で起こる。これらの切除は、Idの機能を回復させ、そして
この植物を、Acを有しない植物よりも早く開花させるには十分なId遺伝子産物を
もたらすが、野生型植物と同程度に早く開花させるには不十分なId遺伝子産物を
もたらす。開花時期の広い範囲は、おそらく、植物毎のDs切除のタイミングおよ
び頻度の本質的な可変性を反映する。Fedoroff(1989)、前出。
別の実験は、id★植物に対するAc効果をより綿密に試験した。Ac因子は、「負
の用量」効果を示す；すなわち、１コピーのAcは、２コピー以上のAcよりも多く
のDs切除を生じる。Fedoroff(1989)前出。id★植物におけるAc用量の効果を、id★
についてホモ接合体であり、かつAcなし、ゲノムあたり１つのAc、または２つ
以上のAc因子を保有する種子を植え付けることにより決定した。利用可能なId産
物の量が開花を制御するならば、２つ以上のAc因子を含有するid★植物は、１つ
のAc因子を有するid★植物よりも遅く開花するが、Ac因子を有しないid★植物よ
りも早く開花することが期待された。この実験を、野生型のコントロールが12〜
13枚の葉を生じた後に開花する温室条件下で行った。Ac因子を欠如するid★植物
はいずれも、24枚の葉が生じた後でさえも、開花しなかった。２つ以上のAc因子
を含有するid★植物のうち、12.5％が21〜23枚の葉を生じた後に開花し、一方、
これらの植物のうちの87.5％が24枚の葉が生じた後でさえも開花しなかった。対
照的に、１つのAc因子を含有する植物の90％が、16〜24枚の葉が生じた後に開花
した。この結果は、１つのAc因子を含有するid★植物（最も多数のDs切除を伴い
、従って、最も多量のId産物を有する植物）は、１つより多くのAc因子を有する
植物よりも早く開花する（しかし、野生型植物ほど早くはない）ことを実証する
。この結果はまた、例えば、異なる用量のAcによりDs切除の頻度が変化すること
によって、機能的なId遺伝子産物の量が変化することは、開花時期の量的な変動
を
誘導し得ることを示唆する。
Ds2因子をプローブとして用いるサザンブロット分析により、試験した120より
多くの異系交配子孫において、4.2kbのSacIフラグメントがid★対立遺伝子と同
時に移動することが示された。このフラグメントは、id★対立遺伝子を保有しな
い植物には存在しない。このフラグメントがid★対立遺伝子を伴って分離される
ことは、この遺伝子がDs2トランスポゾンでタギングされていることの証拠であ
る。このフラグメントを、SacIで切断したゲノムDNAのアガロースゲルでの分離
、およびこのフラグメントを含有するゲル領域の切り出しにより単離し、そして
プラスミドベクター中にサブクローニングしてこの領域のゲノムDNAのサブライ
ブラリーを作製した。この因子を保有する特定のクローンを、サブライブラリー
をDs2プローブを用いてプローブすることにより同定した。解析した60,000クロ
ーンから、１クローンが、4.2kbのSacIフラグメントを含有することが見出され
た。制限分析により、この組換えクローンは、トウモロコシDNAに隣接する（fla
nking）Ds2フラグメントを有することが示された：Ds2因子の一方に対する165bp
のDNAおよびこの因子の反対側での2.8kbのDNA（図４）。この隣接する領域のい
ずれかをプローブとして用いる種々の植物由来のDNAのサザンブロットは、id★
対立遺伝子についてホモ接合体である植物は4.2kbの単一のSacIバンドを含むが
、正常なDNAのみを含有する植物は単一の2.9kbのSacIフラグメントを有すること
を示した。従って、4.2kbのフラグメントは、2.9kbのSacIフラグメントへの1.3k
bのDs2因子の挿入の結果である。ヘテロ接合体の植物は、両方のバンドを含有す
る。
id★および他のid変異体のさらなる分析は、これらの変異体が正常なId遺伝子
の変異であることを実証している。この変異は、一般的にId遺伝子配列内の異な
る部位での遺伝子エレメントの挿入または欠失、あるいはId遺伝子自体の全てま
たは一部の欠失により生じる。id-Rと同定された第１のid対立遺伝子を保有する
変異植物由来のDNAは、隣接するプローブのいずれに対してもハイブリダイゼー
ションを示さなかった。このことは、元の対立遺伝子がId遺伝子の欠失の結果で
あることを示す。別のid対立遺伝子であるid-Compeigneは、このフラグメント中
に３kbの挿入を有するようである。これらの結果は、本出願人が、Ds2を用いてi
d遺伝子をタギングしたという納得のいく証拠を提供する。
Id遺伝子のDs2因子に直ぐ隣接するDNAの配列分析により、トランスポゾンが挿
入されたオープンリーディングフレーム（ORF）が明らかになった（図４）。こ
のORFを含む隣接するDNAフラグメントを用いてRNAブロットをプローブした場合
、約2.0〜2.2kbのバンドが、頂端***組織由来のpolyA+ RNA、およびより少ない
程度ではあるが、成熟した葉において明白であった。ハイブリダイゼーションは
、実生のRNAではほとんど検出されず、そして根由来のRNAでは全く検出されなか
った。これは、このORFが転写物をコードし、そしてこの転写物が特定の植物組
織で差別的に発現されることを示す。
このORFによってコードされる推定アミノ酸配列の分析は、このORFがId遺伝子
の一部であり、そして植物発達に重要な役割を果たすというさらなる証拠を提供
する。このORFと、最新のデータベース中の全てのタンパク質との比較により、
このORFが多くの異なる真核生物（ヒト、マウス、カエル（Xenopus）、およびシ
ョウジョウバエ（Drosophila））において同定された「ジンクフィンガー」様タ
ンパク質と顕著な相同性を有することが示される（図４）。ジンクフィンガータ
ンパク質は、亜鉛含有DNA結合ドメインを利用する多様な真核生物転写因子のク
ラスとして知られ、そして発達の重要な調節因子である。McKnight，S．L.およ
びK．R．Yamamoto編(1992)Transcriptional Regulation．Cold Spring Harbor L
aboratory Press，Cold Spring Harbor，New York、第１巻、580頁。ジンクフィ
ンガータンパク質は、他の遺伝子の転写を媒介することによって調節機能を発揮
する。
本明細書中に記載の結果は、Id遺伝子が植物発達の決定的な点（すなわち、栄
養成長から生殖成長への移行）において重要であること、およびId遺伝子が花の
発達に必要とされる他の植物遺伝子の発現を制御することによって機能すること
を示す。それは明らかに「スイッチ」であり、そしてトウモロコシにおいては他
