CN104099319A - 南方红豆杉ssr-pcr反应体系及其应用 - Google Patents
南方红豆杉ssr-pcr反应体系及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多个水平上进行优化试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR 20μL最佳反应体系：引物2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA 75ng。该体系的建立能很好地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分析奠定了一定基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用。
背景技术
南方红豆杉（Taxus chinensis var.mairei）为裸子植物亚门（Cymmospermai）松杉纲（Coniferopside）红豆杉目（Taxales）红豆杉科（Taxaceae S.F.Gery）红豆杉属（Taxus Linn.）植物，是中国红豆杉属植物中分布最为广泛的一个种,自然分布于亚热带各省区。红豆杉树皮中因含有抗癌药物成分紫杉醇导致其被大量砍伐或破坏，现已处于濒危状态，在1999年我国国务院公布的《国家重点保护植物名录（第一批）》中被列为国家一级保护植物。南方红豆杉材质优异，是高档珍贵用材，其紫杉醇含量虽稍低于喜马拉雅红豆杉等，但因早期速生、生物收获量大，适宜短周期作业而具有巨大的药用开发利用价值。
SSR（简单重复序列，又称微卫星DNA，Simple Sequence Repeats或Microsatellite DNAs）标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记在鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享；且操作简便、稳定性、重复性好。已成为目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。
因此，建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供优化的南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，所述反应体系总体积20uL，其中，上、下游引物各2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA 75ng，以ddH2O配制。
其中，上游引物F：5′-TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3′；下游引物R：5′-CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3′。
PCR扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，35个循环；60℃ 30min。
其中，模板DNA的提取包括以下步骤：
（1）取-70℃保存的南方红豆杉嫩叶0.5～1g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末；
（2）将粉末快速转移到2mL离心管中，加入1mL 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30～45min。其间不时摇动离心管使之混匀；
（3）取出离心管，4℃ 12000rpm离心10min，取上清到新离心管中；
（4）加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（即Tris平衡酚、氯仿和异戊醇混合液，其中，Tris平衡酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1）轻轻地颠倒混匀，放置10min，4℃ 12000rpm离心10min；
（5）重复步骤（4）；
（6）吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，混匀，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；
（7）4℃ 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500μL去离子水和2μL RNase溶解DNA，并于37℃水浴30min-1h；
（8）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇（即氯仿和异戊醇的混合液，二者体积比为24：1）抽提一次；
（9）沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50μL去离子水；
（10）1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，-20℃保存。
本发明还提供所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种中的应用。
本发明建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多个水平上进行优化试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR 20μL最佳反应体系：引物2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA75ng。该体系的建立能很好地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分析奠定了一定基础。
通过建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等奠定基础，为开展植物分子辅助育种、遗传转化及其转基因等方面的研究提供有价值的理论依据，从而为科学制定南方红豆杉遗传保育策略及种质资源利用提供分子遗传学数据。
附图说明
图1为本发明提取样品的总DNA检测结果；其中，M为DL15000DNA Marker：从上到下分别为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp，1-93泳道为样本。
图2为本发明引物浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，M为DNA Marker，1～5引物浓度分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μM。
图3为本发明dNTPs浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，M为DNA Marker，1～5dNTPs浓度分别为10、20、30、40、50μM。
图4为本发明Taq DNA聚合酶浓度对SSR-PCR扩增结果；其中，M为DNA Marker，1～5Taq DNA聚合酶浓度分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0U。
图5为本发明对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，M为DNAMarker，1～5Mg2+浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5U。
图6为本发明模板DNA浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，M为DNA Marker，1～5模板DNA浓度分别为65、70、75、80、85ng。
图7为本发明SSR-PCR引物对南方红豆杉的个体扩增结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例 南方红豆杉SSR-PCR反应体系的优化
1 材料与方法
1.1 样品材料
由中国林业科学研究院林业研究所邱德有教授提供的南方红豆杉作为优化实验材料。
1.2 基因组DNA的提取
用改良CTAB法提取基因组DNA。提取的总DNA用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，结果如图1所述。核酸蛋白分析仪Nanodrop8000测定结果显示，A260/A280值位于1.7-1.9之间。结果表明，用改良的CTAB方法提取，能够得到高质量的DNA，可直接用于SSR-PCR反应。
其中，模板DNA的提取包括以下步骤：
（1）取-70℃保存的南方红豆杉嫩叶0.5～1g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末；
（2）将粉末快速转移到2mL离心管中，加入1mL 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30～45min。其间不时摇动离心管使之混匀；
（3）取出离心管，4℃ 12000rpm离心10min，取上清到新离心管中；
（4）加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（体积比25：24：1）轻轻地颠倒混匀，放置10min，4℃ 12000rpm离心10min；
（5）重复步骤（4）；
（6）吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，混匀，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；
（7）4℃ 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500μL去离子水和2μL RNase溶解DNA，并于37℃水浴30min-1h；
（8）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇（体积比24：1）抽提一次；
（9）沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50μL去离子水；
（10）1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，-20℃保存。
1.3 SSR-PCR程序
PCR反应在GeneAmp 9600 PCR仪上进行。PCR反应扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，56℃复性45s，72℃延伸45s，进行35个循环，最后60℃延伸30min。
1.4 SSR-PCR体系
为得到扩增稳定可靠、重复性好的SSR-PCR反应体系，对影响PCR的5个主要因素（模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和引物）分别进行了单因子多水平的优化实验。SSR-PCR反应的主要因素水平见表1。
表1 SRAP-PCR反应的因素与水平
注：引物分别指上、下游引物。
其中，上游引物F：5′-TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3′；下游引物R：5′-CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3′。
1.5 SSR扩增产物的电泳检测
扩增产物加1μL上样缓冲液混匀后，取1.5μL用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE。180V电泳1.5h，电泳结束后银染，拍照观察。
2 结果
2.1 引物浓度对SSR扩增结果的影响
要获得扩增清晰的特异性条带，引物的选择及用量很重要。引物用量小，与模板DNA结合效率低，产物产量会受到影响；引物浓度大，非特异性结合的机率增加，引物之间形成引物二聚体的概率也会增加，引物也会和Taq DNA聚合酶竞争与Mg2+结合的机率。由图2可以看出，当引物浓度为1.5μM时，扩出的条带几乎没有；浓度为2.0～2.5μM时，都能扩出特征带，以2.0和2.5μM扩增清晰，但随着引物浓度的增大条带逐渐减弱。当引物浓度为3.0μM时，没有条带扩出。考虑引物浓度过高会增加引物二聚体的形成几率，故选择2μM为引物的最适浓度。
2.2 dNTPs浓度对SSR扩增结果的影响
dNTPs是PCR扩增反应的原料，为PCR中Taq DNA聚合酶提供底物，使得产物得以延伸。dNTPs浓度过低时，扩增产物减少；浓度过高时，会增加错误率，同时会与Taq DNA聚合酶竞Mg2+，使反应体系中的Mg2+总量下降，从而抑制Taq DNA聚合酶的活性，影响PCR效率，甚至会阻止反应进行。由图3可以看出，dNTPs浓度在10～40μM之间时，随着dNTPs浓度的增加，扩增条带由弱到强，主带也明显增多；浓度的升高到50μM时，由于一部分dNTPs竞争了Mg2+而使Taq DNA聚合酶活性下降，扩增产物量下降，出现条带缺失现象。因此确定40μM为dNTPs最适浓度。
2.3 Taq DNA聚合酶浓度对SSR扩增结果的影响