の何ものも、植物の健康状態および成長力に影響を与えることなくその効果（開
花の誘導）を生じない。逆に、Idの変異は、開花の誘導のみを変化または阻害す
る；他の点では、変異体は健康でかつ良好に生長する。
クローン化されたDNAフラグメントがId遺伝子の一部であるというさらなる証
拠が、元のid★対立遺伝子からのDs2因子の不正確な切除により２つの新規のid
対立遺伝子を作製することによって得られた。id★とは異なり、これらの新規の
対立遺伝子は、もはやAcに応答しない；それらは、全く開花しないようであるヌ
ル変異体である。配列分析は、それらが、Ds2の切除により引き起こされたIdオ
ープンリーディングフレームにおけるフレームシフトをもたらす変化した配列を
有し（図７）、そしてそれゆえ、Id遺伝子と同じポリペプチドをコードしないこ
とを示す。
図７は、正常なId ORFの一部のDNA配列およびアミノ酸配列、ならびにDs挿入
および切除の結果としてのその変化を示す。Dsトランスポゾンの挿入により生じ
るid中のid-Ds変異は、Ds挿入に典型的な８bpの標的部位重複（下線）を示す。
ヌル変異体（id-X1およびid-X2）は、Ds2の切除から生じるidの安定な、派生的
な対立遺伝子である。id-X1対立遺伝子は、７bpの残存する重複部位および１つ
の変化した残基（TからAへ）を有する。id-X2対立遺伝子は、id-X1と同じTからA
への転位とともに５bpの残存する重複部位を有する。生じたアミノ酸残基はORF
中でフレームシフトを示す。
4.2kbのSacIフラグメントを保有する完全なクローンを分析し、そしてDs2因子
に隣接するゲノムDNAの完全な配列（配列番号１）を、本明細書中に提供される
情報および当業者に公知な分析方法を用いて決定した（図２）。2930ヌクレオチ
ドの配列が、Id遺伝子のDNAを含む。このDNAによってコードされる推定アミノ酸
配列（配列番号２）を、配列（ｃ）として図3A〜3Fに示す。
配列番号１のヌクレオチド１から少なくとも1890まで（あるいは2150まで）が
転写される。ヌクレオチド176〜1600はイントロンを表す。Ds2トランスポゾン挿
入のおよその部位は、ヌクレオチド168である。前出のNsiI制限部位とSacI制限
部位との間に位置するORF（配列番号３）は、図3A〜3Fの１〜140位のヌクレオチ
ドによって表される。（注意：図５に示すDNA鎖は、図3A〜3FのDNA鎖と相補的で
ある）
植物の生殖能は、種子を産出する能力に直接影響する。従って、開花時期を制
御する能力は、植物の生活環における重要な要因である。本明細書中で記載する
トウモロコシのid変異の遺伝的研究は、Id遺伝子が開花への移行に必要とされる
タンパク質をコードすることを示す。トランスポゾンタギングの使用により、本
出願人は、Id遺伝子、特にこの遺伝子のジンクフィンガー調節領域の一部を単離
し、そして特徴付けした。さらに、分子解析および真核動物の調節タンパク質と
の比較により、この領域によりコードされるポリペプチドが、開花の開始を制御
し、そしておそらく、裸子植物および下等植物（藻類を含む）の栄養成長期から
生殖成長への移行をも制御する、調節Idタンパク質の一部（たとえ、その主要成
分でなくても）であることが示される。
本発明により提供されるDNAを用いて、Id遺伝子と機能において類似の開花に
関する調節遺伝子をコードする他の植物種由来の相同な核酸を単離し得る。この
文脈において、相同性は、少なくとも50％の全体の配列同一性、好ましくは、Id
対立遺伝子のジンクフィンガー部分に関して70％以上の同一性を意味する。他の
植物種のId型遺伝子（Idの相同物）の同定および単離は、当業者に公知の標準的
な方法および手順によって達成される。例えば、Sambrookら、(1989)Molecular
Cloning - A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold
Spring Harbor，NYを参照のこと。本適用の例としては、下記の実施例５中に見
出される。
これらの技術および他の類似の技術を用いることにより、当業者は、容易に、
トウモロコシの異なる細胞および組織中のId遺伝子だけでなく、他の植物種由来
のId対立遺伝子の相同物もまた単離し得る。例として、植物中のId遺伝子は、植
物種のゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製し；配列番号１の全て
または一部または相同物を用いてゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを
プローブし；ハイブリダイズした配列を同定し；そしてハイブリダイズしたDNA
を単離してその植物のId遺伝子を得ることによって同定され得る。一旦同定され
ると、これらの遺伝子は制限地図が作製され、配列決定され、そしてクローン化
され得る。詳細には、ジンクフィンガー領域またはそのフラグメントは、他のジ
ンクフィンガー領域に対する保存された相同性のために、プローブとして特に効
果的である。長さが20bp程度の短いフラグメントが、他のジンクフィンガー領域
にハイブリダイズさせるために使用され得る。
ハイブリダイゼーションとは、Ausubelら(1994)Current Protocols in Molecu
lar Biology、補遺26、John Wiley & Sons，Inc.，New York，NYに記載される
方法に従って、適度なストリンジェンシーの条件下で相補的ポリヌクレオチドを
検出するためのハイブリダイゼーション分析においてDNAおよび/またはRNAを用
いることを意味する。
開花の開始以外の現象を調節する他のジンクフィンガータンパク質が、トウモ
ロコシおよび他の植物において存在し得る。調節遺伝子は、いくらかの可能性を
示すために、種子の発芽、植物の高さおよび形態、葉の数、および果実の成熟を
制御し得る。これらの遺伝子ならびに植物の生殖期の開始を担う遺伝子の単離お
よび特徴付けは、一般に、花卉生産、食物生産、および作物生産において非常に
重要であり、かつ価値がある。植物におけるこのようなジンクフィンガー遺伝子
は、植物種のゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを調製し；ハイブリダ
イズしたDNAを同定する相補的DNAのハイブリダイゼーションに適切な条件下で、
本明細書中に記載のId遺伝子（例えば、配列番号１）の全てもしくは一部または
相同物を用いて、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーをプローブし；そ
してハイブリダイズしたDNAを単離してその植物のジンクフィンガー遺伝子を得
ることにより、同定され得る。次いで、ジンクフィンガー遺伝子は制限地図が作
製され、配列決定され、そしてクローン化され得る。
本発明はまた、種々の手段（トランスポゾン、部位特異的変異およびランダム
変異、ならびに操作されたヌクレオチド置換、欠失または付加を用いる変化を含
むが、これらに限定されない）によって変化した構造を有する核酸およびポリペ
プチドを提供する。
植物において変化した機能を有するId遺伝子の対立遺伝子を作製するトランス
ポゾン法は、以下の工程を包含する：Dsトランスポゾンまたは別の非自律性転位
因子をId遺伝子中に挿入する工程、および次いでAcトランスポゾンまたは別の自
律性転位因子を用いてDsトランスポゾンを切除し、変化したId対立遺伝子を植物
中で作製する工程。
植物中で変化した機能を有するId遺伝子の対立遺伝子を作製する方法のさらな
る例には、分子遺伝的技術（例えば、部位特異的変異誘発）を用いてインビトロ
でId遺伝子の分子構造を変化させ、次いで、植物中に変化したId遺伝子を挿入し
て植物中で変化したId対立遺伝子を作製することが包含される。
これらの技術は、対応する天然に存在するタンパク質とは劇的に異なる機能を
示すId相同物を生じ得る。例えば、部位特異的変異を用いてアミノ酸残基の特定
の置換物をコードするId対立遺伝子を作製し得、次いで機能的な遺伝子（その遺
伝子産物は植物中で生殖応答を誘導する）を作製するために、どのアミノ酸が必
要であるかを決定し得る。同様に、Id対立遺伝子を操作して、新規の機能（例え
ば、天然に存在する植物の開花誘導より早い開花誘導）を有するタンパク質を作
製し得る。
生長する環境条件に依存して広範に開花時期を進化させた多品種のトウモロコ
シが存在する。詳細には、昼の長さ（緯度により決定される）が、植物が開花す
る時期を決定する。Id遺伝子は、これらのトウモロコシ変異体の全てにおける開
花時期の決定因子であり、そして開花時期は、Id遺伝子産物の特定の変異に相関
し得る。実際、Id遺伝子は花の喚起作用の主要な決定因子であり得る。
Id遺伝子またはその相同物を変化させ、そしてトウモロコシ植物に導入して特
定の型のトウモロコシの開花時期を変化させ得る。その結果、親株が発育した緯
度とは異なる緯度においてそのトウモロコシ植物は生長し得る。従って、操作さ
れたId遺伝子を、他の特徴（例えば、高収量および耐病性）に関して交配したト
ウモロコシの系統中に組み込み、多くの異なる緯度で生育し得るトウモロコシの
系統を作製し得る。アンチセンス構築物または共抑制（下記を参照）を用いてId
タンパク質のレベルを低下させることは、開花時期を遅延させ得、一方、過剰発
現によるIdのレベルの増加またはこのタンパク質のより早い時期の産生（異なる
プロモーターに結合されたId遺伝子）によるその増加は、植物をより早く開花さ
せるように誘導し得る。さらに、異なる誘導性プロモーターの制御下にセンスま
たはアンチセンスのId遺伝子を置くことにより、特定の環境条件に供されるかま
たは化学物質を適用された場合、開花時期を制御することが可能になり得る。
共抑制とは、内因性遺伝子または導入遺伝子（トランスジーン）の過剰発現を
いう。ここで、この遺伝子の過剰なコピーが内因性遺伝子ならびにトランスジー
ンの同等の休止（silencing）をもたらし、それにより、特徴の減少された発現
または排除された発現をもたらす。例えば、Jorgensenら、米国特許第5,034,323
号および同第5,283,184号を参照のこと。トランスジーンはセンス方向で導入さ
れ、そして完全長配列、または抑制されることが意図される内因性配列に対して
完全に相同である必要はない。
内因性遺伝子の発現はまた、内因性遺伝子を転写する鎖に対して相補的なDNA
鎖の配列と同一な配列または相同な配列を有するオリゴヌクレオチドの組み込み
を介して抑制され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内因性遺伝子から
転写されるRNAに安定的に結合し、それゆえ翻訳を阻止するRNAを提供するヌクレ
オチドの特定の配列を含む。Shewmakerら、米国特許第5,107,065号を参照のこと
。
「リボザイム」と呼ばれる本発明の他のオリゴヌクレオチドを使用して開花を
阻害または阻止し得る。アンチセンスおよびRNA、DNA、またはタンパク質に結合
する他のオリゴヌクレオチドとは異なり、リボザイムは、標的RNA（例えば、内
因性Id遺伝子の転写産物）に結合し、そしてそれを特異的に切断し得る触媒RNA
分子である。特定の部位で切断するように設計されたリボザイムは、このような
RNA分子を不活性化し得る。従って、Id産物の減少は、エンドヌクレアーゼ様式
（endonucleolytic manner）で内因性Id遺伝子の転写物を特異的に切断するよう
に設計されたリボザイムをコードするDNAの導入により達成され得る。
リボザイムの既知のクラスの中で、グループIイントロンおよびハンマーヘッ
ドリボザイムは、Id転写物の標的化切断のために転換するのに有用な候補である
。なぜなら、それらは短い（４〜12塩基の）認識配列を有するからである；しか
し、他の型のリボザイムがId mRNAの部位特異的切断のために開発され得る。Cec
h，T. R.（1988）J．Amer．Med．Assoc．260:3030-3034を参照のこと。
開花を遅延させるかまたは完全に破壊するための上記のストラテジーは、アン
チセンスおよび類似の技術の使用に依存する。「ドミナントネガティブ（domina
nt-negative）」変異タンパク質の使用に基づく代替的なストラテジーが考案さ
れ得る。調節タンパク質を非機能的にするが、変異タンパク質が野生型タンパク
質と標的に関して競合することを可能にする、特定の型の変異が調節タンパク質
に導入され得る。非機能的タンパク質によるこのような競合は、変異タンパク質
の過剰発現を用いて野生型タンパク質の活性を抑制し得ることを意味する。ジン
クフィンガー転写因子のドミナントネガティブ変異は、活性化/サイレンサード
メインを欠失する一方、DNA結合ジンクフィンガードメインを保持することによ
り、ショウジョウバエおよびヒト細胞において構築されている。過剰発現された
変異タンパク質はそれゆえ、DNA標的に非生産的に結合することによって野生型
タンパク質と競合する。O'Neill，E．M.ら、(1995)Proc．Nat'l．Acad．Sci．US
A 92:6557-6561。植物において、ドミナントネガティブストラテジーは、他の型
の調節タンパク質でうまく用いられている。Boylan，M.ら、(1994)Plant Cell 6
: 449-460; Rieping，M.ら、(1994)Plant Cell 6:1087-1098;およびHemerly, A.