Taq DNA聚合酶（简称Taq酶）浓度过大会造成浪费，并且会导致非特异性扩增；浓度过小会影响扩增效率，降低扩增产物的产量。Taq DNA聚合酶在PCR中的用量还会受反应体积、酶活性、酶耐热性等诸多因素的影响。在本试验中，当Taq DNA聚合酶用量为0.1和0.25U时，几乎没有扩增条带；当Taq DNA聚合酶用量达到0.5U或以上时，扩增条带较多且清晰，差异不大（图4）。出于节约试验成本的考虑，将0.5U确定为Taq DNA聚合酶的适宜用量。
2.4 Mg2+浓度对SSR扩增结果的影响
Mg2+浓度可直接影响SRAP扩增条带的强弱。它不仅影响酶的活性及合成的真实性，而且影响引物的退火、模板和中间产物的解离温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。Mg2+是Taq酶的激活剂，Mg2+不足时，Taq酶的作用效率降低，且dNTP竞争Mg2+。Mg2+受dNTP总量的影响。由图5可以看出，Mg2+浓度为0.5U时，无扩增产物；当Mg2+浓度为1.0～1.5U时，扩增条带清晰；Mg2+浓度达到2.5～3.0U时，扩增条带变少且模糊；以1.0U扩增效果最好，因此Mg2+最适浓度为1.0U。
2.5 模板DNA浓度对SSR扩增结果的影响
模板DNA浓度对PCR扩增有很重要的影响，它的用量关系着产物的产量和特异性。模板DNA浓度过低，扩增产物无或不稳定；浓度过高，产生重带。由图6可以看出，在模板DNA浓度为65～70ng时条带较弱或几乎没有；在75～80ng时可得到一致且清晰的扩增条带，因此模板DNA浓度在75～80ng时均可；当模板浓度增加到85ng时条带反而减弱。考虑到模板浓度过高会相应增加非特异性条带的扩增，因此，选择75ng为PCR扩增时的模板浓度。
2.6 南方红豆杉SSR-PCR反应体系的建立及群体检测
根据以上实验结果确立了南方红豆杉SSR-PCR反应体系：反应总体积20μL中，引物2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA 75ng。采用该体系筛选出SSR引物。扩增结果如图7所示，扩增条带清晰。
SSR-PCR扩增体系中模板DNA、Mg2+、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等各组分的用量均会影响扩增结果。本发明在优化SRAP扩增体系时发现，引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶作为PCR扩增的原料，有一个相对适宜的用量范围，浓度过低，不能满足扩增要求；浓度过高，组分间可能会产生竞争，影响扩增效果。本发明建立的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等奠定基础，为开展植物分子辅助育种、遗传转化及其转基因等方面的研究提供有价值的理论依据，从而为科学制定南方红豆杉遗传保育策略及种质资源利用提供分子遗传学数据。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.南方红豆杉SSR-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积20uL，其中，上、下游引物各2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA 75ng，以ddH2O配制；
其中，上游引物F：5′-TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3′；下游引物R：5′-CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3′。
2.根据权利要求1所述的SSR-PCR反应体系，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，35个循环；60℃ 30min。
3.根据权利要求1或2所述的SSR-PCR反应体系，其特征在于，模板DNA的提取包括以下步骤：
（1）取-70℃保存的南方红豆杉嫩叶0.5～1g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末；
（2）将粉末快速转移到2mL离心管中，加入1mL 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30～45min。其间不时摇动离心管使之混匀；
（3）取出离心管，4℃ 12000rpm离心10min，取上清到新离心管中；
（4）加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇轻轻地颠倒混匀，放置10min，4℃ 12000rpm离心10min；其中，Tris平衡酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；
（5）重复步骤（4）；
（6）吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，混匀，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；
（7）4℃ 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500μL去离子水和2μL RNase溶解DNA，并于37℃水浴30min-1h；
（8）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一次；其中，氯仿、异戊醇的体积比为24：1；
（9）沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50μL去离子水；
（10）1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，-20℃保存。
4.权利要求1-3任一项所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种中的应用。
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| CN104371998A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-02-25 | 福建省农业科学院甘蔗研究所 | 用于苦瓜杂交种纯度分子鉴定的dna提取方法 |
| CN105177151A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-23 | 中南林业科技大学 | 一种鉴别红豆杉种的dna条形码引物对、试剂盒及方法 |
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