ら、(1995)EMBO J，14:3925-3936を参照のこと。
Idタンパク質のドミナントネガティブ変異は、ジンクフィンガードメイン（推
定的なDNA結合ドメイン）をコードする配列のみを含み、そして活性化ドメイン
を欠如しているId遺伝子の端切断型を用いることによって構築され得る。この端
切断化遺伝子が強力なプロモーターの制御下でトウモロコシ植物に導入される場
合、開花が著しく遅延されるか、または開花できないいずれかのトウモロコシ植
物をもたらす。従って、端切断化ドミナントネガティブId遺伝子は、本明細書中
に記載される開花を遅延させるために用いられる構築物の全てにおいて、アンチ
センスId遺伝子に置換され得る。
ドミナントネガティブId遺伝子のアプローチは、トウモロコシ以外の作物中に
遅延された開花を操作する場合、アンチセンス構築物を上回る利点を有する。ア
ンチセンスストラテジーは、各作物種由来のId遺伝子の一部または全ての最初の
クローン化、次いで逆方向でのこれらの遺伝子の発現に依存する。アンチセンス
抑制は、相補的ヌクレオチド配列の発現に依存する。相補的配列は作物種毎に異
なる。対照的に、ドミナントネガティブストラテジーは、タンパク質の機能的な
保存およびその標的部位のみに依存する。全体的に、これは、ヌクレオチド配列
の保存ほど必要条件がずっと厳重でない。転写因子をコードする調節遺伝子のい
くつかの公知の例は、植物の非常に広範な種において発現された場合、類似の機
能を行なう。例えば、Lloyd，A．M.ら、(1992)Science 258: 1773-1775; Irish,
V．F.およびY.T．Yamamoto（1995）Plant Cell 7:1635-1644を参照のこと。こ
の型の機能的な保存は、トウモロコシId遺伝子のドミナントネガティブ型が他の
作物種においても同様に作用し得ることを意味する。これは、他の穀物種、およ
びおそらく全ての単子葉植物において機能することが確かに期待され得る。
双子葉植物に対する適用に関しては、双子葉植物種（例えば、タバコまたはシ
ロイヌナズナ（Arabidopsis））からより密接に関連したId相同物を最初に単離
し、そして上記のように（ジンクフィンガーDNA結合ドメイン以外の全ての配列
を除去することによって）ドミナントネガティブ誘導体を構築することが有利で
あり得る。この双子葉植物型のドミナントネガティブIdは、次いで全ての双子葉
植物に使用され得る。従って、広範囲の作物へのドミナントネガティブ技術の適
用は、各作物からId遺伝子をクローン化する必要なしに達成され得る。
任意の適切な技術を用いて本発明の核酸および構築物を導入し、花の誘導時期
の変化したトランスジェニック植物を作製し得る。トウモロコシのようなイネ科
植物に関しては、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（例えば、Sanfor
d，J．C.ら、米国特許第5,100,792号(1992)）が用いられ得る。この実施態様に
おいて、ヌクレオチド構築物またはこの構築物を含有するベクターは、小粒子上
に被覆され、次いで、高速弾道貫通（ballistic penetration）を介して標的組
織（細胞）中に導入される。ベクターは、ベクターが導入された植物細胞内で外
因性DNAを発現する任意のベクターであり得る。形質転換細胞は、次いで、植物
の再生に適切な条件下で培養され、トランスジェニック植物の産生をもたらす。
この構築物を保有するトランスジェニック植物は、種々の方法（適切な表現型マ
ーカー（例えば、抗生物質耐性または除草薬耐性）、または天然に存在する植物
と比較して花の誘導時期の視覚的な観察が含まれるが、これらに限定されない）
を用いて所望の表現型について試験される。
他の公知の方法には、Agrobacterium介在性形質転換(例えば、Smith，R.H.ら
、米国特許第5,164,310号(1992)を参照)、エレクトロポレーション(例えば、Cal
vin，N.、米国特許第5,098,843号(1992)を参照)、レーザービームを使用する導
入(例えば、Kasuya，T.ら、米国特許第5,013,660号(1991)を参照)、またはポリ
エチレングリコールのような薬剤を使用する導入(例えば、Golds,T.ら（1993）B
iotechnology，11:95-97を参照)などが含まれる。一般に、植物細胞は、種々の
ベクター(例えば、ウイルス性ベクター、エピソームベクター、Tiプラスミドベ
クターなど)を使用して周知の手順に従って形質転換され得る。核酸を植物細胞
に導入する方法は、本発明にとって重要なことではない。
転写開始領域は、構成的発現または調節された発現を提供し得る。植物におい
て機能的である多くのプロモーターが入手可能である。例示的なプロモーターに
は、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、カ
リフラワーモザイクウイルス(35S)プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイル
ス(FMV)プロモーター、熱ショックプロモーター、リブロース-1,6-ビスリン酸(R
UBP)カルボキシラーゼスモールサブユニット(ssu)、組織特異的プロモーターな
どが含まれる。調節領域は、物理的刺激(例えば、RUBPカルボキシラーゼssuを用
いる場合には、光)、分化シグナル、または代謝産物に対して反応性であり得る
。センス方向またはアンチセンス方向の発現の時間およびレベルは、産生される
表現型に対して明確な効果を有し得る。従って、選択されたプロモーターは、外
来DNAの方向と共同して、導入された遺伝子の効果を決定する。
本発明のトランスジェニック植物は、同一条件下で生長させる場合、花の誘導
が、前述の外来の核酸を含まない同じ品種の植物の花の誘導より早いように、花
の誘導時期を変化させる外来の核酸を含み得る。あるいは、トランスジェニック
植物は、同一の条件下で生長させる場合、花の誘導が、前述の外来の核酸を含ま
ない同じ品種の植物における花の誘導と比較して、遅延するかまたは阻害される
ように、花の誘導時期を変化させる外来の核酸を含む。
さらに、本発明は、開花誘導時期が変化したトランスジェニック植物を作製す
る方法を包含する。この方法は、植物細胞中に、植物におけるその存在が花の発
育の誘導時期の変化を生じる外来核酸を導入する工程、およびこの外来核酸を含
む植物細胞を、この植物細胞の生長に適切な条件下で維持し、それによって生殖
誘導時期が変化した植物を作製する工程、を包含する。この方法を適用し得る生
物には、被子植物(単子葉植物および双子葉植物)、裸子植物、胞子を有するまた
は栄養繁殖する植物、および藻類が含まれる。
Id組換え構築物を含むトランスジェニック植物は、形質転換された細胞、組織
または植物部分から、当業者に公知の方法によって再生され得る。植物部分は、
再生した植物を生じさせ得る植物の任意の部分を含むことが意図される。従って
、本発明は、１つの細胞または複数の細胞、組織(特に、***組織および/または
胚組織)、プロトプラスト、上胚軸、胚軸、子葉、子葉節(cotyledonary node)、
花
粉、胚珠、茎、根、葉などを包含する。植物はまた外植体からも再生され得る。
方法は、植物の種に従って変化する。
種子は、再生植物から、または再生植物と、同じ種の適切な植物との間での交
配から得られ得る。あるいは、植物は、植物部分を、そのような植物部分の再生
に適切な条件下で培養することによって、栄養繁殖させ得る。
単離および精製したIdあるいはidタンパク質またはポリペプチド、およびそれ
らのエピトープ性(epitopic)フラグメントは、Id調節の部位の位置決定(localiz
ation)のための抗体を調製するため、および植物における発育経路を解析するた
めに使用され得る。例えば、Idタンパク質に特異的に結合する抗体は、このタン
パク質がその植物の特定の細胞または組織において発現されるかどうか、および
いつ発現されるかを決定するために使用され得る。この情報は、Idが、開花を誘
導するため、および開花誘導経路を変化させるために、どのように作用するかを
決定するために使用され得る。
本発明の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、または抗体フラグメント
であり得、そして用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、お
よび抗体フラグメントを包含することが意図される。本発明の抗体は、単離され
たまたは組換えのIdあるいはidタンパク質またはポリペプチドに対して惹起され
得る。免疫抗原の調製および抗体産生は、任意の適切な技術を使用して実施され
得る。種々の方法が記載されている(例えば、Harlow,E.およびD.Lane（1988）An
tibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold
Spring Harbor，NY；Ausubelら（1994）Current Protocols in Molecular Biol
ogy，第２巻，第11章（追補27）John Wiley&Sons: New York，NYを参照)。
何らかの物理的または化学的手段によって、本発明の抗体は標識され得るか、
または一次抗体に結合する二次抗体が標識され得る。標識は、反応の際に紫外線
または可視光を吸収する生成物を放出する基質の添加によってアッセイされる酵
素であり得るか、または放射性物質、発色団、または蛍光色素であり得る。E.Ha
rlowおよびD.Lane(1988)前出。
本発明の単離されたポリペプチドもまた、タンパク質/タンパク質相互作用を
検出および分析するために使用され得る。この目的のための融合タンパク質は、
機能的なIdポリペプチドをコードするId DNAを、異なるポリペプチド(Idポリペ
プチドと関連もせず同質でもないポリペプチド)、例えば、タンパク質タグをコ
ードする異質DNAと融合させることによって調製され得る。得られる融合タンパ
ク質は、原核細胞(例えば、E.coli)中で調製され、単離され、標識され、そして
Id対立遺伝子の結合部位およびId/タンパク質相互作用を検出するために、抗体
と本質的に同様に使用され得る。RonおよびDressler（1992）Biotech 13:866-69
；SmithおよびJohnson（1988）Gene 67:31-40を参照。
温帯地方(temperate latitudes)に適応したトウモロコシ系統は、熱帯地方に
植えた場合、より短い日長(daylength)に起因して成熟するまえに開花する。成
熟前の開花は、重度の収穫量の減少を生じる。Salamini,F.(1985)Breeding Stra
tegies for Maize Production Improvement in the Tropics．Brandolini,A.お
よびSalamini,F.編、Food and Agriculture Organization of U.N.，Istituto A
gronomico Per L'Oltremare，Firenze，Italy。当業者は、クローン化Id遺伝子
がこの問題を解消するために使用され得ることを認識する。Id遺伝子が、弱いプ
ロモーターの制御下にアンチセンス方向に挿入されているトランスジェニックト
ウモロコシ植物が、作製され得る(図8A)。使用される弱いプロモーターは、発育
の間、少なくとも茎頂***組織において、構成的に活性であるべきである。Idは
非細胞自律性であるようにみえるので、プロモーターの作用部位の正確な詳細は
必要ない。この適用に有用な弱いプロモーターの例は、トウモロコシにおいて弱
構成的であることが示されている、T-DNAに由来する、ノパリンシンターゼ(nos)
プロモーターである。Callisら（1987）Genes Dev．1:1183-1200。別のプロモー
ターは、トウモロコシに由来するサイクリンプロモーターである。サイクリンは
、植物、動物、および酵母において見出された細胞***タンパク質である。植物
サイクリンの転写物は、***組織、および低レベルで増殖している細胞を有する
組織において発現されるが、他では発現されない。Renaudinら、(1994)PNAS 91:
7375-7379。サイクリンプロモーターは、出願人らの、サイクリン1bまたはサイ
クリンIIIの完全長cDNAクローンをプローブとして使用して、標準的な単離およ
びクローニング技術を用いて、トウモロコシのゲノムライブラリーから隣接する
上流ゲノム配列を取り出すことによって容易に単離される。Sambrookら、前出；
Fr
eelingおよびWalbot、前出を参照。当業者は、本発明によって包含されることを
意図される、本発明のこの実施態様を実施するために必要な特性を有する他の弱
いプロモーターを認識する。
上記の適用に有用な構築物の例は図8Aに例示される。Id遺伝子のためのcDNAは
、プロモーターの下流に、アンチセンス方向で連結される。ADH1イントロンはRN
A安定性のために必要とされ、そしてnos遺伝子の3'末端が、効率的なポリアデニ
ル化を保証するために付加される。Callisら、(1987)前出。DNAが、上記のよう
な標準的な方法によって、除草剤Bastaに対する耐性のためのbar遺伝子を形質転
換マーカーとして用いて、トウモロコシ植物中に導入される。Gordon-Kammら(19
90)Plant Cell 2:603-618；FreelingおよびWalbot(1993)前出。
外来DNAが導入された植物細胞において外来DNAを発現させる任意の構築物また
はベクター(例えば、35Sプロモーターを有するpMON530ベクター)が使用され得る
。本発明の別の有用なベクターまたは構築物は、早期に開花する品種において、
開花を遅延させるために、アンチセンス方向でpMON530ベクター中に弱いプロモ
ーターの下流に挿入された、Idタンパク質をコードする外来DNAである。
同様な構築物は、他の穀物(例えば、イネ、オオムギ、および他の単子葉作物)
に使用され得る。アンチセンス適用のために、まず、改変される種から同質なcD
NAを単離する必要があるかもしれない。トウモロコシIdクローンを、この目的の
ためのプローブとして使用して、他の穀物種のcDNAライブラリーからId相同物を
スクリーニングし得ることが認識される。次いで、操作される種についてId相同
物は、図8Aの構築物のトウモロコシId遺伝子の置換物として挿入され得る。
同じ技術は同様に双子葉植物にも拡張され得る。これらの作物のいくつかの開
花時期を遅延させることは、トウモロコシに関して記述した利点と同様な利点、
すなわち、果実および種子のより高い収穫を生じるより長い栄養成長期間を生じ
得る。GottschalkおよびWolff（1983）Induced Mutations in Plant Breeding，
Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg。さらに、いくつかの双子葉植物は、主
に栄養成長の産物が有益であり(例えば、ホウレン草、タバコなど)、そして、こ
れらの植物において、栄養成長の延長は、産物のより高くそしてより効率的な収
穫を生じる。アンチセンス構築物は、これらの種から単離されたId相同物を使用
して、図8Bに示されるように設計され得、そしてトランスジェニック植物は、T-
DNA形質転換によって作製され得る(好ましくは、Agrobacterium形質転換技術を
使用するが、他の標準的な技術による形質転換もまた使用される)。Lycett,G.W.
およびD.Grierson（1990）Genetic Engineering of Crop Plants，Butterworths
, London；Setlow,J.K.(1994)Genetic Engineering Principles and Methods、
第16巻、Plenum Press，New York。
熱帯地方に適応しているトウモロコシ品種は、温帯地方で生育させた場合、極
端に遅く開花し(Salamini、前出)、開花時に15〜20フィートの高さに達し、(平
均的な温帯品種についての約20葉と比較して)30葉を有する。このことは、取り
扱いおよび収穫に不便であるだけでなく、植物が遅霜(late season frost)の害
を受けやすくする。これらの植物において早期の開花を誘導するためのストラテ
ジーは、クローン化Id遺伝子をセンス方向で構成的プロモーター(図9A)の下に挿
入することによって、これらの品種の栄養発育において、早期にこの遺伝子を発
現させることである。強いプロモーターまたは弱いプロモーター(例えば、CaMV3
5S(強い)プロモーターまたはnos(弱い)プロモーター)を使用し得、これら両方と
もトウモロコシにおいて機能する。Callisら(1987)前出。この目的のための構築
物および形質転換方法は、Id遺伝子の方向を除いて、上記のアンチセンス適用に
おいて使用した構築物および形質転換方法と同様である。
この技術を、一般的に同じ構築物または原則として同様である構築物を使用し
て、他の穀物種のためおよび単子葉植物のために適応させ得ることは、認識され
る。事実、Idの相同物は、早期発現のために必要とされないかもしれない。なぜ
なら、トウモロコシId遺伝子産物が、他の単子葉植物(穀物を含む)において適切
に機能して早期の開花を促進し得るからである。
本発明の別の実施態様において、双子葉植物の早期の開花は、標的植物または
植物細胞を、トウモロコシId遺伝子産物またはId相同物で形質転換することによ
って提供され得る。トウモロコシ遺伝子は、双子葉植物において効率的に機能す
ることが示されているので、相同遺伝子を、形質転換する種から単離する必要は
ないかもしれない。例えば、トウモロコシＲおよびＣ遺伝子は、CaMV 35Sプロモ
ーターの制御下で発現させる場合、双子葉Arabidopsisにおいて機能する。Lloyd
ら（1992）Science 258:1773-1775。図9Bに示された構築物は、双子葉植物にお
けるId遺伝子または相同物の発現のために使用され得、そしてT-DNA形質転換ま
たは他の標準的な技術(例えば、すでに記載した技術)を用いて挿入され得る。
干ばつストレスは、植物に対する傷害のため、収穫の重度の減少を引き起こし
得る。さらに、開花時期も影響され得る。ストレスを受けた場合、多くの植物が
、成熟前に開花する。トウモロコシにおいて、干ばつストレスは、雌穂よりずっ
と早期に雄穂の発育を生じ、収穫の減少または無収穫を生じ得る。これらの問題
のいくつかは、植物の開花時期全体が干ばつの期間の間遅延されると、軽減され
得る。この遅延は、植物が通常より長い期間栄養的に生長することを可能にし得
る。従って、植物は開花する前に干ばつの傷害から回復し得る。Id遺伝子は、そ
れが植物中に前述のようにアンチセンス方向ではあるが、構成的プロモーターに
代えて干ばつ誘導性プロモーターと組み合わせて導入されるならば、この目的に
使用され得る。任意の干ばつ誘導性プロモーターが使用され得る。例えば、RAB-
17遺伝子のプロモーター(これは、干ばつおよび他のストレスによって、おそら
く植物ホルモンABAによる調節の結果として誘導される)が使用され得る。Vilard
ellら（1990）Plant Mol.Biol．14:423-432。使用され得る第２のタイプのプロ
モーターは、トウモロコシhsp70熱ショックプロモーター(これは37℃〜42℃の高
温に応答して誘導される)である。Callisら（1988）Plant Physiol．88:965-968
。
環境効果に対して応答性の植物を作製するに有用なベクターまたは構築物は、
Idタンパク質をコードする外来DNAを、アンチセンス方向で、pMON530ベクター中
に、干ばつ誘導性プロモーターの下流に挿入して、干ばつに応答して開花を遅延
させることによって作製される。この目的のためのいくつかの構築物を図10Aに
示す。
また、この技術は、図10Aと同じ構築物または同様な構築物を用いるが、必要
であれば、形質転換される特定の穀物についてのId遺伝子の相同物を使用して、
一般に、単子葉植物(他の穀物を含む)に拡張され得る。
この技術の双子葉作物への拡張は、双子葉植物において機能する、適切な干ば
つ誘導性プロモーターを使用して実施され得る。Arabidopsis Atmyb2のプロモー
ターは、一般的なABA反応性で干ばつおよびストレスに誘導性のプロモーターと
して使用され得る。Uraoら（1993）Plant Cell 5:1529-1539。大豆熱ショックプ
ロモーターもまた使用され得る。Schofflら（1989）Mol.Gen.Genet．217:246-25
3。このようなプロモーターを含む構築物を図10Bに示す。この適用はアンチセン
ス発現に依存するので、トウモロコシId遺伝子よりむしろ、操作されるべき作物
種由来のId遺伝子の相同物を使用する必要があり得る。
開花を完全に欠くトウモロコシ植物(すなわち、ノックアウト(knock out)トウ
モロコシ植物)は特別な使用法である。開花しないトウモロコシ植物は、栄養的
に生育し続け、サイレージ目的に収穫され得る大きな生物量を生じる。しかし、
Id遺伝子がサイレージを産生する目的のために完全にノックアウトされると、ト
ランスジェニック植物は決して開花せず、そしてハイブリッド種子を産生し得な
い。
トランスジェニックコーンのハイブリッド種子を作製するための本発明の１つ
の方法は、アンチセンス方向ではあるが、GAL4結合部位と呼ばれる調節配列の制
御下にId遺伝子を有するトランスジェニック植物を作製することである。その結
果、アンチセンスId遺伝子は、GAL4タンパク質が存在しないと発現しない。GAL4
は酵母由来の転写因子であり、これはタバコのような植物(Ma,J.ら(1988)Nature
334:631-633)およびコーン(McCarty,D.ら(1991)Cell 66:895-905)において作動
することが示されている。これは、プロモーターにGAL4結合部位を含む遺伝子の
転写を活性化する。
この実施態様において、サイレントなアンチセンスId遺伝子およびGAL4結合部
位を含むトランスジェニック同系交配体(inbred)は、GAL4遺伝子を、弱いプロモ
ーター下(低緯度におけるコーンの生長のために開花を遅延させるため)または強
いプロモーター下(サイレージ産生のために開花をなくすため)のいずれかで構成
的に発現する別のトランスジェニック同系交配体と交配される。それぞれの同系
交配体は正常に開花する。しかし、ハイブリッドはアンチセンスIdを発現し、そ
して開花は、GAL4遺伝子を駆動させるために使用されるプロモーターに依存して
、遅延されるかまたはなくなる。同様な改変は、適切なId相同物を使用して他の
植物(単子葉植物または双子葉植物のいずれも)についてもなされ得る。
GAL4結合部位を使用する構築物を図11A、11B、11Cおよび11Dに示す。このよう
に、トウモロコシにおいて、図11Aに示される構築物を含む同系交配体は、図11C
の構築物を含む同系交配体と交配される。得られるハイブリッドにおいて、GAL4
遺伝子がCaMV35S(P35s)の制御下にある場合、開花は遅延する。しかし、GAL4遺
伝子がnos(Pnos)またはcyclin(Pcyclin)プロモーターの制御下にある場合、ハイ
ブリッドにおいて、開花は僅かに遅延するのみである。双子葉植物において、図
11Cに示される構築物を含む植物を、図11Dに示される構築物を含む植物とを交配
させることによって、同様な結果が得られる。
上記の適用はアンチセンスId構築物の使用の例示である。任意の適切な構築物
(例えば、ドミナントネガティブ型のId遺伝子)は、本発明の方法を実施するため
に、アンチセンス構築物と置換され得ることが当業者によって認識される。
Id遺伝子はトウモロコシから単離されたが、Idの相同物が他の穀類(grain cro
ps)に存在する可能性があり、そして他のすべての植物に存在する可能性が最も
高い。本出願人らは、配列相同性によって決定されるように、Idの近相対物(clo
se relative)が双子葉植物にも存在する最初の証拠を有する。他の種におけるこ
れらの相同物もまた開花時期の制御に重要であれば、多くの農業的に重要な穀類
の開花時期の操作が可能になる。本明細書中に記載した組成物および方法を使用
して、当業者は、他の穀類(例えば、モロコシ、ライムギ、コムギなど)および他
の商業的に重要な植物の再生産期の開始を変化させるために、公知の手順を使用
し得る。
例えば、開花時期の改変は、果実の熟成の時期、花の生産(production)の時期
、種子のサイズおよび質、品種が生長し得る緯度などに影響を及ぼすために使用
され得る。開花時期は、開花が同じ植物の異なる部分で異なる時期に開始される
ように調節され得る。本発明はまた、トウモロコシとモロコシとのハイブリッド
の作成において雄穂除去の必要性を排除するための手段を提供する。Idは細胞自
律様式で作用しないようにみえるが、Idシグナルは植物の特定の領域に局在し、
そして従って、その植物のいくつかの領域でIdが転写されるかまたはId mRNAが
活性化されて、これらの領域のそれぞれにおいて花の発育を誘導しなければなら
ないようであり得る。コーンおよびモロコシは共に、植物の先端(頂端)に雄花器
官(雄穂)を生じる。雌花器官は葉腋の下部に生じる。Id遺伝子が結合した組織特
異
的または他の選択的プロモーターの使用を通じて、植物の他の部分において雌性
生殖器官の生殖的発育を選択的に誘導しながら、その植物の先端において花粉の
産生を阻害または防止することが可能である。あるいは、正常な花の誘導後、雄
性生殖器官の発育が阻害され得、または花粉産生組織もしくは細胞が、Idアンチ
センス産生と花粉産生に特異的な細胞(例えば、絨毯細胞)の形成とを組み合せる
ことによって、栄養期に逆戻りするように誘導され得る。
本技術の別の適用は、葉として収穫される作物(例えば、レタス、キャベツ、
ホウレン草、トウモロコシ)の栄養期を増大させる(そして従って、産生される葉
の数を増大させる)こと、およびそれによって開花を遅延させることによりこれ
らの農作物の収穫を増大させることである。従って、任意の植物(被子植物、裸
子植物、単子葉植物、および双子葉植物を含む)が本発明に従って使用され得る
。目的の植物には、穀物(例えば、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、モロコシ
、ライコムギなど)；他の商業的に有益な作物(ヒマワリ、大豆、サフラワー、キ
ャノーラ(canola)など)；果物(例えば、アプリコット、オレンジ、リンゴ、アボ
カドなど)；蔬菜(例えば、ニンジン、レタス、トマト、ブロッコリーなど)；樹
木種(woody species)(例えば、ポプラ、マツ、オークなど)；および鑑賞用の花(
例えば、クレマチス、バラ、キク、チューリップなど)が含まれる。
以下の実施例は、本発明を例示するためおよびId遺伝子を単離および同定する
ために使用される方法の記載を提供するために、本発明の特定の局面を記載する
。実施例は、いかなる方法でも、本発明の限定として解釈されるべきではない。
材料および方法に対する本出願中のすべての引用文献は、本明細書で参考とし
て援用される。
実施例１ トランスポゾンタギング：
植物を、通常の圃場条件下で、Uplands Farm Agricultural Field Station(Co
ld Spring Harbor Laboratory)において、1989年夏から1994夏にかけて生育させ
た。標準的なトウモロコシの遺伝子技術を、すべての交配および解析手順で使用
した。Freeling,MおよびWalbot,V.(1993)The Maize Handbook，Springer-Verla
g，New York；Gottschalk,W.およびWolff,G.(1983)Induced Mutations in Plant
Breeding，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg。
Id遺伝子は、第１染色体上の穀粒色素形成遺伝子(Bz2)付近にマッピングされ
る。Bz2遺伝子の変異可能な対立遺伝子(bz2-m2)は、この遺伝子座でのDs2トラン
スポゾンの挿入の結果である(Doonerら(1985)Mol.Gen.Genetics 200:240-246)。
(Ds2は、転位因子Ac/Dsファミリーの欠損誘導体であり、そしてトランスポザー
ゼを提供するAc因子の存在下でのみ転位され得る。)Idがbz2-m2に近接している
こと、およびAc/Ds因子が連結された部位に優先的に転位するという事実を利用
して、本出願人らは、bz2-m2集団中の胚復帰変異体からid変異体について選択し
た。すなわち、Ds2因子の胚摘出(すなわち、bz2-m2からBz2へ)から生じた、完全
に紫色の穀粒について選択することによって、Ds2因子が別の場所に挿入されて
いるF1集団を作成した。これらの復帰変異体のF2集団から、１つのid変異体を検
査した600ファミリーから単離し、そしてid★と名付けた。id★とidの公知の対
立遺伝子(例えば、id-R)との交配は、これが第１染色体上のid変異と対立するこ
とを確認した。
実施例２ DNA 解析：
すべての分子生物学的手順を、本質的にSambrook,J.ら(1989)Molecular Cloni
ng-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring
Harbor，New York)に記載のとおりに実行した。トウモロコシDNAおよびRNAの解
析のための方法を、Freeling，M.およびWalbot,V.(1993)前出に従って行った。
サザンブロット解析のために、葉から抽出した２〜４mgのトウモロコシDNAを
、SacIを用いて制限し、そして１％アガロースゲル上で電気泳動させてニトロセ
ルロースメンブレンに移した。Ds2プロービングのために、Ds2トランスポゾンの
内部108bpフラグメントを、Ds2のこの部分を有するプラスミドから単離し、そし
て制限酵素BamHIおよびEcoRIを用いて切断した。このフラグメントを低融点アガ
ロースゲルから精製し、そして放射性同位体含有ヌクレオチド(32P-dATPおよび3
2P-dGTP)を、Boehringer-Mannheim製のキットを使用するランダムプライム標識(
ra
ndom primed labeling)によって、このフラグメントに組み込んだ。標識された
フラグメントを使用して、10％デキストラン硫酸を含む標準ホルムアミドハイブ
リダイゼーション溶液を用いてサザンブロットをプローブした。
Ds2にハイブリダイズする4.2kbのSacIフラグメントを単離するために、単一の
植物に由来する100mgのDNAをSacIで消化し、そして１％低融点アガロースゲル上
で電気泳動させた。ゲルの４kbと５kbとの間の領域(サイドマーカーによってマ
ークされる)をゲルから切り出し、そしてこのフラグメント内に含まれるDNAを精
製した。DNAをプラスミドベクターpLITMUS29(New England Biolabs)中に連結し
た(T4 DNAリガーゼ、New England Biolabs)。このプラスミドベクターは、自己
連結を防止するために、SacIで切断され、かつホスファターゼ(小エビアルカリ
ホスファターゼ、U.S.Biochemical)処理されて５'リン酸基を取り除かれていた
。組換えプラスミドを、エレクトロポレーションによってE.coli DH10B細胞中に
形質転換し、そして100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天プレートに播種した
。約60,000のアンピシリン耐性コロニーをプレート上で増殖させ、次いでレプリ
カをニトロセルロースメンブレンに移した。フィルター上のコロニーを溶解し、
そしてそれらのDNAをメンブレンに固定した。どのコロニーが、Ds2因子にハイブ
リダイズする組み換えプラスミドを有するかを決定するために、フィルターを標
識したDs2フラグメントプローブでプローブした(Hakeら(1989)EMBO J.，8:15-22
)。スクリーニングした60,000のコロニーからの１つのコロニーが、Ds2因子を有
するプラスミドを有することを見出した。この組換えプラスミドの制限分析によ
り、1.3kbのDs2因子の一方の側の約2.9kbのゲノムDNAおよび他方の側の165bpの
ゲノムDNAが明らかにされた。隣接するDNAの部分の配列解析を、プラスミドベク
ター内でかつDs2因子自体内の配列にハイブリダイズするプライマーを使用する
ことによって実施した。ジデオキシ鎖終結配列決定法を使用して二本鎖プラスミ
ドDNAを配列決定した。
実施例３ RNA 解析：
種々のトウモロコシ組織由来のポリＡ RNAノーザンブロット分析を、Ds2因子
の右側の165bpのゲノムDNA領域をプローブとして使用して実施した。RNAを、頂
端***組織(若い葉および古い葉、ならびに根端)から抽出し、そしてそれぞれの
サンプル由来の１μgの各ポリA+ mRNAを、ホルムアルデヒドを含む1.1％アガロ
ースゲル上で電気泳動させ、次いでGenescreenナイロンメンブレンに移した。16
5bpフラグメントを上記のように標識し、そしてブロットをプローブするために
使用した。
実施例４ 単離されたゲノムクローン由来のId遺伝子配列の決定：
ゲノムクローンを、Sambrookら(前出)に記載のように、ジデオキシ法により配
列決定した。使用したストラテジーを「プライマーウォーキング」と呼んだ。プ
ラスミドベクターにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用し
て、このフラグメントの末端部についての最初の配列データを得た。次いで、こ
の配列データを使用して配列決定した領域内の新たなプライマーを合成した。こ
のプライマーは、フラグメント全体を配列決定するまでの繰り返しプロセスにお
けるゲノムクローンのさらなる配列決定を可能にした。約200〜350bpの配列を各
プライマーから読み取った。
実施例５ 他の植物種由来の調節遺伝子の同定および単離：
他の種の植物における調節遺伝子(Id遺伝子と相同である)を同定および単離す
るために、Id ORFまたはId遺伝子の別のフラグメントをコードするDNA配列を、
プローブとして使用して、調節遺伝子を発現する組織に由来するmRNAから作成し
た植物cDNAライブラリーをスクリーニングした(Sambrookら(1989)前出；Freelin
gおよびWalbot(1993)前出)。種苗および未成熟の花房組織に由来するmRNAから構
築されたcDNAライブラリーは、これらの遺伝子を含む可能性が特に高い。トウモ
ロコシ由来の同様なライブラリーが、本出願人らによって、トウモロコシの細胞
***サイクル遺伝子(例えば、cdc2(Colasantiら(1991)PNAS，88:3377-3381)およ
びサイクリン(Renaudinら(1994)PNAS，91:7375-7379))のcDNAクローンを、こ
れら遺伝子用の短いDNAプローブを使用することによって得るために使用された
。放射活性プローブとハイブリダイズするクローンを同定および単離し、そして
配列解析をSambrookら(前出)に記載のような標準的な方法によって実施する。均等物
当業者は、本明細書に具体的に記載した本発明の特定の実施例と均等な多くも
のを認識するか、または通常の実験のみを使用して確かめ得る。このような均等
物は以下の請求の範囲に包含されることを意図される。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566
// Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